Name: Obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem kontrolowanych, niezlokalizowanych wibracji. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw zachowań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centrum Genetyki Caenorhabditis za dostarczenie szczepów użytych w tym badaniu. Publikacja została zrealizowana przy wsparciu finansowym JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), w ramach projektu "Obszary innowacyjne "Nauka o miękkim robocie" (nr grantu). JP18H05474), PRIME z Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (numer grantu 19gm6110022h001) oraz fundacji Shimadzu.

1. Hodowla robaków do momentu obrazowania wapnia
<ol>
	<li>Cztery dni przed eksperymentem obrazowania wapnia przenieś dwa dorosłe robaki ST12 na nową płytkę z pożywką wzrostową nicieni (NGM) (Tabela materiałów), na której Escherichia coli OP50 są prążkowane w kwadratowy wzór (około 4 mm x 4 mm) za pomocą rozsiewacza komórek, tak aby robak spędzał większość czasu w bakteriach podczas obrazowania wapnia12.</li>
	<li>Inkubować tę płytkę NGM przez 4 dni w temperaturze 20 °C w inkubatorze (tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Konfiguracja sprzętu
<ol>
	<li>Przygotuj mikroskop wyposażony w urządzenie piezoelektryczne do stymulacji13, soczewkę obiektywu 2x, szybką kamerę sCMOS, optykę z podziałem obrazu, zmotoryzowany stolik x-y, źródło światła LED do wzbudzenia i komputer (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Podstawowe specyfikacje kamery sCMOS obejmują aktywne piksele 2560 x 2160 o rozmiarze 6,5 μm, z 10-dotykowym łączem kamery jako opcją interfejsu. Kluczowe specyfikacje zmotoryzowanego stolika X-Y obejmują zakres ruchu 110 mm x 75 mm, maksymalną prędkość 250 mm/s, maksymalne przyspieszenie 2 000 mm/s2 i jednokierunkową powtarzalność 0,25 μm.</li>
	<li>Włącz komputer i zmotoryzowany kontroler stage x-y.</li>
	<li>Włącz amplifier i ustaw regulator głośności na 10, a regulator tonów niskich i wysokich na 8.</li>
	<li>Aby wzbudzić GCaMP i TagRFP, włącz światła 488 nm i 560 nm źródła światła LED. Ustaw wskaźniki 470 nm i 550 nm panelu kontrolnego w źródle światła na 5%, aby intensywność światła LED była odpowiednia do obrazowania. 
	UWAGA: Przy tej intensywności diody LED fotowybielanie fluorescencji GCaMP i TagRFP nie występuje podczas nagrywania.</li>
</ol>
3. Konfiguracja oprogramowania do obrazowania wapnia
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj trzy pakiety oprogramowania w systemie Windows: oprogramowanie makr myszy, oprogramowanie do kontrolowania właściwości drgań, oprogramowanie do uruchamiania oprogramowania śledzącego oraz oprogramowanie do analizy danych (tabela materiałów).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie plik oprogramowania śledzącego.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Uruchom i odczekaj 5 minut, aby ustabilizować oprogramowanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Podaj informacje o czasie naświetlania i binningu. Czas naświetlania 0,033 s z binningiem 2 x 2 zapewnia płynną akwizycję obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Wyświetlany jest tylko co10-ty uzyskany obraz w celu zmniejszenia obciążenia pamięci.</li>
	<li>Podaj informacje dotyczące akwizycji obrazu (Rysunek 2C). Na przykład, jeśli 500 obrazów zostanie zarejestrowanych dwukrotnie w interwale 10 s, wprowadź 1 000 w polu Suma obrazów, 500 w polu Obrazy i 10 w polu Interwał (s).</li>
	<li>Włącz przycisk Akwizycja (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Podziel obraz fluorescencyjny za pomocą układu optycznego dzielącego obraz i dwa obrazy (kanał GCaMP, 500-525 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E); TagKanał RFP, 584-676 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F)) są rzutowane na dwie połówki kamery sCMOS. Skalibruj współrzędne kanałów GCaMP i TagRFP (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G). Zapisz ustawienia oprogramowania.</li>
