Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

W tej cząsteczce wprowadzamy platformę rekonstytucji in vitro, która naśladuje środowisko lipidowe wewnętrznej błony mitochondriów. Platforma ta może być wykorzystana do badania mechanizmów molekularnych fuzji wewnętrznej błony mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościowe badanie integralnych białek błonowych i białek związanych z błoną w środowisku zbliżonym do natywnego.

Na początek wymieszaj roztwory A i B zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie wygeneruj mieszaninę lipidów, dodając obliczoną objętość roztworu do przechowywania do bursztynowych fiolek za pomocą szklanej strzykawki. Dopasuj ostateczną objętość, dodając dodatkowy chloroform do fiolek. Piecz szkiełka mikroskopowe w temperaturze 520 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po upieczeniu schłodzić je do temperatury pokojowej. Dodaj około 10 gramów wodorotlenku sodu do 500 mililitrów metanolu, mieszając. Mieszaj przez dwie godziny, kontynuując dodawanie wodorotlenku sodu do roztworu, aż zacznie pojawiać się osad.

Wyczyść szkiełka w 10% roztworze dodecylosiarczanu sodu, metanolu nasyconym wodorotlenkiem sodu i 50 milimolowym kwasem solnym, kolejno kąpać sonikując szkiełka w każdych warunkach przez 30 minut. Czyść szkiełka w ultraczystej wodzie przez 10 minut między każdym warunkiem. Oczyszczoną szklankę nakrywkową należy przechowywać szczelnie zamkniętą w roztworze kwasu solnego przez okres do dwóch tygodni, aby zapewnić dobrą jakość dwuwarstwową.

Wyczyść koryto z politetrafluoroetylenu systemu zanurzania Langmuir-Blodgett za pomocą chloroformu i ultraczystej wody, aż nie zaobserwuje się zwilżania. Rozpyl chloroform na powierzchnię koryta i dokładnie przetrzyj go trzykrotnie chusteczkami celulozowymi, a następnie spłucz trzykrotnie ultraczystą wodą i usuń wodę przez odsysanie. Po zakończeniu przykryj powierzchnię koryta czystą, ultraczystą wodą.

Weź dwa kawałki szkła nakrywkowego poddanego obróbce powierzchniowej z roztworu czyszczącego i płucz je ultraczystą wodą przez około 30 sekund. Umieść szkło nakrywkowe w pozycji tyłem do siebie za pomocą podłoża clamp do przytrzymania szkiełek podstawowych. Zanurz szklaną zjeżdżalnię pod powierzchnią wody, ręcznie klikając dipper w dół na systemie sterowania Langmuir.

Wyzeruj równowagę folii i ostrożnie rozprowadź roztwór B kropla po kropli na granicy faz powietrze-woda. Upewnij się, że lipidy rozprzestrzeniają się tylko na granicy faz powietrze-woda, bez kropelek chloroformu i lipidów opadających na dno powierzchni politetrafluoroetylenu, co utworzy kanał lipidowy i zapobiegnie tworzeniu się monowarstwy. Przestań dodawać lipidy, gdy odczyt balansu filmu wynosi około 15 do 20 miliniutonów na metr.

Odczekaj od 10 do 15 minut, a następnie zainicjuj kontroler bariery, aby zmienić powierzchnię, klikając przycisk Rozpocznij eksperyment. Poczekaj, aż odczyt balansu filmu wzrośnie do 37 miliniutonów na metr i utrzymuj ciśnienie przez około 20 do 30 minut. Podnieś szkło nakrywkowe z prędkością 22 milimetrów na minutę, utrzymując napięcie powierzchniowe na poziomie 37 miliniutonów na metr.

Monowarstwa lipidowa z wiązaniem polimerowym zostanie przeniesiona z granicy faz powietrze-woda na powierzchnię szkła nakrywkowego w procesie zanurzania Blodgett, tworząc dolną ulotkę dwuwarstwy lipidowej. Oczyść interfejs powietrze-woda przez ssanie i spłucz koryto ultraczystą wodą. Po oczyszczeniu szkiełka szklanego z jednym dołkiem chloroformem, etanolem i wodą ultraczystą, umieść go na korycie pod warstwą wody.

Upewnij się, że studnia jest skierowana do góry w kierunku granicy faz powietrze-woda i wlej świeżą, ultraczystą wodę, aż szklane szkiełko zostanie całkowicie zakryte, a następnie zanurz szklane szkiełko pod powierzchnią wody, jak opisano wcześniej. Przytrzymaj szkło nakrywkowe z monowarstwą lipidową za pomocą silikonowej przyssawki i delikatnie dociśnij monowarstwę lipidową do interfejsu powietrze-woda. Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe przez dwie do trzech sekund na interfejsie, a następnie dociśnij je do suwaka.

Wyjmij szkiełko z szkłem nakrywkowym. Weź szkło nakrywkowe i dwuwarstwę do mikroskopu epifluorescencyjnego i zobrazuj dwuwarstwę lipidową zgodnie ze wskazówkami w manuskrypcie. Przygotuj naczynie krystalizacyjne zawierające ultraczystą wodę i umieść pod naczyniem czysty pierścień obrazu mikroskopowego.

