Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek
25 sierpnia 2020
Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.
Ta technika swobodnego pływania może być wykorzystana do przeprowadzenia zmniejszonej immunohistochemii na próbkach tkanki mózgowej myszy. Technika swobodnego pływania ma kilka zalet. Pozyskiwanie grubszych skrawków tkanek, przeprowadzanie badań na dużą skalę, przy użyciu od 30 do 40 warstw na podwielokrotność oraz długoterminowe przechowywanie próbek.
Jeśli próbujesz tej techniki po raz pierwszy, zalecamy przećwiczenie sekcji montażowych, które nie są krytyczne dla twojego eksperymentu, aby uzyskać doświadczenie z tą metodą. Co najmniej jedną do dwóch godzin przed sekcją należy zaaklimatyzować interesujące nas próbki w kriostacie w odpowiedniej temperaturze cięcia tkanki. Kiedy chusteczki są gotowe.
za pomocą kriostatu uzyskać sekcje o grubości od 20 do 50 mikronów i umieścić je w indywidualnych wkładkach w dołkach wypełnionych PBS na płytce sześcio- lub dwunastdołkowej. Po pobraniu wszystkich sekcji, przykryj próbki około sześcioma mililitrami na pranie przez trzy pięciominutowe płukania przed przeniesieniem każdej studzienki sekcji do dwóch mililitrowych mikroprobówek wirówkowych, zawierających od jednego do 1,5 mililitra roztworu do przechowywania na probówkę. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu barwienia.
W przypadku barwienia skrawków tkanek należy równoważyć próbki do temperatury pokojowej przez 10 do 20 minut przed dekantacją skrawków do wkładek na nowej płytce sześciodołkowej. Po opróżnieniu całego roztworu do przechowywania, przenieś wkładki do nowych studzienek, zawierających około sześciu mililitrów TBS na studzienkę przez trzy płukania przez pięć minut ze świeżymi TBS na płukanie na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości w temperaturze pokojowej. Po ostatnim myciu dodać siedem mililitrów świeżo przygotowanego blokującego roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki na 30-minutową inkubację na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji dodać jeden mililitr roztworu przeciwciała pierwotnego do jednej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej na wkładkę i przenieść wszystkie sekcje z każdej wkładki do odpowiedniej probówki o pojemności dwóch mililitrów. Następnie umieść rurki na obracającym się mikserze. Dodaj około siedmiu obrotów na minutę do całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego ranka należy przelać skrawki z każdej probówki do indywidualnych wkładów studzienkowych na nowej płytce sześciodołkowej i umyć sekcje dwa razy przez 30 sekund na mycie i jeden raz przez 10 minut w świeżych TBS na pranie. Po ostatnim przemyciu przenieść grupy skrawków do pojedynczych dwumililitrowych mikroprobówek wirówkowych, zawierających jeden mililitr odpowiedniego roztworu przeciwciał wtórnych na probówkę i inkubować próbki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji należy zdekantować skrawki do wkładek na nowej płytce sześciodołkowej i przemyć próbki dwa razy przez 30 sekund i jeden raz przez 15 minut w świeżych TBS na przemycie, chroniąc je przed światłem.
Po ostatnim umyciu przelej sekcje do szklanej prostokątnej komory histologicznej, wypełnionej w trzech czwartych TBS i zanurz szklane szkiełko w TBS. W razie potrzeby za pomocą cienkiego pędzla i lampy powiększającej ostrożnie dokręć sekcje w kierunku szkiełka i delikatnie postukaj sekcją w szkiełko, upewniając się, że nie ma zmarszczek ani fałd. Po uchwyceniu wszystkich skrawków na szkiełku, pozostawić szkiełka do wyschnięcia na około 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, aż skrawki staną się nieprzezroczyste i nałożyć na nie odpowiedni wodny środek montażowy.