	<li>Ustaw katalog, w którym ma być wyprowadzany plik danych (Rysunek 2H).</li>
	<li>Wyłącz przycisk Akwizycja (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie na oprogramowanie systemowe makr myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) i ustaw właściwości wibracji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Odczytaj plik Assay.txt za pomocą systemu makr myszy, tak aby kursor myszy był sterowany na podstawie współrzędnych i harmonogramu w tym pliku (Rysunek 3A). Ustaw współrzędne kursora myszy (purpurowe kwadraty w <silna klasa="xfig">Rysunek 3A) i poczekaj czas na stymulację po rozpoczęciu nagrywania (magenta w <silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Ustaw wartości częstotliwości i amplitudy w oprogramowaniu do kontroli drgań (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
</ol>
4. Przygotowanie robaków do obrazowania wapnia
<ol>
	<li>Przenieść pojedynczego robaka wykazującego ekspresję zarówno GCaMP, jak i TagRFP z inkubowanej płytki na nową świeżą płytkę NGM, na której umieszczono prążki E. coli OP50.</li>
	<li>Przymocuj płytkę NGM do piezoelektrycznego przetwornika akustycznego za pomocą przezroczystej taśmy klejącej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Nie należy dociskać płytki do siłownika, ponieważ zmienia to częstotliwość wibracji.</li>
</ol>
5. Obrazowanie wapnia pod kontrolą określonych właściwości drgań
<ol>
	<li>Włącz przycisk Akwizycja (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Znajdź robaka w jasnym świetle i świetle wzbudzenia (488 nm i 560 nm).</li>
	<li>Ustaw wartość powiększenia mikroskopii na 2,5x. Pole widzenia wynosi 1,1 mm x 1,1 mm przy rozdzielczości 2,6 μm/piksel.</li>
	<li>Wyłącz jasne światło i włącz przycisk Homing (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I), aby śledzić fluorescencyjną plamkę robaka. Ten przycisk bazowania rozpoczyna ruch stolika X-Y, aby utrzymać obszar maksymalnej intensywności robaka w środku pola widzenia na obrazie TagRFP. 
	UWAGA: Jeśli chodzi o promotor flp-18, intensywność fluorescencji neuronów AVA jest najsilniejsza, a te z innych neuronów są słabe lub nie są wykrywane. W związku z tym system małego powiększenia nie jest wymagany do śledzenia, a stolik porusza się przez cały czas trwania nagrania.</li>
	<li>Upewnij się, że wartości słupków intensywności w <silna klasa="xfig">Rysunek 2E i 2F wynoszą około 1,000. Jeśli tak nie jest, dostosuj wskaźniki 470 nm i 550 nm panelu kontrolnego w źródle światła.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Uruchom w systemie makr myszy, aby umożliwić sterowanie kursorem myszy zgodnie z harmonogramem opisanym w Rysunek 3A. Zaczyna się nagrywanie za pomocą oprogramowania śledzącego i stymulowanie przez oprogramowanie genów fal podczas śledzenia robaka.</li>
	<li>Sprawdź, czy wyjściowy plik BMP został prawidłowo utworzony.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Utwórz folder na pulpicie i nazwij go CalciumImaging.</li>
	<li>Utwórz folder w folderze CalciumImaging i nadaj mu nazwę CIResult, aby uzyskać wyjściowe pliki wyników.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie plik DualViewImaging.nb napisany w oprogramowaniu do analizy danych dla systemu Windows.</li>
	<li>Wstaw ścieżkę do pliku do folderu CIResult (np. DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Rysunek 5).</li>
	<li>Wstaw ścieżkę do folderu zawierającego plik BMP (np. SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Rysunek 5), w którym XXX oznacza nazwę folderu zawierającą pliki BMP.</li>
	<li>Naciśnij jednocześnie Shift i Return, aby rozpocząć automatyczną analizę. W tej analizie wykorzystano wartość obszaru pola widzenia o maksymalnej intensywności na obrazie TagRFP (patrz legenda Rysunek 6, aby zapoznać się ze szczegółową procedurą obliczeniową w programie).</li>
	<li>Sprawdź, czy następujące pliki wyjściowe zostały prawidłowo utworzone w folderze CIResult. 
