Name: Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj protokół różnicowania i kriokonserwacji komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu z ludzkich iPSC. Ta metoda umożliwia badanie funkcji bariery krew-mózg w modelach chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (dla R.K.), National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). Nagroda National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (dla R.K.), grant Fundacji Sydney R Baer Jr (dla P.L.) Nagroda Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (dla R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (do R.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (do R.K.), Harvard Stem Cell Institute (do R.K.) oraz przez Steve'a Willisa i Elissę Freud (do R.K.). Dziękujemy dr Annie Kathurii za jej krytyczną lekturę i opinie na temat rękopisu.

Ludzkie iPSC zostały przeprogramowane z fibroblastów zdrowych dawców przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital i McLean Hospital, i scharakteryzowane zgodnie z opisem w poprzednich badaniach44,45,46.
UWAGA: Krótko mówiąc, fibroblasty zostały przeprogramowane do iPSC za pomocą genetycznego przeprogramowania opartego na mRNA47. iPSC utrzymywano w pożywce z komórek macierzystych (SCM) (patrz lista materiałów) i przechowywano w gęstości ~1,2 x 102 komórek/ml z 1 ml SCM, 10 μM z inhibitorem kinazy białkowej związanej z rho (ROCKi) Y-27632 i 10% (v/v) siarczkiem dimetylu (DMSO), w kriokonserwowanych fiolkach w ciekłym azocie w temperaturze -160 °C. Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Rozcieńczanie matrycy membrany podstawowej i powlekanie płyty
<ol>
	<li>Rozcieńczony (1:50) czynnik wzrostu zmniejszył macierz błony podstawnej oczyszczony z guza Engelbreth-Holm-Swarm w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) bez czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Pokryć płytki do hodowli komórkowych odpowiednią ilością rozcieńczonej matrycy błony podstawnej (tj. płytka 6-dołkowa = 1 ml, płytka 12-dołkowa = 0,5 ml) i inkubować te płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
</ol>
2. Konserwacja iPSC
UWAGA: Maksymalna konfluencja na dołek w 6-dołkowej płycie z płaskim dnem wynosi ~1,2 x 106 komórek.
<ol>
	<li>Rozmrozić kriokonserwowane iPSC do SCM za pomocą 10 μM Y-27632 i płytkę na 6-dołkowej płytce pokrytej rozcieńczoną matrycą błony podstawnej zredukowanej przez czynnik wzrostu.</li>
	<li>Utrzymuj iPSC w SCM za pomocą 10 μM Y-27632 przez pierwsze 24 godziny po rozmrożeniu. Przełącz się na świeże podłoże po 24 godzinach.</li>
	<li>Utrzymuj iPSC w SCM, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji przed pasażacją.
	<ol>
		<li>Oblicz, ile iPSC będzie potrzebnych do różnicowania, mnożąc pożądaną gęstość do różnicowania (15 600 komórek/cm2) przez powierzchnię studzienki. W przypadku 6-dołkowej płytki z płaskim dnem pomnóż 15 600 komórek/cm2 przez 9,6cm2, co daje w sumie 149 760 komórek/studzienkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przejść, umyj komórki zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBBS). Następnie inkubować komórki z nieenzymatycznym kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (patrz wykaz materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie podnieść komórki. Zbierz komórki w świeżym SCM.</li>
		<li>Umieść komórki na płytkach do hodowli komórkowych pokrytych rozcieńczonym SCM i utrzymuj komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3 lub przechowuj je w temperaturze ~1,2 x 106 komórek/ml w 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 i 10% DMSO (v/v) w kriokonserwowanych fiolkach w ciekłym azocie w temperaturze -160 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Różnicowanie iPSC do BMEC
UWAGA: Nieenzymatyczne EDTA rozdziela komórki na grudki. Enzymatyczne EDTA (patrz tabela materiałów) rozdziela komórki na zawiesinę jednokomórkową. Kwas retinowy (RZS) należy chronić przed światłem.