Użyj pęsety, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na podłożu i użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby mocno docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby usunąć nadmiar medium. Skrawki można następnie zobrazować za pomocą odpowiedniego mikroskopu lub przechowywać w ciemnym pudełku z szkiełkami ustawionymi na cztery stopnie Celsjusza. Jak zaobserwowano na tych reprezentatywnych obrazach, fluorescencyjna analiza immunohistochemiczna przy użyciu metody swobodnego pływania może być przeprowadzona na skrawkach tkanki mózgowej myszy w celu zbadania ekspresji kwaśnych białek fibrylarnych glejowych.
Podejście to jest również odpowiednie do ujawniania białek o niskiej ekspresji, takich jak GFP, w próbce mózgu transgenicznej myszy o niskiej ekspresji lub w niefluorescencyjnych protokołach barwienia histochemicznego, takich jak fiolet krezylowy. Inne tkanki obwodowe są również podatne na zastosowanie tej techniki bez konieczności modyfikacji, jak zaobserwowano w przypadku tych próbek tkanek wątroby o niskim poziomie ekspresji GFP. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w przypadku techniki swobodnego pływania, jest delikatność sekcji, szczególnie podczas przenoszenia i gdy próbki znajdują się na wytrząsarkach lub rotatorach.
Oprócz barwienia immunofluorescencyjnego, metodę tę można łatwo zmodyfikować dla innych barwień histochemicznych, takich jak hematoksylina i eozyna oraz fiolet krezylowy lub dla immunohistochemii chromogenu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Technika swobodnego pływania (free-floating) jest wykorzystywana do przeprowadzania immunohistochemii na utrwalonych przekrojach tkanek, co pozwala na wizualizację struktur biologicznych, typów komórek oraz ekspresji białek. Metoda ta jest szczególnie skuteczna w badaniu różnych tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba, oraz oferuje takie zalety, jak możliwość uzyskania grubszych przekrojów tkankowych i przydatność do badań na szeroką skalę.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Histologia
- Immunohistochemia
- Analiza tkanek
Wprowadzenie
- Zalety techniki wolnopływającej obejmują łatwiejszą manipulację oraz możliwość długoterminowego przechowywania próbek.
- Metoda ta jest możliwa do zastosowania w wielu różnych tkankach biologicznych bez konieczności wprowadzania modyfikacji.
- Usprawnia ona detekcję białek o niskiej ekspresji w różnych typach próbek.
Zastosowane metody
- Barwienie immunohistochemiczne
- Próbki tkanki mózgu myszy
- Mikroskopia fluorescencyjna
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia identyfikację ekspresji kwaśnego białka włókienstwa gliałego.
- Wykazuje ona skuteczność w kontekstach niskiej ekspresji białek, na przykład w próbkach z transgenicznymi myszami GFP.
- Za pomocą tej techniki można zastosować również inne metody barwienia, takie jak hematoksylina i eozyna.
Wnioski
- Badanie podkreśla wszechstronność techniki swobodnego unoszenia w barwieniu i analizie tkanek.
- Kluczowe dla badaczy jest delikatne obchodzenie się z próbkami, aby zachować ich integralność podczas przeprowadzania eksperymentów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Technika immunohistochemii z wolno unoszącymi się skrawkami umożliwia efektywne przetwarzanie grubych sekcji tkanek w badaniach na dużą skalę, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad układem nerwowym i tkankami obwodowymi. Dzięki poprawie penetracji przeciwciał i możliwościy przetwarzania partii 30-40 skrawków na jedną alikwot, metoda ta zwiększa powtarzalność i przepustowość w procesach badawczych. Podejście to jest szczególnie wartościowe przy badaniu wzorców ekspresji białek w złożonych tkankach, takich jak mózg, gdzie rekonstrukcja 3D projekcji neuronalnych pozwala na zwiększenie pewności co do wybranego celu oraz priorytetyzację portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia wizualizację ekspresji i lokalizacji białek w grubych przekrojach tkankowych, wspierając funkcjonalną walidację celów oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przetwarzanie licznej ilości przekrojów w jednej porcji, co zmniejsza nakład pracy podczas szeroko zakrojonych kampanii przesiewowych biomarkerów.