	XXX-GCaMP.tif (plik graficzny ilustrujący ślady intensywności GCaMP dla wszystkich obrazów) 
	XXX-GCaMP.xls (plik arkusza kalkulacyjnego z listą intensywności GCaMP na wszystkich obrazach) 
	XXX-TagRFP.tif (plik graficzny ilustrujący ślady intensywności TagRFP dla wszystkich obrazów) 
	XXX-TagRFP.xls (plik arkusza kalkulacyjnego z listą intensywności TagRFP na wszystkich obrazach) 
	XXX-Ratio.tif (plik graficzny ilustrujący ślady wartości współczynnika dla wszystkich obrazów) 
	XXX-Ratio.xls (plik arkusza kalkulacyjnego z wartością współczynnika na wszystkich obrazach)</li>
</ol>

<ol><li>Hill, P. S. M., Wessel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotremology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Biotremology.</a> Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).</li>
<li>Fettiplace, R., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+motor+roles+of+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and motor roles of auditory hair cells.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).</li>
<li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).</li>
<li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+force%3A+physical+and+physiological+principles+enabling+sensory+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).</li>
<li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+circuit+for+touch+sensitivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).</li>
<li>Wicks, S. R., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integration+of+antagonistic+reflexes+revealed+by+laser+ablation+of+identified+neurons+determines+habituation+kinetics+of+the+Caenorhabditis+elegans+tap+withdrawal+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response.</a> Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).</li>
<li>Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+model+system+for+the+study+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory.</a> Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).</li>
<li>Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+plasticity+in+a+Caenorhabditis+elegans+mechanosensory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit.</a> Frontiers in Physiology. 4, 88(2013).</li>
<li>Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+optical+quantification+of+mechanosensory+habituation+reveals+neurons+encoding+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+mechanical+stimulation+method+for+quantifying+C.+elegans+mechanosensory+behavior+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%3A+The+International+Journal+of+the+Japan+Society+for+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory.</a> Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).</li>
<li>Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressional+and+surface+waves+in+sand%3A+used+by+desert+scorpions+to+locate+prey%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey.</a> Science. 197 (4302), 479-482 (1977).</li>
<li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).</li>
<li>Tsukada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+spatial+thermal+gradient+encoded+in+thermosensory+neuron+AFD+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).</li>
<li>Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+circuits+and+synaptic+mechanisms+underlying+motor+initiation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans.</a> Cell. 147 (4), 922-933 (2011).</li>
<li>Nguyen, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+calcium+imaging+with+cellular+resolution+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).</li>
<li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11, 727-730 (2014).</li>
<li>Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+brain+state+underlies+C.+elegans+sleep+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global brain state underlies C. elegans sleep behavior.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li>
<li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ogólnie rzecz biorąc, kwantyfikacja aktywności neuronalnej wymaga wprowadzenia sondy i/lub ograniczeń ruchów ciała zwierzęcia. Jednak w przypadku badań nad zachowaniami mechanosensorycznymi inwazyjne wprowadzenie sondy i ograniczenia same w sobie stanowią bodźce mechaniczne. C. elegans dostarcza system do obejścia tych problemów, ponieważ jego cechy są przezroczyste i ponieważ ma prosty, zwarty obwód neuronowy składający się tylko z 302 neuronów. Łącząc te zalety z wcześniej opracowaną metodą wywoływania niezlok...

Zwierzęta są często narażone na niezlokalizowane bodźce mechaniczne, takie jak wibracje czy fale akustyczne1,2. Ponieważ te bodźce wpływają na homeostazę, rozwój i reprodukcję, zwierzęta muszą modyfikować swoje zachowania, aby sobie z nimi poradzić3,4,5. Jednak obwody neuronalne i mechanizmy leżące u podstaw takiej modyfikacji zachowania są słabo poznane.