<ol>
	<li>Jednokrotne umycie iPSC solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (DPBS) firmy Dulbecco. Inkubować z enzymatycznym EDTA (1 ml dla płytki 6-dołkowej, 0,5 ml dla płytki 12-dołkowej i 0,25 ml dla płytki 24-dołkowej) przez około 5 minut w temperaturze 37 °C, aby otrzymać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Zebrać komórki i odwirować przy 300 x g (względna siła odśrodkowa) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osady komórkowe w SCM zawierające 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Określ gęstość komórek za pomocą Trypan Blue i automatycznego licznika komórek lub urządzenia do hemocytometru. Komórki płytkowe o gęstości 15 600 komórek/cm2 lub 149 760 komórek/basenik 6-dołkowej płytki o płaskim dnie (o powierzchni 9,6cm2/studzienkę) w SCM zawierającym 10 μM Y-27632 przez 24 godziny.</li>
	<li>Rozpocznij różnicowanie po 24 godzinach, zmieniając pożywkę SCM na E6. Zmieniaj pożywkę E6 codziennie przez następne 4 dni.</li>
	<li>W 4 dniu różnicowania zastąp pożywkę E6 hESFM uzupełnioną rozcieńczonym (1:200) suplementem B27, 20 ng / ml bFGF i 10 μM RA. Nie zmieniaj tego podłoża przez następne 48 godzin.</li>
	<li>Przygotować 200 ml hESFM z rozcieńczoną (1:200) witaminą B27, wymieszać 1 ml 50x skoncentrowanego suplementu B27 ze 199 ml hESFM.</li>
	<li>Przygotować 20 ng/ml bFGF, rozpuszczając 50 μg bFGF w 250 μl buforu Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) w celu uzyskania 200 μg/ml roztworu podstawowego. Przygotować 200 ml hESFM zawierającego 20 ng/ml bFGF, mieszając 20 μl 200 μg/ml bFGF z 200 ml hESFM.</li>
	<li>Przygotować 10 μM RA, najpierw sporządzając 40 mg/ml roztworu podstawowego RA, dodając 2,5 ml DMSO do 100 mg proszku RA. Rozcieńczyć to stężenie do 3 mg/ml w celu uzyskania 10 mM roztworu podstawowego. Przygotować 200 ml hESFM zawierającego 10 μM RZS, mieszając 200 μL 10 μM RA w 200 ml hESFM.</li>
</ol>
4. Kolagen powlekany IV (COL4) i matryca fibronektyny (FN) do oczyszczania BMEC pochodzącego z iPSC
<ol>
	<li>Dodać 2 ml sterylnej wody do 2 mg FN, aby uzyskać 1 mg/ml roztworu podstawowego FN. Dodać 5 ml sterylnej wody do 5 mg COL4, aby uzyskać roztwór podstawowy COL4 o stężeniu 1 mg/mL.
	<ol>
		<li>Pozostawić FN do rozpuszczenia przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C, a COL4 do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy FN w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 100 μg/ml, a roztwór podstawowy COL4 do końcowego stężenia 400 μg/ml.</li>
	<li>Pokryj żądane płytki (płytka 6-dołkowa = 1 ml roztworu COL4/FN, płytka 12-dołkowa = 0,5 ml, płytka 24-dołkowa = 0,25 ml i płytka 12-transwell z filtrem = 0,25 ml) mieszaniną 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN.</li>
	<li>Inkubować płytki przez co najmniej 2 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C; w przypadku płytek z filtrem Transwell zaleca się co najmniej 4 godziny.</li>
</ol>
5. Subkultura i oczyszczanie BMEC pochodzących z iPSC
UWAGA: Inkubacja z enzymatycznym EDTA może trwać dłużej niż 15 minut, w zależności od zbiegu komórek w 6 dniu różnicowania.
<ol>
	<li>W 6 dniu różnicowania przemyć komórki dwukrotnie DPBS. Inkubować z 1 ml enzymatycznego EDTA przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.</li>
	<li>Zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić granulki komórkowe świeżym hESFM z rozcieńczonym (1:200) suplementem B27, 20 ng / ml bFGF i 10 μM RA.</li>
	<li>Komórki nasienne na płytkach pokrytych mieszaniną 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN. Komórki nasienne przy użyciu stosunku 1 dołka płytki 6-dołkowej do 3 dołków płytki 12-dołkowej, 3 dołków płytki 12-dołkowej lub 6 dołków płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Zasiaj niezróżnicowane iPSC z tej samej linii komórkowej na pokrytej COL4 / FN 12-transwell przefiltrowanej płytce jako kontrola ujemna do analizy TEER.</li>
	<li>Po 24 godzinach podhodowli zmień pożywkę na hESFM tylko z suplementem B27. Po tym kroku nie są potrzebne żadne zmiany podłoża.</li>
</ol>
6. Test kiełkowania
<ol>
	<li>Zbierz BMEC pochodzące z iPSC dnia 8 i wysiej je w 100 000 komórek/studnię na 24-dołkowej płaskiej płytce świeżo pokrytej 200 μl /cm2 macierzy błony podstawnej.</li>
	<li>Potraktuj te komórki hESFM z rozcieńczoną (1:200) witaminą B27 i 40 ng / ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGFA165).</li>
	<li>Obserwuj komórki co 24 godziny i zmieniaj pożywkę co dwa dni.</li>
</ol>
7. Immunocytochemia (ICC)
UWAGA: ICC jest przeprowadzany na 24-dołkowych płytach płaskodennych.
