Name: Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Naucz się techniki swobodnie unoszącej się do immunohistochemii tkanek mózgu myszy. Ta metoda umożliwia uzyskanie grubszych skrawków, długoterminowe przechowywanie próbek i wykrywanie słabo ekspresjonowanych białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 do JMR), George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), College of Pharmacy na University of Rhode Island (EP, GC, JMR), oraz Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Dziękujemy doktorantce Rebecce Senft, która szkoli się z prof. Susan Dymecki, Wydział Genetyki Harvard Medical School, za zapoznanie nas z metodą swobodnego pływania. Niektóre obrazy użyte na rysunku 1 zostały uzyskane ze źródeł "do swobodnego użytku, udostępniania lub modyfikowania, nawet komercyjnie": probówki mysiej i mikrowirówki (Pixabay), mózgu myszy (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kriostatu i sekcji mózgu myszy (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), szklanego pojemnika (OpenClipart, FreeSvg.org) i mikroskopu (Theresa Knott, Open Clipart Library).

1. Przygotowanie tkanek do kriosekcji
<ol>
	<li>Osadzone tkanki należy zatopić w odpowiedniej formie do zatapiania (patrz Tabela materiałów), aby utworzyć blok próbki przy użyciu odpowiedniej matrycy próbki (patrz Tabela materiałów) i zamrozić na suchym lodzie. Przechowywać bloki próbek w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do cięcia. 
	UWAGA: Utrwalone tkanki są zazwyczaj przygotowywane przez perfuzję dorosłych (ok. 2,5 – 30 miesięcy) samców lub samic gryzoni (myszy lub szczurów) 34, zgodnie z dostępnym zezwoleniem etycznym, z odpowiednim utrwalaczem (np. 10% formaliny), a następnie po utrwaleniu tkanek w tym samym utrwalaczu przez 12 godzin w temperaturze 4 °C, trzykrotnie myjąc tkanki 1x PBS, i umieszczanie tkanek w 15%, a następnie 30% sacharozie w 1x PBS na noc lub do momentu, gdy tkanki opadną35. Badacze mogą próbować dostosować ten ogólny protokół do różnych etapów rozwoju.</li>
</ol>
2. Kriosekcja
<ol>
	<li>Gdy są gotowe do cięcia, aklimatyzuj próbki w kriostacie przez co najmniej 1-2 godziny przed sekcją, aby zapobiec rozbiciu tkanki.</li>
	<li>Za pomocą kriostatu pociąć tkankę na odcinki (20-50 μm) i zebrać w 6 lub 12-dołkowych wkładkach (patrz Tabela materiałów) wypełnionych 1x roztworem PBS. 
	UWAGA: W zależności od grubości sekcji, ilości tkanki, która ma zostać pobrana, oraz liczby użytych wkładek studzienkowych, każda studzienka będzie zawierać zmienną liczbę sekcji obejmujących od około 10 do 40 plastrów dla studzienki. Na przykład, jeśli cały mózg zostanie podzielony na sekcje przy 40 μm, około 18-24 sekcje zostaną zebrane w każdym dołku za pomocą 12-dołkowych wkładek. Ponadto sekcje 20 μm mogą być nieco trudne w obsłudze, dlatego 40 μm jest zalecane do barwienia luzem (patrz Dyskusja).</li>
</ol>
3. Przechowywanie sekcji
<ol>
	<li>Po zebraniu umyj skrawki świeżo przygotowanym 1x PBS przez 5 min. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Przenieść skrawki do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml wypełnionych 1-1,5 ml roztworu do przechowywania (na 250 ml zmieszać 70 g sacharozy, 75 ml glikolu etylenowego i uzupełnić do objętości 0,1 M buforem fosforanowym).</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do barwienia.</li>
</ol>
4. Dzień Barwienia I
<ol>
	<li>Wyjąć próbki z zamrażarki i równoważyć w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 - 20 minut.</li>
	<li>Wlej skrawki do studzienki, włóż do płytki 6-dołkowej, aby oddzielić roztwór do przechowywania od sekcji.</li>
	<li>Przenieś wkład studzienki do innej studzienki zawierającej około 6 ml 1x TBS. Przemyć 3 razy 1x TBS przez 5 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości przy RT.</li>
	<li>Podczas mycia skrawków przygotuj 7 ml (na próbkę) roztworu blokująco-przepuszczalnego, składającego się z 1x TBS z 0,3% Triton X-100 i 3% normalnej surowicy (np. normalnej surowicy końskiej). Blokuj sekcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej, używając niskiej prędkości. 