Mechanosensoryczne zachowanie nicieni, Caenorhabditis elegans, to prosty paradygmat behawioralny, w którym robaki zwykle zmieniają zachowanie z ruchu do przodu na reakcję ucieczki do tyłu, gdy napotkają niezlokalizowane wibracje6. Obwód neuronalny leżący u podstaw tego zachowania składa się głównie z pięciu neuronów czuciowych, czterech par interneuronów i kilku typów neuronów ruchowych7,8. Dodatkowo, robaki przyzwyczajają się do takich bodźców mechanicznych po treningu w odstępach czasu obejmującym powtarzającą się stymulację9,10,11. Dlatego ta prosta reakcja behawioralna stanowi idealny system do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw zarówno niezlokalizowanego zachowania wywołanego wibracjami, jak i pamięci. Przedstawiono protokół obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się robaków pod wpływem drgań niezlokalizowanych. W porównaniu z wcześniej zgłaszanymi systemami, ten system jest prosty, ponieważ nie wymaga dodatkowej kamery do śledzenia; Pozwala nam jednak zmienić częstotliwość, przemieszczenie i czas trwania niezlokalizowanych wibracji. Ponieważ aktywacja interneuronów AVA indukuje reakcję ucieczki wstecznej, jako przykład użyto robaków współeksprymujących GCaMP, wskaźnik wapnia i TagRFP, niewrażliwe na wapń białko fluorescencyjne, pod kontrolą promotora specyficznego dla AVA (szczegóły w Tabeli materiałów). Protokół demonstruje aktywację neuronów AVA, gdy robak przełącza się z ruchu do przodu na ruch do tyłu. Protokół ten ułatwia zrozumienie mechanizmu obwodu neuronalnego leżącego u podstaw zachowań mechanosensorycznych.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DualViewImaging.nb</td><td>autor</td><td></td><td>Do analizy pozyskanych danych</td></tr><tr><td>Mathematica12</td><td>Wolfram</td><td></td><td>Do uruchamiania oprogramowania do analizy danych DualViewImaging</td></tr><tr><td>Escherichia coli i C. elegans szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>Pokarm dla C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.</td></tr><tr><td>lite-1(ce314) szczep</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>KG1180</td><td>Niewrażliwy na światło zmutowany</td></tr> <tr><td>szczeplite-1(ce314) eksprymujący NLS-GCaMP-NLS i TagRFP pod kontrolą autora promotora specyficznego dla AVA</td><td></td>, mutanta <td>ST12</td><td>lite-1(ce314) przenoszącego geny eksprymujące NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; sygnał lokalizacji jądrowej) i TagRFP pod kontrolą promotor flp-18 jako układ pozachoromosomalny</td></tr> <tr><td>Laserowy wibrometr dopplerowski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lase Wibrometr dopplerowski</td><td>Polytec Japan</td><td>IVS-500</td><td>Do określania ilościowego&nbsp; częstotliwości i przemieszczenia generowanych przez przetwornik akustyczny</td></tr><tr><td>Mouse macrosystem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay.txt</td><td>Autor</td><td></td><td>Skrypt do czasowego i specjalnego sterowania cursol myszy w systemie Windows</td></tr><tr><td>HiMacroEx</td><td>Vector</td><td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td><td>Darmowe oprogramowanie do pobrania do sterowania kursorem myszy na podstawie płytki do wzrostu skrypty</td></tr><tr><td>Nematode growth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar oczyszczony, proszek</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td>Dla przygotowanie płytek NGM</td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td> Do <td>przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Wako</td><td>036-00485</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Wako</td><td>034-03002</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>wodorofosforan di-Photassium</td><td>Nakarai tesque</td><td>28727-95</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Rosół LB, Lennox</td><td>Nakarai tesque</td><td>20066-95</td><td>Do hodowli E. coli OP50</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu bezwodny</td><td>TGI</td><td>M1890</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Nakarai tesque</td><td>28720-65</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Nakarai tesque</td><td>31320-05</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (60 mm)</td><td>Nunc</td><td>150270</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td><silne>Niezlokalizowane urządzenie wibracyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>LEPY</td><td>LP-A7USB</td><td>Do