Zanurz to szkiełko i szkło nakrywkowe, które zawierają dwuwarstwę lipidową pod wodą. Delikatnie oddziel szkiełko podstawowe od szkła nakrywkowego, przytrzymując szkiełko nakrywkowe od dołu i przenieś szkiełko nakrywkowe do pierścienia obrazu. Zastąp ultraczystą wodę w pierścieniu obrazu buforem chlorku sodu bis-tris, upewniając się, że dwuwarstwa lipidowa nie jest narażona na działanie pęcherzyków powietrza.

Dodać 1,1 nanomolowego n-oktylo-beta-glukopiranozydu do dwuwarstwy lipidowej, a następnie natychmiast dodać mieszaninę 1,2 nanomolowego DDM i 1,3 pikomoli oczyszczonego L-OPA1 do pierścienia obrazu. Inkubować próbkę na wytrząsarce stołowej z niską prędkością przez dwie godziny. Rozprowadź 30 miligramów kulek żywicy SM-2 w trzech mililitrach buforu bis-tris i wstrząśnij.

Za pomocą plastikowej pipety dodaj od 5 do 10 mikrolitrów kulek żywicy SM-2 do pierścienia obrazowego i inkubuj go przez 10 minut, a następnie spłucz kulki żywicy. Końcowa objętość bufora w pierścieniu obrazu powinna wynosić 1,5 mililitra. Przygotować jeden miligram mieszaniny lipidów A w roztworze chloroformu, a następnie odparować chloroform pod przepływem azotu przez 20 minut.

Trzymaj mieszaninę w próżni przez noc, aby utworzyć film lipidowy. Przygotować 50-milimolowy bufor zawierający wapń, rozpuszczając 15,56 grama kalceiny w 50 mililitrach 1,5-molowego roztworu wodorotlenku sodu. Mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej, aż kalceina całkowicie się rozpuści.

Dodaj 12,5 milimolowego bis-trisa i ultraczystą wodę, aby uzyskać końcową objętość 500 mililitrów i dostosuj pH do 7,5. Dozować film lipidowy w buforze zawierającym kalceinę, a następnie w pełni uwodnić lipid, podgrzewając zawiesinę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut. Twórz liposomy o długości 200 nanometrów poprzez wytłaczanie z membraną poliwęglanową.

Dodaj dwa mikrogramy L-OPA1 w 0,5 mikromolowym DDM, 2,2 miligrama liposomu i inkubuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Usunąć środek powierzchniowo czynny przez dializę za pomocą kasety do dializy o pojemności 3,5 kilodaltona na 250 mililitrów 25-milimolowego bis-trisu, 150-milimolowego chlorku sodu i 50-milimolowego buforu wapniowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, dwukrotnie zmieniając bufor. Usuń nadmiar kalceiny za pomocą kolumny odsalającej PD10, a następnie przystąp do obrazowania i analizy danych zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.

Przedstawiono tutaj obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej dwuwarstwy lipidowej i jej płynności lipidowej. Rozkład lipidów jest pokazany przed i po fotowybielaniu, a jednorodność jest pokazana przed i po rekonstytucji. Odtworzony L-OPA1 i dwuwarstwową warstwę lipidową zwalidowano za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji lub FCS.

Krzywe FCS wykazały, że 75% L-OPA1 zostało odtworzone w dwuwarstwie lipidowej, co sugeruje, że L-OPA1 swobodnie dyfunduje w dwuwarstwie lipidowej na uwięzi polimerowej z potencjałem do samoorganizacji w funkcjonalne kompleksy. Wybielanie etapowe fluorescencji wykazało, że średnio dwie do trzech kopii L-OPA1 zostały odtworzone w danym liposomie. Rozkład wielkości proteoliposomów odtworzonych L-OPA1 przetestowano po rozpuszczeniu przy użyciu DLS i zweryfikowano za pomocą FCS.

Wiązanie błony monitorowano, obserwując sygnał czerwieni teksańskiej na powierzchni dwuwarstwy lipidowej za pomocą mikroskopii TIRF. Mieszanie lipidów błonowych lub hemifiuza były monitorowane za pomocą Texas Red, gdy marker liposomowy dyfundował do dwuwarstwy lipidowej. Odgaszanie kalceiny pomogło odróżnić pełne tworzenie porów fuzyjnych od samego wymieszania lipidów, umożliwiając porównanie warunków, w których cząstki zatrzymują się w półfuzji, z cząstkami, które przechodzą do pełnej fuzji.

Wiązanie błony było wskazane przez stabilny sygnał lipidowy z liposomów, a sygnał efuzyjny nie zawierał wygaszania sygnału kalceiny, ale szybki zanik sygnału Texas Red wskazywał na dyfuzję barwnika do dwuwarstwy lipidowej. Pełna fuzja obejmowała zarówno rozpad lipidów, jak i uwalnianie zawartości. Próbując tej cząsteczki, pamiętaj, aby dokładnie wyczyścić zarówno szkło nakrywkowe, jak i rynnę Langmuira, aby zapewnić wykonanie dwuwarstwowych warstw wysokiej jakości.

Dobra jakość powietrza ma również kluczowe znaczenie dla zapobiegania defektom dwuwarstwy. Ta technika toruje nam drogę do zbadania nowych pytań dotyczących dynamiki i organizacji błon mitochondriów. Ekscytujący przyszły eksperyment obejmuje zbadanie wpływu asymetrii dwuwarstwowej, potencjału błonowego i mutantów związanych z chorobą na dynamikę wewnętrznej błony mitochondriów.