Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek
August 25th, 2020
Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.
Ta technika swobodnego pływania może być wykorzystana do przeprowadzenia zmniejszonej immunohistochemii na próbkach tkanki mózgowej myszy. Technika swobodnego pływania ma kilka zalet. Pozyskiwanie grubszych skrawków tkanek, przeprowadzanie badań na dużą skalę, przy użyciu od 30 do 40 warstw na podwielokrotność oraz długoterminowe przechowywanie próbek.
Jeśli próbujesz tej techniki po raz pierwszy, zalecamy przećwiczenie sekcji montażowych, które nie są krytyczne dla twojego eksperymentu, aby uzyskać doświadczenie z tą metodą. Co najmniej jedną do dwóch godzin przed sekcją należy zaaklimatyzować interesujące nas próbki w kriostacie w odpowiedniej temperaturze cięcia tkanki. Kiedy chusteczki są gotowe.
za pomocą kriostatu uzyskać sekcje o grubości od 20 do 50 mikronów i umieścić je w indywidualnych wkładkach w dołkach wypełnionych PBS na płytce sześcio- lub dwunastdołkowej. Po pobraniu wszystkich sekcji, przykryj próbki około sześcioma mililitrami na pranie przez trzy pięciominutowe płukania przed przeniesieniem każdej studzienki sekcji do dwóch mililitrowych mikroprobówek wirówkowych, zawierających od jednego do 1,5 mililitra roztworu do przechowywania na probówkę. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu barwienia.
W przypadku barwienia skrawków tkanek należy równoważyć próbki do temperatury pokojowej przez 10 do 20 minut przed dekantacją skrawków do wkładek na nowej płytce sześciodołkowej. Po opróżnieniu całego roztworu do przechowywania, przenieś wkładki do nowych studzienek, zawierających około sześciu mililitrów TBS na studzienkę przez trzy płukania przez pięć minut ze świeżymi TBS na płukanie na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości w temperaturze pokojowej. Po ostatnim myciu dodać siedem mililitrów świeżo przygotowanego blokującego roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki na 30-minutową inkubację na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji dodać jeden mililitr roztworu przeciwciała pierwotnego do jednej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej na wkładkę i przenieść wszystkie sekcje z każdej wkładki do odpowiedniej probówki o pojemności dwóch mililitrów. Następnie umieść rurki na obracającym się mikserze. Dodaj około siedmiu obrotów na minutę do całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego ranka należy przelać skrawki z każdej probówki do indywidualnych wkładów studzienkowych na nowej płytce sześciodołkowej i umyć sekcje dwa razy przez 30 sekund na mycie i jeden raz przez 10 minut w świeżych TBS na pranie. Po ostatnim przemyciu przenieść grupy skrawków do pojedynczych dwumililitrowych mikroprobówek wirówkowych, zawierających jeden mililitr odpowiedniego roztworu przeciwciał wtórnych na probówkę i inkubować próbki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji należy zdekantować skrawki do wkładek na nowej płytce sześciodołkowej i przemyć próbki dwa razy przez 30 sekund i jeden raz przez 15 minut w świeżych TBS na przemycie, chroniąc je przed światłem.
Po ostatnim umyciu przelej sekcje do szklanej prostokątnej komory histologicznej, wypełnionej w trzech czwartych TBS i zanurz szklane szkiełko w TBS. W razie potrzeby za pomocą cienkiego pędzla i lampy powiększającej ostrożnie dokręć sekcje w kierunku szkiełka i delikatnie postukaj sekcją w szkiełko, upewniając się, że nie ma zmarszczek ani fałd. Po uchwyceniu wszystkich skrawków na szkiełku, pozostawić szkiełka do wyschnięcia na około 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, aż skrawki staną się nieprzezroczyste i nałożyć na nie odpowiedni wodny środek montażowy.
Użyj pęsety, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na podłożu i użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby mocno docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby usunąć nadmiar medium. Skrawki można następnie zobrazować za pomocą odpowiedniego mikroskopu lub przechowywać w ciemnym pudełku z szkiełkami ustawionymi na cztery stopnie Celsjusza. Jak zaobserwowano na tych reprezentatywnych obrazach, fluorescencyjna analiza immunohistochemiczna przy użyciu metody swobodnego pływania może być przeprowadzona na skrawkach tkanki mózgowej myszy w celu zbadania ekspresji kwaśnych białek fibrylarnych glejowych.
Podejście to jest również odpowiednie do ujawniania białek o niskiej ekspresji, takich jak GFP, w próbce mózgu transgenicznej myszy o niskiej ekspresji lub w niefluorescencyjnych protokołach barwienia histochemicznego, takich jak fiolet krezylowy. Inne tkanki obwodowe są również podatne na zastosowanie tej techniki bez konieczności modyfikacji, jak zaobserwowano w przypadku tych próbek tkanek wątroby o niskim poziomie ekspresji GFP. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w przypadku techniki swobodnego pływania, jest delikatność sekcji, szczególnie podczas przenoszenia i gdy próbki znajdują się na wytrząsarkach lub rotatorach.