	UWAGA: Blokowanie surowicami zapobiega nieswoistemu wiązaniu przeciwciał z tkankami lub nieswoistymi receptorami Fc – zalecana jest surowica pasująca do gatunku przeciwciała drugorzędowego, ale jeśli nie jest dostępna, można użyć dowolnej normalnej surowicy od gatunku innego niż pierwotne przeciwciało u zwierzęcia gospodarza. Detergent Triton X-100 pozwala na lepszą penetrację przeciwciał poprzez przepuszczalność tkanki.</li>
	<li>Przygotować 1 ml na próbkę roztworu przeciwciała pierwszorzędowego składającego się z wybranego przeciwciała pierwszorzędowego (odpowiednio rozcieńczonego) w 1x TBS z 0,3% Triton X-100 i 1% normalnej surowicy (patrz Krok 4.4 Uwaga). Przenieść skrawki z dołka do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w celu związania się z interesującym antygenem (antygenami). 
	UWAGA: Można zastosować wiele przeciwciał pierwszorzędowych (generowanych u różnych gatunków gospodarzy).</li>
	<li>Umieścić probówkę do mikrowirówki o pojemności 2 ml z sekcjami na obracającym się mieszalniku przy niskiej prędkości (np. prędkość 7 obr./min) i inkubować przez noc przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Dzień Barwienia II
<ol>
	<li>Następnego dnia wlej skrawki do studzienki, włóż do płytki 6-dołkowej, aby oddzielić skrawki od pierwotnego roztworu przeciwciała. 
	UWAGA: Roztwór przeciwciał można pobrać i ponownie użyć; Dodać 0,02% (w/v) azydku sodu, aby zahamować rozwój drobnoustrojów.</li>
	<li>Umyj sekcje 3 razy z 1x TBS przy RT (30 s na pierwsze 2 prania i 10 min na pranie końcowe).</li>
	<li>Przygotować 1 ml na próbkę roztworu przeciwciała drugorzędowego składającego się z odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego (odpowiednio rozcieńczonego) w 1x TBS z 0,3% Triton X-100 i 1% normalną surowicą (roztwór osłonowy przed światłem). 
	UWAGA: Pośrednie znakowanie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym wzmacnia sygnał i pozwala na kolorymetryczną lub fluorescencyjną wizualizację celu białka.</li>
	<li>Przenieść skrawki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej drugorzędowy roztwór przeciwciał. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy użyciu niskiej prędkości (roztwór osłonowy przed światłem).</li>
	<li>Wlej skrawki do studzienki, włóż do płytki 6-dołkowej, aby oddzielić skrawki od wtórnego roztworu przeciwciał.</li>
	<li>Kontynuując osłanianie próbek przed światłem, przemyj je 2 razy 1x TBS przez 30 s w temperaturze pokojowej. Następnie prać przez 15 minut w 1x TBS, w razie potrzeby dodać DAPI (1-0,1 μg/ml).</li>
</ol>
6. Montaż
<ol>
	<li>Wlej skrawki do szklanej, prostokątnej komory histologicznej wypełnionej w trzech czwartych 1x TBS.</li>
	<li>Zanurz szklaną prowadnicę w 1x TBS i użyj cienkiego pędzla, aby nakłonić sekcje do zamka.</li>
	<li>Delikatnie postukaj sekcjami o slajd, upewniając się, że nie ma zmarszczek ani fałd.</li>
	<li>Powtarzaj, aż wszystkie sekcje zostaną zamontowane na prowadnicy. 
	UWAGA: Gdy na przykład cały mózg jest podzielony na sekcje pod kątem 40 μm, zebrany w 12-dołkowych wkładkach z jedną podwielokrotnością zawierającą 18-24 sekcje; Plasterki są zwykle montowane na 1-2 szkiełkach, ale można również zamontować mniej sekcji na szkiełku, w zależności od preferencji badacza.</li>
</ol>
7. Szkiełko nakrywkowe
<ol>
	<li>Po wysuszeniu skrawków na szkiełku, około 10-15 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy skrawki będą wyglądać na nieprzezroczyste (pamiętaj o osłonie szkiełek przed światłem), nałóż odpowiedni wodny środek montażowy (utwardzający lub nietwardniejący). Przeciwdziałanie blaknięciu jest preferowane w przypadku stosowania fluorescencyjnego sprzężonego przeciwciała drugorzędowego. 
	UWAGA: Jakość fluorescencji może być gorsza w przypadku stosowania utwardzającego medium montażowego, ale szkiełka powinny wytrzymać dłużej.</li>
	<li>Za pomocą pęsety umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu. Przykryj bibułą filtracyjną i mocno dociśnij, aby usunąć nadmiar medium montażowego. 
	UWAGA: Jeśli używasz nietwardniejącego mocowania, pomaluj krawędzie prowadnicy nakrywkowej przezroczystym lakierem do paznokci, aby uszczelnić.</li>
	<li>Wycinki obrazu przy użyciu odpowiedniego mikroskopu. Przechowywać w ciemnym pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Przekroje można obrazować za pomocą różnych mikroskopów, takich jak skaning laserowy konfokalny i odwrócona lub pionowa fluorescencja szerokokątna, przy powiększeniach (np. 10x, 20x, 40x) w zależności od potrzeb badacza.</li>
</ol>