- Wartość prognostyczna: Poprawia penetrację przeciwciał w porównaniu z metodami z użyciem preparatów na szkiełkach, zwiększając pewność wykrywania celów o niskiej liczbie kopii, takich jak GFP w modelach transgenicznych.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Kompatybilność z wieloma barwieniami histochemicznymi, w tym z hematoksyliną i eozyną, fioletem krezylowym oraz immunohistochemią chromogenną, co umożliwia elastyczne opracowywanie analiz.
- Wartość operacyjna: Przekroje pozostają zawieszone w roztworze podczas barwienia, co zapewnia równomierną ekspozycję na odczynniki i minimalizuje zmienność między powtórzeniami.
- Skalowalność: Możliwość długoterminowego przechowywania w temperaturze -80°C, co pozwala na przetwarzanie partiami oraz analizy retrospektywne w procesach odkrywania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Możliwość zastosowania zarówno w ośrodkowym układzie nerwowym, jak i w tkankach obwodowych (np. wątrobie, sercu) bez modyfikacji protokołu, co wspiera walidację wielu celów jednocześnie.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia rekonstrukcję 3D projekcji aksonalnych i dendrytycznych, dostarczając kontekstu strukturalnego dla oddziaływania na cel oraz analizy szlaków.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Generuje ilościowe, rozdzielcze przestrzennie dane o ekspresji białek, które stanowią podstawę do decyzji go/no-go w przedklinicznym wyborze celu.
Integracja rurociągów i przepływu pracy
Metoda swobodnie pływająca wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od wczesnego testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, szczególnie w obszarze neuronauki oraz oceny toksyczności systemowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących wzorców ekspresji białek w utrwalonych tkankach, umożliwiając uzyskanie wglądu w mechanizmy biologii celu.
- Przesiewy: Generuje powtarzalne, ilościowe odczyty fluorescencyjne lub chromogenne, odpowiednie dla zautomatyzowanych systemów obrazowania i platform przesiewowych opartych na obrazach.
- Analityka: Dostarcza danych o ekspresji z rozdzielczością przestrzenną, które można kwantyfikować i porównywać pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi w celu oceny modulacji celu.
- Badania translacyjne: Zapewnia spójność między badaniami odkrywczymi a modelami przedklinicznymi dzięki zastosowaniu identycznych protokołów barwienia dla różnych gatunków i typów tkanek.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi ustandaryzowaną, adaptowalną platformę do analizy histologicznej, którą można wdrożyć w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa czułość i swoistość detekcji w immunohistochemii, redukując liczbę wyników fałszywie ujemnych w badaniach walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury przygotowania tkanek i barwienia, poprawiając odtwarzalność między laboratoriami i zmniejszając zmienność techniczną.
- Wartość strategiczna: Zwiększa przepustowość w przesiewach opartych na histologii, obniżając koszt jednostkowy próbki i przyspieszając cykle oceny ryzyka celów terapeutycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w oparciu o dane, dostarczając wiarygodne, wieloparametrowe odczyty tkankowe, które pozwalają ocenić prawdopodobieństwo biologiczne i marginesy bezpieczeństwa.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu histologii, sekcjonowania tkanek oraz metod detekcji immunofluorescencyjnej lub chromogennej.
- Zależność od dostępu do kriotoma, mikrotoma, wytrząsarek orbitalnych, mieszadeł obrotowych oraz mikroskopów fluorescencyjnych lub jasnopolowych.
- Konieczne jest zastosowanie standaryzowanych buforów blokujących, permeabilizujących i płuczących w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania i zapewnienia powtarzalności barwienia.
- Wymagana jest optymalizacja stężeń przeciwciał i czasów inkubacji dla każdego celu i rodzaju tkanki, szczególnie w przypadku białek występujących w niskich stężeniach.
- Wymagane jest ostrożne i delikatne obchodzenie się z wolno pływającymi przekrojami, aby zapobiec uszkodzeniom mechanicznym podczas przenoszenia i etapów inkubacji.