stymulacji z kontrolowanymi wibracjami</td></tr><tr><td>Przetwornik akustyczny</td><td>MinebeaMitsumi</td><td>LVC25</td><td>Do stymulacji za pomocą kontrolowanych wibracji</td></tr><tr><td>WaveGene Ver. 1.5</td><td>Thrive</td><td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td><td>Bezpłatne oprogramowanie do pobierania do kontrolowania właściwości wibracji</td></tr> <tr><td>< silny> Nieinwazyjne obrazowanie wapnia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-kanałowy stacjonarny 3-fazowy bezszczotkowy sterownik serwo DC</td><td>Sterownik kompatybilny z Thorlabs</td><td>BBD202</td><td>do stopni MLS203-1</td></tr><tr><td>479/585 nm BrightLine dwuzakresowy filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-479/585-25</td><td>Do akwizycji obrazów dwukanałowych (GCaMP i TagRFP)</td></tr><tr><td>505/606 nm BrightLine dwukrawędziowy standardowy epi-fluorescencyjny dichroiczny beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF505/606-Di01-25x36</td><td>Do akwizycji obrazów dwukanałowych (GCaMP i TagRFP)</td></tr><tr><td>512/25 nm Jednopasmowy filtr pasmowoprzepustowy BrightLine</td><td>Semrock</td><td>FF01-512/25-25</td><td>Do akwizycji obrazów dwukanałowych (GCaMP i TagRFP)</td></tr><tr><td>Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine 630/92 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-630/92-25</td><td>Do akwizycji obrazów dwukanałowych (GCaMP i TagRFP)</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell</td><td>Precision T7600</td><td>Windows7 z procesorem Intel Xeon ES-2630 i 8 GB pamięci RAM</td></tr><tr><td>Szybki stopień zmotoryzowany x-y</td><td>Thorlabs</td><td>MLS203-1</td><td>Szybki stolik skanujący XY</td></tr><tr><td>Optyka dzieląca obraz</td><td>Hamamatsu photonics</td><td>A12801-01</td><td>Do akwizycji obrazów dwukanałowych (GCaMP i TagRFP) generowanych przez W-VIEW GEMINI Optyka dzieląca obraz</td></tr><tr><td>Źródło światła LED</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td>Do generowania światła wzbudzającego 470 nm i 560 nm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Kamera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Zyla</td><td></td></tr><tr><td>x 2 Soczewka obiektywowa</td><td>Olympus</td><td>MVPLAPO2XC</td><td>Odległość robocza 20 mm i numeryczna apertura 0,5</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKDK66 autor plazmidu</td><td></td><td>pKDK66</td><td>Marker koiniekcyjne</td></tr><tr><td>pTAK83 autor plazmidu</td><td></td><td>pTAK83</td><td>Plazmid do ekspresji TagRFP pod kontrolą&nbsp; promotor flp-18 promotor</td></tr><tr><td>pTAK144 autor plazmidu</td><td></td><td>pTAK144</td><td>Plazmid do ekspresji NLS-GCaMP5G-NLS pod kontrolą&nbsp; flp-18 promotor</td></tr><tr><td>Tracking software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homingback.vi</td><td>autor</td><td></td><td>Plik SubVi do śledzenia fluorescencji robaka poprzez sterowanie zwrotne kamery sCMOS i zmotoryzowanego stolika x-y</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>Instrumenty krajowe</td><td></td><td>Do uruchamiania oprogramowania śledzącego</td></tr><tr><td>Zyla Control ver.2.6CI.vi</td><td>autor</td><td></td><td>Do śledzenia fluorescencyjnej plamki robaka poprzez sterowanie ze sprzężeniem zwrotnym kamery sCMOS i zmotoryzowanego stolika x-y</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Niezlokalizowane siły mechaniczne, takie jak wibracje i fale akustyczne, wpływają na szeroką gamę procesów biologicznych, od rozwoju do homeostazy. Zwierzęta radzą sobie z tymi bodźcami, modyfikując swoje zachowanie. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw takiej modyfikacji behawioralnej wymaga ilościowego określenia aktywności neuronalnej podczas interesującego nas zachowania. W tym miejscu przedstawiamy metodę obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z niezlokalizowanymi drganiami o określonej częstotliwości, przemieszczeniu i czasie trwania. Metoda ta pozwala na wytwarzanie dobrze kontrolowanych, niezlokalizowanych drgań za pomocą przetwornika akustycznego i kwantyfikację wywołanych odpowiedzi wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jako dowód zasadniczy wykazano odpowiedź wapniową pojedynczego interneuronu, AVA, podczas reakcji ucieczki C. elegans na wibracje. System ten ułatwi zrozumienie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw reakcji behawioralnych na bodźce mechaniczne.