<ol><li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV%3A+Techniques+in+Experimental+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies%3A+indispensable+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li>
<li>Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+SN+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22">The Quarterly Review of Biology</a>. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374(1999).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+NationalAcademy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Hermersdörfer, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermersd%C3%B6rfer%2C+H+%22Immunocytochemistry.+A+Practical+Approach%22">Immunocytochemistry. A Practical Approach</a>. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Review+of+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphoproliferative+Diseases%22%5BJournal%5D)">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li>
<li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+%26+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).</li>
<li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).</li>
<li>Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).</li>
<li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focus+on+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A focus on fixation.</a> Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li>
<li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fos%3A+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li>
<li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li>
<li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofClinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li>
<li>Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+%28ANIT%29+induced+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li>
<li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li>
<li>Lönnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li>
<li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+%28GnRH%29+and+Pro-GnRH%2C+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li>
<li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li>
<li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li>
<li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain%3A+a+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li>
<li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury%3A+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li>
<li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li>
<li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papel+da+imuno-histoqu%C3%ADmica+no+diagn%C3%B3stico+do+c%C3%A2ncer+de+pulm%C3%A3o%5BTitle%5D)+AND+%22Jornal+Brasileiro+de+Pneumologia%22%5BJournal%5D)">Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurry%2C+RW+%22Immunocytochemistry%22">Immunocytochemistry</a>. , 65-77 (2009).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarr%2C+WB+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+Methods%22">Neuroanatomical Tract-Tracing Methods</a>. , Springer. 207-262 (1981).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cresyl+violet%3A+A+red+fluorescent+Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li>
</ol>

Nic do ujawnienia

Immunohistochemia (IHC) to wszechstronna technika, która stała się kluczowa w identyfikacji ekspresji i lokalizacji białek w skrawkach tkanek. Test ten jest stosowany w całej społeczności naukowej w celu lepszego zrozumienia charakterystyki tkanki na różnych etapach normalnego funkcjonowania do stanów chorobowych. IHC jest stosowany w różnych dziedzinach, od klinicznej diagnostyki chorób, takich jak rak, po wstępne odkrycia w badaniach przedklinicznych10,36.
...

