Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

BMEC wygenerowane z iPSC dostarczają nowych modeli eksperymentalnych do badania funkcji i dysfunkcji bariery krew-mózg. Wykorzystaliśmy ten protokół do zbadania, czy BMEC zachowują swoje właściwości barierowe po ekspansji i krioprezerwacji. Technika ta umożliwia generowanie specyficznych dla choroby BMEC od pacjentów z zaburzeniami, w których przerwanie bariery krew-mózg odgrywa rolę w patofizjologii choroby.

Aby indukować różnicowanie BMEC od ludzkich iPSC, należy przemyć zlewającą się kulturę iPSC jednokrotnie DPBS przed inkubacją komórek z odpowiednią objętością enzymatycznego EDTA przez około pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki, należy zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK do liczenia. Rozcieńczyć komórki do 1,56 razy 10 do czwartej komórki na centymetr sześcienny stężenia i umieścić dwa mililitry komórek w pojedynczych dołkach o sześciodołkowym płaskim dnie.

Po 24 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp supernatant w każdym dołku pożywką E6 i włóż płytkę do inkubatora na kolejne cztery dni. Aby oczyścić BMEC pochodzące z iPSC, pokryj płytki hodowlane odpowiednią objętością świeżo przygotowanego roztworu kolagenu IV i fibronektyny na dołek i inkubuj płytki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W szóstym dniu różnicowania zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w odpowiedniej objętości świeżej pożywki wolnej od ludzkiej surowicy śródbłonka, uzupełnionej witaminą B27, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i kwasem retinowym.

W celu analizy TEER umieść zróżnicowane komórki w każdym dołku pokrytej kolagenem i fibronektyną płytki z filtrem 12-transwell. W celu analizy aktywności transportera wypływu umieść komórki w każdym dołku 24-dołkowej płaskiej płytki dolnej pokrytej kolagenem i fibronektyną. Po 24 godzinach subhodowli zastąp supernatant w każdym dołku świeżą pożywką bez ludzkiej surowicy śródbłonka, uzupełnioną tylko suplementem B27.

Aby zmierzyć właściwości bariery krew-mózg BMEC za pomocą TEER, naładuj instrument TEER przez noc i delikatnie przetrzyj elektrody instrumentu i pałeczek 70% etanolem przed umieszczeniem ich w kapturze bezpieczeństwa. Włącz zasilanie i skalibruj omomierz zgodnie ze specyfikacją producenta. Podłącz elektrody i przepłucz je raz 70% etanolem, a drugi raz DPBS.

Umieść krótszy koniec elektrody w nietypowej komorze wkładu, a dłuższy koniec w komorze podstawno-bocznej studni ślepej. Po zmierzeniu odpowiedzi kontroli ujemnej szybko przepłucz elektrody, jak pokazano, i zmierz pierwszą studzienkę doświadczalną. Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów ponownie wypłucz elektrody pałeczek, delikatnie wytrzyj elektrody i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze bezpieczeństwa.

Aby ocenić aktywność transportera wypływu komórek, w ósmym dniu hodowli potraktuj odpowiednią liczbę studzienek 10 mikromolowym roztworem inhibitora transportera wypływu i umieść w inkubatorze na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy potraktować komórki 10-mikromolowym roztworem substratu transportera wypływu przez jedną godzinę w inkubatorze. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 500 mikrolitrami DPBS na studzienkę, a następnie poddać komórki lizie za pomocą 500 mikrolitrów DPBS uzupełnionych 5% Triton-X na studzienkę.

Po pięciu minutach użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć fluorescencję zlizowanych komórek przy wzbudzeniu 485 nanometrów i emisji 530 nanometrów. W przypadku studzienek, które nie są używane w teście transportera, należy dwukrotnie przemyć komórki DPBS przed utrwaleniem 4% paraformaldehydem na jądra komórkowe. Po jednym dniu hodowli w pożywce E6 morfologia komórek jest podobna do morfologii iPSC.

Czwartego dnia komórki wyraźnie odróżniają się od iPSC i pokrywają większość studni. Dwudniowa hodowla w pożywce wolnej od surowicy śródbłonka ludzkiego wywołuje w komórkach wydłużony i brukowany wygląd. Ósmego dnia pojedyncze komórki tworzą w większości duży wzór bruku.

Można przeprowadzić test kiełkowania, aby wykazać potencjał angiogenny BMEC pochodzących z iPSC. Prowadzi to do rozwoju struktur przypominających rurki po trzech dniach leczenia czynnikiem wzrostu. BMEC pochodzące z iPSC wygenerowane przy użyciu tego protokołu ulegały koekspresji białek połączeń ścisłych ulegających ekspresji w komórkach śródbłonka w mózgu, płucach, wątrobie i nerkach, a także markerów śródbłonka naczyń krwionośnych ulegających ekspresji w barierze krew-mózg.

Jak zaobserwowano, 48 godzin po subkulturze i zmianie pożywki BMEC pochodzące z iPSC wykazują wartości TEER w zakresie opisanym dla BMEC pochodzących z iPSC, które były hodowane wspólnie z pierwotnymi astrocytami szczurów. Na tym etapie zaobserwowano również aktywność transportera wypływu. Po krioprezerwacji, pomiary TEER są niższe w porównaniu ze świeżo uzyskanymi BMEC.

Analiza Western blot ujawnia obniżony poziom markerów połączeń ścisłych, takich jak okludyna, podczas gdy immunocytochemia pokazuje piegowate i/lub postrzępione wzory białek połączeń ścisłych. Zbyt wysoka lub zbyt niska gęstość iPSC wpłynie na efektywność różnicowania i wpłynie na rozwój odpowiednich właściwości bariery krew-mózg. Metoda ta umożliwia badanie właściwości bariery, sygnalizacji komórkowej i aktywności transportera przy użyciu zindywidualizowanych BMEC do modelowania fizjologii i patofizjologii funkcji bariery krew-mózg.