W tym przypadku przykładem obrazowania wapnia u swobodnie poruszających się C. elegans jest nicień wykazujący ekspresję zarówno GCaMP, jak i TagRFP pod kontrolą promotora specyficznego dla interneuronów AVA. Dane z kanałów GCaMP i TagRFP uzyskano w postaci serii obrazów, z których część przedstawiono na Rysunku 6 oraz w formie filmu (Supplemental Movie 1). Ilościowo określono również przemieszczenie szalki Petriego wywołane przez nasz system wibracji nielokalnych (<...

Zgłoszono tutaj system do obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami. System ten pozwala naukowcom na wywoływanie niezlokalizowanych wibracji o dobrze kontrolowanych właściwościach przy przemieszczeniu w skali nano oraz na ilościowe określenie prądów wapniowych podczas reakcji C. elegans na wibracje.

Obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Nasz system pozwala naukowcom na wywoływanie niezlokalizowanych wibracji o dobrze kontrolowanych właściwościach przy nieskalowanym przemieszczeniu oraz na ilościowe określenie prądu wapnia podczas reakcji czynników drażniących na wibracje. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy nieinwazyjnie badać mechanizmy neuronalne, leżące u podstaw mechanizmów zachowania. Przygotuj nową pożywkę do hodowli nicieni lub płytkę NGM, na której Escherichia coli OP50 jest prążkowana w kwadratowy wzór za pomocą rozsiewacza komórek, tak aby robak spędzał większość czasu w bakteriach podczas obrazowania wapnia.Cztery dni przed eksperymentem obrazowania wapnia przenieś dwa dorosłe robaki ST12 na płytkę i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza na cztery dni. Wykonaj obrazowanie wapnia za pomocą mikroskopu wyposażonego w przetwornik akustyczny do stymulacji, soczewkę obiektywu 2x, szybką kamerę CMOS, optykę dzielącą obraz. Włącz komputer precyzyjny w zmotoryzowanym kontrolerze stage X Y.Następnie włącz wzmacniacz i ustaw regulator głośności na 10 w podstawie, a regulatory tonów wysokich na osiem. Aby wzbudzić GCaMP i oznaczyć zapytanie ofertowe, włącz światła 488 i 560 nanometrów źródła światła LED. Ustaw wskaźniki 470 i 550 nanometrów panelu kontrolnego w źródle światła na 5%, aby intensywność światła LED była odpowiednia do obrazowania.Pobierz i zainstaluj następujące pakiety oprogramowania i okna. Oprogramowanie makr myszy, oprogramowanie do kontroli drgań, oprogramowanie do śledzenia biegów i oprogramowanie do analizy danych. Kliknij dwukrotnie plik oprogramowania śledzącego, a następnie ustaw czas ekspozycji na 0,033 sekundy i binowanie do dwóch na dwa, aby zapewnić płynne pozyskiwanie obrazu.Kliknij przycisk uruchamiania i poczekaj pięć minut, aby ustabilizować oprogramowanie. Wprowadź informacje w celu uzyskania obrazu. Na przykład, aby zarejestrować 500 obrazów bez interwału, wprowadź 500 w polu sumy obrazów, 500 w polu obrazów i zero w polu interwałów.Po włączeniu przycisku akwizycji należy podzielić obraz fluorescencyjny za pomocą optyki dzielącej obraz, rzutując kanał GCaMP i kanał RFP tagu na dwie połówki kamery CMOS. Skalibruj współrzędne GCaMP i oznacz kanały RFP oraz zapisz ustawienia. Następnie ustaw katalog tak, aby wyprowadzał plik danych i wyłącz pobieranie.Przeczytaj test. plik tekstowy z systemem makr myszy, aby kursor myszy był sterowany na podstawie współrzędnych i harmonogramu w tym pliku i kliknij dwukrotnie plik oprogramowania w celu kontroli wibracji. Ustaw współrzędne kursora myszy w czasie