Barwienie immunologiczne to popularna praktyka badawcza, która rozpoczęła się 130 lat temu od odkrycia przeciwciał w surowicy w 1890 roku przez Von Behringa1. Na początku XX wieku barwniki były przyłączane do antygenów, a później do przeciwciał jako sposób na ilościowe określenie i wizualizację reakcji1, a w 1941 roku Albert Coons opracował pierwsze fluorescencyjne etykiety przeciwciał, odkrycie, które zrewolucjonizowało mikroskopię świetlną2,3. Termin "barwienie immunologiczne" obejmuje wiele technik, które zostały opracowane przy użyciu tej zasady, w tym Western blot, cytometrię przepływową, ELISA, immunocytochemię i immunohistochemię3,4. Western blot wykrywa obecność określonych białek z ekstraktów tkankowych lub komórkowych5. Białka są rozdzielane według wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, przenoszone do błony i sondowane za pomocą przeciwciał. Ta technika wskazuje na obecność białka i ilość białka; Nie ujawnia jednak żadnych informacji na temat lokalizacji białka w komórkach lub tkankach. Inna metoda, immunocytochemia (ICC), znakuje białka w komórkach, zazwyczaj komórkach hodowanych in vitro. ICC pokazuje zarówno ekspresję, jak i lokalizację białek w przedziałach komórkowych6. Aby wykryć i uwidocznić określone białko na poziomie tkanki, wykorzystuje się immunohistochemię (IHC).
IHC to metoda, której naukowcy używają do celowania w określone antygeny w tkance, wykorzystując właściwości chemiczne układu odpornościowego7,8. Poprzez generowanie specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych połączonych z enzymem lub barwnikiem fluorescencyjnym, antygeny będące przedmiotem zainteresowania mogą być znakowane i ujawniane w większości tkanek (zgodnie z przeglądem w Mepham i Britten)9. Termin "immunohistochemia" sam w sobie nie określa metody znakowania, która jest stosowana w celu ujawnienia antygenu będącego przedmiotem zainteresowania; w związku z tym terminologia ta jest często łączona z techniką wykrywania, aby wyraźnie określić metodę znakowania: immunohistochemia chromogenna (CIH) w celu wskazania, kiedy przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z enzymem, takim jak peroksydaza; lub fluorescencyjny IHC w celu wskazania, kiedy przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z fluoroforem, takim jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) lub tetrametylorodamina (TRITC). Selektywność IHC pozwala klinicystom i badaczom na wizualizację ekspresji i dystrybucji białek w tkankach, w różnych stanach zdrowia i choroby10. W sferze klinicznej IHC jest powszechnie stosowany do diagnozowania raka, a także do określania różnic w różnych typach raka. IHC był również używany do potwierdzania różnych rodzajów infekcji mikrobiologicznych w organizmie, takich jak wirusowe zapalenie wątroby typu B lub C11. W badaniach biomedycznych IHC jest często używany do mapowania ekspresji białek w tkankach i jest ważny w identyfikacji nieprawidłowych białek obserwowanych w stanach chorobowych. Na przykład neurodegeneracji często towarzyszy akumulacja nieprawidłowych białek w mózgu, takich jak blaszki αβ i splątki neurofibrylarne w chorobie Alzheimera. Modele zwierzęce są często opracowywane w celu naśladowania tych patologicznych stanów, a IHC jest jedną z metod używanych przez naukowców do lokalizowania i ilościowego określania interesujących białek10,12,13. Z kolei możemy dowiedzieć się więcej o przyczynach tych chorób i powikłaniach, które się z nimi wiążą.
Wykonywanie IHC składa się z wielu etapów. Najpierw pobiera się interesującą tkankę i przygotowuje ją do barwienia. Prawdopodobnie większość badaczy przygotowuje utrwalone próbki tkanek, przy czym perfuzja utrwalacza przez układ krążenia jest optymalna, ponieważ zachowuje morfologię14,15. Można również zastosować post-fixing próbek tkanek, ale może to dać wyniki dalekie od idealnych16. Utrwalacze sieciujące, takie jak formaldehyd, działają poprzez tworzenie wiązań chemicznych między białkami w tissue17. Utrwalona tkanka jest następnie cięta na bardzo cienkie warstwy lub skrawki za pomocą mikrotomu, przy czym wielu badaczy woli zbierać zamrożone skrawki za pomocą kriostatu. Stamtąd tkanka jest pobierana i albo montowana bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym (metoda montowana na szkiełku), albo zawieszana w roztworze (metoda swobodnie pływająca), takim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)18. Zastosowana metoda zbierania danych jest z góry określona w oparciu o potrzeby badacza, przy czym każda z tych dwóch metod ma swoje zalety i wady.