<ol>
	<li>Po 48 godzinach hodowli cząstkowej (dzień 8) należy dwukrotnie przemyć komórki preparatem DPBS. Napraw komórki 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut.</li>
	<li>Umyj komórki trzy razy DPBS, 5 minut na pranie. Wstępnie zablokuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w DPBS za pomocą 5% surowicy osła i 0,3% Triton X-100 (v/v).</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi: mysim anty-human-PECAM1 (1:100, zapas 0,5 mg/ml), króliczym anty-human-TJP1 (1:200, zapas 0,53 mg/ml), mysim anty-human-CLDN5 (1:200, zapas 0,5 mg/ml), mysi anty-human-OCLN (1:200, zapas 0,5 mg/ml) i króliczy anty-ludzki SLC2A1 (1:100, zapas 0,2 mg / ml) w DPBS zawierającym 5% surowicy osła przez noc w temperaturze 4°C.
	<ol>
		<li>Wypłucz komórki raz za pomocą DPBS, a następnie umyj pięć razy przez 5 minut na każde mycie DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi: osłem przeciwko królikowi Alexa Fluor 555 (1:200) i osłem-anty-myszowi 488 (1:200) w DPBS zawierającym 5% surowicy osła przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po tej inkubacji dodać Hoechst 33342 trichlorowodorek trójwodny rozcieńczony (1:1000) w DPBS przez 10 minut.
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór Hoechst 33342 i spłukać raz DPBS, a następnie przemyć cztery razy DPBS przez 5 minut na pranie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizuj komórki na mikroskopach fluorescencyjnych, aby szukać ekspresji i lokalizacji twórców komórek.</li>
</ol>
8. Pomiar i analiza TEER
UWAGA: Płytki filtrowane Corning 12-Transwell są wyposażone w filtry składające się z membran z politereftalanu etylenu o średnicy 1,12cm2 i porów 0,4 mikrometra. Pomiary TEER uzyskuje się w kontrpróbach technicznych (3 na studzienkę) i biologicznych (3 dołki na linię komórkową i/lub kondycję).
<ol>
	<li>24 godziny po podhodowli (dzień 7) mierz TEER za pomocą elektrod pałeczkowych i woltoomomierza co 24 godziny. Zapoznaj się z instrukcją obsługi woltoomomierza, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące uzyskiwania pomiarów.
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć TEER, naładuj woltoomomierz poprzedniej nocy. Delikatnie przetrzyj elektrody instrumentu i pałeczek 70% etanolem przed umieszczeniem ich w kapturze bezpieczeństwa.</li>
		<li>Włącz zasilanie i skalibruj omomierz zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Podłącz elektrody pałeczek i opłucz elektrody 70% etanolem, a następnie DPBS.</li>
		<li>Umieść krótszą elektrodę końcową we wkładzie trans-well (komorze wierzchołkowej), a dłuższy koniec w komorze podstawno-bocznej.</li>
		<li>Najpierw zmierz ślepą studzienkę, która jest pokryta tylko COL4 / FN. Następnie zmierz pozostałe studzienki.</li>
		<li>Szybko przepłucz elektrody pałeczek 70% etanolem, a następnie DPBS podczas pomiaru różnych warunków (tj. pomiaru różnych linii komórkowych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich pomiarów (w Ω) należy opłukać elektrody pałeczek 70% etanolem, a następnie sterylną wodą. Delikatnie wytrzyj elektrodę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze bezpieczeństwa.</li>
	<li>Uśrednić trzykrotne wartości TEER (w Ω) ze ślepej próby i odjąć tę średnią wartość od każdej surowej wartości TEER według warunków.
	<ol>
		<li>Uśrednij odjęte wartości i pomnóż je przez 1,12cm2 (pole powierzchni wkładki 12-transwell).</li>
		<li>Użyj przekształconych wartości z kroku 6, aby wygenerować wykres przedstawiający wartość TEER i błędy standardowe dla każdego dnia pomiaru TEER.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Aktywność i analiza transportera Efflux
UWAGA: Test aktywności transportera wypływu jest wykonywany na 24-dołkowej płytce o płaskim dnie. Interesujące transportery wypływu to ABCB1 i ABCC1. Zaleca się, aby każdy warunek był wykonywany w trzech egzemplarzach ze studzienkami kontrolnymi (tj. studzienkami ślepymi bez odpowiednich inhibitorów).