oczekiwania na stymulację po rozpoczęciu nagrywania, a następnie ustaw wartości częstotliwości i amplitudy w oprogramowaniu do kontroli wibracji.Przenieś pojedynczego robaka wyrażającego zarówno GCaMP, jak i znacznik RFP z inkubowanej płytki na świeżą płytkę NGM, na której E. coli OP50 została prążkowana. Przymocuj płytkę NGM do przetwornika akustycznego za pomocą przezroczystej taśmy klejącej. W przypadku obrazowania wapnia włącz przycisk akwizycji i znajdź robaka w 2,5-krotnym powiększeniu.Ustaw pole widzenia na 1,1 na 1,1 milimetra z rozdzielczością 2,6 mikrona na piksel. Wyłącz jasne światło i kliknij przycisk bazowania, aby śledzić fluorescencyjną plamkę robaka, która inicjuje ruch stopnia XY, aby utrzymać obszar maksymalnej intensywności robaka w środku pola widzenia na obrazie zapytania ofertowego tagu. Upewnij się, że wartości intensywności wynoszą około 1000.Jeśli nie, dostosuj wskaźniki 470 i 550 nanometrów panelu kontrolnego w źródle światła. Naciśnij przycisk uruchamiania w systemie makr myszy, aby zezwolić na sterowanie kursorem myszy, i sprawdź, czy wyjściowy plik BMP został prawidłowo utworzony. Do analizy danych utwórz folder na pulpicie i nazwij go Obrazowanie wapnia"następnie utwórz folder w folderze Obrazowanie wapnia i nazwij go Wynik CI dla plików wyników wyjściowych.Kliknij dwukrotnie obrazowanie w podwójnym widoku. MB zapisany w oprogramowaniu do analizy danych, a ścieżki plików wstaw do folderu wyników CI w folderze z plikiem BMP. Naciśnij jednocześnie Shift i Return, aby rozpocząć automatyczną analizę, która wykorzystuje wartość obszaru maksymalnej intensywności na obrazie zapytania ofertowego tagu.Na koniec sprawdź, czy pliki wyjściowe są odpowiednio utworzone w folderze wyników CI. W analizie reprezentatywnej dane GCaMP i kanału RFP tagów uzyskano w postaci serii obrazów. Określono również ilościowo przemieszczenie szalki Petriego wywołane przez niezlokalizowany układ wibracyjny.Przemieszczenie można kontrolować, ustawiając wartość amplitudy w oprogramowaniu do kontroli drgań oraz regulatora głośności i wzmacniacza. Natomiast częstotliwość można regulować, ustawiając wartość częstotliwości w oprogramowaniu. Przejściową odpowiedź wapniową neuronów AVA zaobserwowano po stymulacji wibracjami o częstotliwości 630 Hz i przemieszczeniu około 4,5 mikrometra na sekundę, co wskazuje, że neuron Ava został aktywowany podczas wstecznej odpowiedzi robaka na niezlokalizowaną stymulację.W naszej procedurze możemy określić ilościowo tylko jeden neuron. Jednak system ten można również połączyć z metodą obrazowania biometrycznego w celu nieinwazyjnego określenia ilościowego wielu neuronów, a nawet całego mózgu.

calcium-imaging-freely-behaving-caenorhabditis-elegans-with-well

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Kolce dendrytyczne są ważnymi cechami komórkowymi układu nerwowego. W tym miejscu opisano metody obrazowania na żywo służące do oceny struktury i funkcji kolców dendrytycznych u C. elegans. Podejścia te wspierają rozwój zmutowanych badań przesiewowych dla genów, które definiują kształt lub funkcję kolców dendrytycznych.

Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Poznaj metodę obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem kontrolowanych, niezlokalizowanych wibracji. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw zachowań.

Obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami

Przeglądaj więcej filmów