Metoda montowana na szkiełku jest zdecydowanie najczęściej stosowana, z ważną korzyścią jest to, że można przygotować bardzo cienkie odcinki (10-14 μm), co jest ważne, na przykład, do badania interakcji białko-białko. Obchodzenie się z próbką jest również ograniczone do minimum, co zmniejsza potencjalne uszkodzenia integralności strukturalnej tkanki19. Naukowcy często stosują tę technikę w przypadku świeżo zamrożonej tkanki (tkanki, która jest natychmiast zamrażana przy użyciu suchego lodu, izopentanu itp.), która jest bardzo delikatna w porównaniu z tkanką utrwaloną i należy zachować dużą ostrożność, aby zapobiec rozmrożeniu próbki. Kolejną zaletą stosowania sekcji montowanych na prowadnicach jest to, że zwykle nie są wymagane duże ilości roztworów do barwienia4. W ten sposób naukowcy mogą użyć mniejszej ilości drogich przeciwciał lub innych chemikaliów, aby uzupełnić barwienie. Dodatkowo możliwe jest zamontowanie na tym samym szkiełku przekrojów z kilku różnych grup eksperymentalnych, co może być korzystne, zwłaszcza podczas akwizycji obrazu. Z drugiej strony istnieją pewne wady stosowania odcinków montowanych na suwaku, w szczególności to, że wycinek tkanki jest przyklejony do szkiełka, ograniczając w ten sposób penetrację przeciwciał do jednej strony przekroju, co ogranicza grubość przekroju i reprezentację 3D tkanki. Może się również zdarzyć, że podczas płukania krawędzie tkanki i całe odcinki mogą oderwać się od szkiełka, co sprawi, że cały eksperyment stanie się bezużyteczny. Co więcej, IHC zwykle musi być wykonywane stosunkowo szybko przy użyciu podejścia montowanego na szkiełku, aby uniknąć degradacji epitopu antygenu 20,21 z nieprzetworzonymi szkiełkami zwykle przechowywanymi w temperaturze -20 lub -80 °C, często przykrytymi i przechowywanymi poziomo lub w pudełkach na slajdy, co skutkuje stosunkowo dużą powierzchnią magazynowania. Wreszcie, technika montażu na szkiełku może być również czasochłonna, jeśli badacze muszą obsługiwać dużą liczbę szkiełek w celu przetworzenia dużej liczby skrawków tkanki.
Ze względu na niektóre z tych wyzwań związanych z wykorzystaniem metody montowanej na suwaku, modyfikacja zwana metodą swobodną stała się popularną alternatywą. Technika ta pojawiła się w literaturze w latach 1960-7022,23,24, zyskując popularność w latach 8025,26,27,28,29i jest obecnie dobrze znaną metodą, która polega na wykonywaniu barwienia na zebranych odcinkach w zawieszeniu, a nie przyklejonym do suwaka12,30,31. Metoda swobodnego pływania nie jest zalecana, gdy skrawki tkanki są mniejsze niż 20 μm; Jednak z naszego doświadczenia wynika, że jest to podejście z wyboru, gdy mają być barwione grubsze (40-50 μm) odcinki. Jedną z wyraźnych korzyści jest to, że przeciwciała mogą przenikać do swobodnie unoszących się sekcji pod każdym kątem i generować mniej barwienia tła dzięki skuteczniejszemu myciu, co skutkuje lepszą sygnalizacją podczas obrazowania. Dodatkowo sekcje są montowane na szkiełkach po obróbce, eliminując w ten sposób możliwość oderwania się tkanki, a także skracając czas zajmowany przez kriostat. Metoda swobodnego pływania może być również znacznie mniej pracochłonna, zwłaszcza w przypadku badań biomedycznych na dużą skalę. Na przykład, możliwe jest barwienie wielu (18-40) odcinków tej samej próbki razem w tym samym dołku, co oszczędza czas podczas wykonywania zarówno etapów mycia, jak i inkubacji przeciwciał. Co więcej, ponieważ przy użyciu tego podejścia można zamontować większą liczbę (12-16) sekcji na jednym slajdzie, często wygodniej i szybciej jest badaczowi przeglądać i obrazować sekcje. Warto zauważyć, że podczas montażu plastrów tkanki na szkiełkach, sekcje mogą być mocowane i odłączane, aż do uzyskania pożądanej orientacji. Naukowcy często stosują również nieco niższe stężenia przeciwciał przy użyciu metody swobodnego pływania, a ponieważ inkubacje są wykonywane w probówkach do mikrowirówek, przeciwciała można łatwo zebrać i zakonserwować azydkiem sodu w celu ponownego użycia (patrz krok 5.1). Kolejną zaletą jest to, że skrawki mogą być bezpośrednio przechowywane w temperaturze -80 °C w małych probówkach do mikrowirówek z roztworem krioprotektantu32, minimalizując w ten sposób przestrzeń do przechowywania i maksymalizując żywotność próbek33. Wadą stosowania tej techniki jest to, że sekcje są często obsługiwane, a tym samym są podatne na uszkodzenia. Można to jednak złagodzić, stosując niskie prędkości wytrząsania i obracania, a także odpowiednio szkoląc badaczy w zakresie przenoszenia próbek i montowania sekcji na szkiełkach.
Podsumowując, IHC jest uznanym i niezbędnym narzędziem do wizualizacji i lokalizacji ekspresji białek zarówno w badaniach klinicznych, jak i biomedycznych. Swobodnie pływający IHC jest wydajną, elastyczną, a także ekonomiczną metodą, zwłaszcza przy wykonywaniu badań histologicznych na dużą skalę. W tym miejscu przedstawiamy niezawodny protokół fluorescencyjnego IHC dla społeczności naukowej, który można odpowiednio dostosować do chromogennego IHC i innych barwień, takich jak barwienie hematoksyliną i eozyną lub fioletem krezylowym.