Oprócz barwienia immunofluorescencyjnego, metodę tę można łatwo zmodyfikować dla innych barwień histochemicznych, takich jak hematoksylina i eozyna oraz fiolet krezylowy lub dla immunohistochemii chromogenu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Technika swobodnego utrwalania jest wykorzystywana do wykonywania immunohistochemii na utrwalonych sekcjach tkankowych, umożliwiającą wizualizację struktur biologicznych, typów komórek i ekspresji białek. Metoda ta jest szczególnie skuteczna do badania różnych tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba, i zapewnia zalety takie jak grubsze sekcje tkanek i przydatność do dużych badań.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Histologia
- Immunohistochemia
- Analiza tkanki
Tło
- Zalety techniki swobodnego utrwalania obejmują łatwiejsze prowadzenie i możliwość długotrwałego przechowywania próbek.
- Ta metoda może być stosowana w wielu tkankach biologicznych bez modyfikacji.
- Zwiększa wykrywanie białek o niskiej ekspresji w różnych typach próbek.
Stosowane metody
- Barwienie immunohistochemiczne
- Próbki tkanki mózgu myszy
- Mikroskopia fluorescencyjna
Główne wyniki
- Technika umożliwia identyfikację ekspresji kwaśnego białka włókien glejowatych.
- Wykazuje skuteczność w kontekście niskiej ekspresji białek, takich jak w próbkach myszy transgenicznych GFP.
- Inne metody barwienia, takie jak hematoksylina i eozyna, mogą być również stosowane przy użyciu tej techniki.
Wnioski
- Badanie podkreśla wszechstronność techniki swobodnego utrwalania do barwienia i analizy tkanek.
- Istotne jest, aby badacze delikatnie obsługiwali próbki, aby zachować integralność podczas eksperymentu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The free-floating immunohistochemistry technique enables efficient processing of thick tissue sections for large-scale studies, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and peripheral tissue research. By improving antibody penetration and allowing batch handling of 30-40 sections per aliquot, it enhances reproducibility and throughput in discovery workflows. This approach is particularly valuable for studying protein expression patterns in complex tissues such as brain, where 3D reconstruction of neural projections informs target confidence and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of protein expression and localization in thick tissue sections, supporting functional target validation and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates handling of large numbers of sections per aliquot, reducing labor in large-scale biomarker screening campaigns.
- Predictive Value: Improves antibody penetration compared to slide-mounted methods, increasing confidence in detection of low-abundance targets such as GFP in transgenic models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with multiple histochemical stains including hematoxylin and eosin, cresyl violet, and chromogen immunohistochemistry, enabling flexible assay development.
- Operational Value: Sections remain suspended in solution during staining, ensuring uniform reagent exposure and minimizing variability across replicates.
- Scalability: Supports long-term storage at -80°C, allowing batch processing and retrospective analysis in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Applicable to both central nervous system and peripheral tissues (e.g., liver, heart) without protocol modifications, supporting cross-target validation.
- Mechanistic De-risking: Enables 3D reconstruction of axonal and dendritic projections, providing structural context for target engagement and pathway analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates quantitative, spatially resolved protein expression data that inform go/no-go decisions in preclinical target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The free-floating method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in neuroscience and systemic toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein expression patterns in fixed tissues, enabling mechanistic insight into target biology.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence or chromogenic readouts suitable for automated imaging and image-based screening platforms.
- Analytics: Produces spatially resolved expression data that can be quantified and compared across experimental conditions to assess target modulation.
- Translational Research: Enables consistency between discovery and preclinical models by applying identical staining protocols across species and tissue types.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable platform for histological analysis that can be deployed across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances detection sensitivity and specificity in immunohistochemistry, reducing false negatives in target validation studies.
- Operational Value: Standardizes tissue handling and staining procedures, improving inter-lab reproducibility and reducing technical variability.
- Strategic Value: Increases throughput in histology-based screening, lowering cost per sample and accelerating target de-risking cycles.
- Portfolio Impact: Supports data-driven target prioritization by providing reliable, multi-parameter tissue readouts that inform biological plausibility and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue sectioning, and immunofluorescence or chromogenic detection methods.
- Dependent on access to cryostat, microtome, orbital shakers, rotating mixers, and fluorescence or brightfield microscopes.
- Necessitates standardized blocking, permeabilizing, and washing buffers to minimize non-specific binding and ensure staining consistency.
- Requires optimization of antibody concentrations and incubation times for each target and tissue type, particularly for low-abundance proteins.
- Demands careful, gentle handling of free-floating sections to prevent mechanical damage during transfers and incubation steps.