<table><tbody><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska, inaktywowana termicznie</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka na szkiełka mikroskopowe</td><td>Usługi mikroskopu</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>Nie dotyczy Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>pierwotne</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe prostokątne</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Prostokątne naczynie do barwienia</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>Okrągły pędzel artystyczny #2</td><td>Princeton Select Series</td><td>3750R</td><td>Marka nieważna</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne</td><td>Preferencja użytkownika</td><td>Nie dotyczy Matryca</td><td></td></tr><tr><td>próbki do zatapiania</td><td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tacka na plamy &ndash; system barwienia szkiełek</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>71396-B</td><td>Użyj ciemnej pokrywy</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS Preferencje</td><td>użytkownika</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade medium montażowe</td><td>Wektor Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Nietwardniejące</td></tr><tr><td>wkłady studzienne do płytek 12-dołkowych</td><td>Corning Netwells</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady studzienne do płytek 6-dołkowych</td><td>Corning Netwells</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>Millapore-Sigma</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemia jest szeroko stosowaną techniką do wizualizacji określonych struktur tkankowych, jak również ekspresji i lokalizacji białek. Dwa alternatywne podejścia są szeroko stosowane do obchodzenia się z skrawkami tkanek podczas procedury barwienia, jedno podejście polega na montażu skrawków bezpośrednio na szkiełkach szkiełkowych, podczas gdy drugie podejście, swobodne, pozwala na utrzymanie stałych odcinków i barwienie ich podczas zawieszenia w roztworze. Chociaż metody montowane na szkiełku i swobodnie pływające mogą dawać podobne wyniki, technika swobodnego pływania pozwala na lepszą penetrację przeciwciał i dlatego powinna być metodą z wyboru, gdy grubsze odcinki mają być używane do rekonstrukcji 3D tkanek, na przykład, gdy celem eksperymentu jest uzyskanie informacji na temat projekcji dendrytycznych i aksonalnych w obszarach mózgu. Ponadto, ponieważ skrawki są przechowywane w roztworze, pojedyncza podwielokrotność może z łatwością pomieścić od 30 do 40 sekcji, których obsługa jest mniej pracochłonna, szczególnie w badaniach biomedycznych na dużą skalę. Tutaj pokazujemy, jak zastosować metodę swobodnego pływania do fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego, ze szczególnym naciskiem na wycinki mózgu. Omówimy również, w jaki sposób technika swobodnego pływania może być łatwo zmodyfikowana w celu dopasowania do indywidualnych potrzeb badaczy i dostosowana do innych tkanek, a także innych barwień histochemicznych, takich jak hematoksylina i eozyna oraz fiolet krezylowy, o ile próbki tkanek są odpowiednio utrwalone, zwykle za pomocą paraformaldehydu lub formaliny.

Ogólny schemat zastosowania metody wolnopływającej (free-floating) do przeprowadzenia fluorescencyjnego badania immunohistochemicznego przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywny przykład fluorescencyjnego IHC z zastosowaniem metody wolnopływającej w mózgu myszy w celu zbadania ekspresji białka kwaśnego włókienka glejowego (GFAP) przedstawiono na Rysunku 2 przy małym i dużym powiększeniu, aby zilustrować ogólną jakość barwienia. Podejście to jest również odpowie...

Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.

Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

Ta technika swobodnego pływania może być wykorzystana do przeprowadzenia zmniejszonej immunohistochemii na próbkach tkanki mózgowej myszy. Technika swobodnego pływania ma kilka zalet. Pozyskiwanie grubszych skrawków tkanek, przeprowadzanie badań na dużą skalę, przy użyciu od 30 do 40 warstw na podwielokrotność oraz długoterminowe przechowywanie próbek.Jeśli próbujesz tej techniki po raz pierwszy, zalecamy przećwiczenie sekcji montażowych, które nie są krytyczne dla twojego eksperymentu, aby uzyskać doświadczenie z tą metodą. Co najmniej jedną do dwóch godzin przed sekcją należy zaaklimatyzować interesujące nas próbki w kriostacie w odpowiedniej temperaturze cięcia tkanki. Kiedy chusteczki są gotowe.za pomocą kriostatu uzyskać sekcje o grubości od 20 do 50 mikronów i umieścić je w indywidualnych wkładkach w dołkach wypełnionych PBS na płytce sześcio- lub dwunastdołkowej. Po pobraniu wszystkich sekcji, przykryj próbki około sześcioma mililitrami na pranie przez trzy pięciominutowe płukania przed przeniesieniem każdej studzienki sekcji do dwóch mililitrowych mikroprobówek wirówkowych, zawierających od jednego do 1,5 mililitra roztworu do przechowywania na probówkę. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu barwienia.W przypadku barwienia skrawków tkanek należy równoważyć próbki do temperatury pokojowej przez 10 do 20 minut przed dekantacją skrawków do wkładek na nowej płytce sześciodołkowej. Po opróżnieniu całego roztworu do przechowywania, przenieś wkładki do nowych studzienek, zawierających około sześciu mililitrów TBS na studzienkę przez trzy płukania przez pięć minut ze świeżymi TBS na płukanie na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości w temperaturze pokojowej. Po ostatnim myciu dodać siedem mililitrów świeżo przygotowanego blokującego roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki na 30-minutową inkubację na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji dodać jeden mililitr roztworu przeciwciała pierwotnego do jednej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej na wkładkę i przenieść wszystkie sekcje z każdej wkładki do odpowiedniej probówki o pojemności dwóch mililitrów. Następnie umieść rurki na obracającym się mikserze. Dodaj około siedmiu obrotów na minutę do całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego ranka należy przelać skrawki z każdej probówki do indywidualnych wkładów studzienkowych na nowej płytce sześciodołkowej i umyć sekcje dwa razy przez 30 sekund na mycie i jeden raz przez 10 minut w świeżych TBS na pranie. Po ostatnim przemyciu przenieść grupy skrawków do pojedynczych dwumililitrowych mikroprobówek wirówkowych, zawierających jeden mililitr odpowiedniego roztworu przeciwciał wtórnych na probówkę i inkubować próbki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji należy zdekantować skrawki do wkładek na nowej płytce sześciodołkowej i przemyć próbki dwa razy przez 30 sekund i jeden raz przez 15 minut w świeżych TBS na przemycie, chroniąc je przed światłem.Po ostatnim umyciu przelej sekcje do szklanej prostokątnej komory histologicznej, wypełnionej w trzech czwartych TBS i zanurz szklane szkiełko w TBS. W razie potrzeby za pomocą cienkiego pędzla i lampy powiększającej ostrożnie dokręć sekcje w kierunku szkiełka i delikatnie postukaj sekcją w szkiełko, upewniając się, że nie ma zmarszczek ani fałd. Po uchwyceniu wszystkich skrawków na szkiełku, pozostawić szkiełka do wyschnięcia na około 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, aż skrawki staną się nieprzezroczyste i nałożyć na nie odpowiedni wodny środek montażowy.Użyj pęsety, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na podłożu i użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby mocno docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby usunąć nadmiar medium. Skrawki można następnie zobrazować za pomocą odpowiedniego mikroskopu lub przechowywać w ciemnym pudełku z szkiełkami ustawionymi na cztery stopnie Celsjusza. Jak zaobserwowano na tych reprezentatywnych obrazach, fluorescencyjna analiza immunohistochemiczna przy użyciu metody swobodnego pływania może być przeprowadzona na skrawkach tkanki mózgowej myszy w celu zbadania ekspresji kwaśnych białek fibrylarnych glejowych.Podejście to jest również odpowiednie do ujawniania białek o niskiej ekspresji, takich jak GFP, w próbce mózgu transgenicznej myszy o niskiej ekspresji lub w niefluorescencyjnych protokołach barwienia histochemicznego, takich jak fiolet krezylowy. Inne tkanki obwodowe są również podatne na zastosowanie tej techniki bez konieczności modyfikacji, jak zaobserwowano w przypadku tych próbek tkanek wątroby o niskim poziomie ekspresji GFP. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w przypadku techniki swobodnego pływania, jest delikatność sekcji, szczególnie podczas przenoszenia i gdy próbki znajdują się na wytrząsarkach lub rotatorach.Oprócz barwienia immunofluorescencyjnego, metodę tę można łatwo zmodyfikować dla innych barwień histochemicznych, takich jak hematoksylina i eozyna oraz fiolet krezylowy lub dla immunohistochemii chromogenu.

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Poniższy film opisuje, jak zachować morfologię tkanki za pomocą utrwalania formaliny i zatapiania parafiny.

Konserwacja tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE): metoda badania morfologii tkanek

Tutaj demonstrujemy najbardziej efektywne metody zamrażania, osadzania, kriosekcji i barwienia biopsji mięśni, aby uniknąć artefaktów zamrażania.

Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Elektroniczne obrazowanie rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana to nowa platforma do wysoce multipleksowanego obrazowania białek opartych na epitopach. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny przewodnik obejmujący przygotowanie przeciwciał, barwienie próbki tkanki, montaż mikroskopu SRS i obrazowanie tkanek epr-SRS.

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Immunohistochemia (IHC) jest cenną techniką wykorzystywaną do lokalizacji/wizualizacji ekspresji białek w zamontowanym przekroju tkanki przy użyciu specyficznych ...

Immunohistochemia: skrawki w parafiniie z użyciem zestawu Vectastain ABC firmy Vector Labs

Opisujemy niezawodną metodę immunolokalizacji w obrębie naskórka, zmodyfikowaną zarówno dla przekrojów mrożonych, jak i parafiniowych, którą rutynowo stosujemy w naszym laboratorium.

Immunohistochemia na skrawkach parafiny naskórka mysiego z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych

Pełne genotypowanie próbki ogona myszy, obejmujące trawienie tkanki i odczyt PCR, wykonuje się w półtorej godziny przy użyciu zestawu Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR.

Szybkie genotypowanie tkanek mysich z wykorzystaniem zestawu Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Naucz się techniki swobodnie unoszącej się do immunohistochemii tkanek mózgu myszy. Ta metoda umożliwia uzyskanie grubszych skrawków, długoterminowe przechowywanie próbek i wykrywanie słabo ekspresjonowanych białek.

Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Przeglądaj więcej filmów