<ol>
	<li>Po 48 godzinach od podhodowli (dzień 8) inkubować komórki z 10 μM Valspodar (inhibitor ABCB1) lub 10 μM MK571 (inhibitor ABCC1) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mM bulionu Valspodar, rozpuszczając 5 mg proszku (1214,64 g/mol) w 412 μl DMSO i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby uzyskać 10 ml hESFM z 10 μM Valspodar, zmieszaj 10 μl 10 mM bulionu Valspodar z 10 ml hESFM.</li>
		<li>Przygotować 10 mM wywaru MK571, rozpuszczając 5 mg proszku (537,07 g/mol) w 931 μl i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby zrobić 10 ml hESFM z 10 μM MK571, wymieszaj 10 μl 10 mM bulionu MK571 z 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po upływie 1 godziny inkubować komórki z 10 μM rodaminą 123 (substrat ABCB1) lub 10 μM dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCFDA, substrat ABCC1) z odpowiednimi inhibitorami lub bez nich przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mM rodaminy 123 przez rozpuszczenie 10 mg proszku (380,82 g/mol) w 875 μl DMSO i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby uzyskać 10 ml hESFM z 10 μM rodaminy 123, zmieszaj 10 μl 10 mM rodaminy 123 z 10 ml hESFM.</li>
		<li>Przygotować 10 mM H2DCFDA, rozpuszczając 50 mg proszku (487,29 g/mol) w 10,26 ml DMSO i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby uzyskać 10 ml hESFM z 10 μM rodaminy 123, zmieszaj 10 μl 10 mM rodaminy 123 z 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 0,5 ml DPBS i poddać je lizie przy użyciu DPBS zawierającego 5% Triton-X (v/v).</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję lizowanych komórek za pomocą czytnika wielopłytkowego lub mikropłytki (patrz lista materiałów).
	<ol>
		<li>Ustaw czytnik płytek fluorescencyjnych na wzbudzenie 485 nanometrów i emisję 530 nanometrów i zmierz fluorescencję na tych długościach fal</li>.
		<li>W przypadku studzienek, które nie są używane w teście transportera, należy dwukrotnie przepłukać komórki DPBS przed utrwaleniem ich 4% PFA w celu ilościowego oznaczania jąder komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki z trójwodzianem trichlorowodorku Hoechst 33342 rozcieńczonym (1:1000) w DPBS przez 10 minut. Zobrazuj wiele pól wizualnych w każdym dołku, aby obliczyć średnią liczbę jąder komórkowych za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych.</li>
	<li>Policz jądra za pomocą Fidżi i znormalizuj wartości fluorescencji dla każdej komórki do tych liczb.
	<ol>
		<li>Obliczyć średnią akumulację fluorescencji, odejmując wartość akumulacji fluorescencji surowej dla każdego warunku od odpowiedniej wartości ślepej próby.</li>
		<li>Średnie odjęte wartości dla każdego warunku.</li>
		<li>Podziel wartości średnie z kroku 9.6.1 przez średnią liczbę komórek. Użyj tych wartości, aby znormalizować wartości fluorescencji dla poszczególnych komórek.</li>
		<li>Użyj znormalizowanych wartości, aby wygenerować graficzną reprezentację dla każdego stanu inhibitora i przeprowadzić niezbędną analizę statystyczną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Przejścia, rozszerzanie i kriokonserwacja BMEC
<ol>
	<li>Uzupełnij kultury BMEC dnia 8 świeżym hESFM uzupełnionym rozcieńczoną (1:200) B27 i pozwól komórkom rozszerzać się przez kolejne dwa dni na matrycy COL4 / FN.</li>
	<li>Pokryć nową 12-płynną płytkę z filtrem i 24-dołkową płytkę z płaskim dnem z 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN i inkubować przez 4 godziny.</li>
	<li>W dniu 10 przemyć komórki DPBS i inkubować z 1 ml enzymatycznego EDTA przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37°C, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.</li>
	<li>Zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Aby kriokonserwować te komórki, ponownie zawieś granulki komórkowe ze świeżym hESFM z 30% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 10% DMSO.</li>
		<li>Przechowywać BMEC pochodzące z iPSC w kriokonserwowanych fiolkach w pojemniku izopropanolowym przez pierwsze 24 godziny w temperaturze -80 °C, a następnie umieścić w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania w temperaturze -160 °C.</li>
		<li>Aby przejść przez te komórki, należy ponownie zawiesić osady komórkowe ze świeżym hESFM uzupełnionym rozcieńczoną (1:200) witaminą B27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki nasienne na powlekane płytki przygotowane w kroku 10.2. Komórki nasienne przy użyciu stosunku 1 dołka płytki 6-dołkowej do 3 dołków płytki z filtrem 12-transdołkowym i do 6 dołków płytki 24-dołkowej. Pozwól komórkom rosnąć i rozszerzać się przez 24 godziny.</li>
	<li>W dniu 11 zmierz TEER, wykonując czynności wymienione w kroku 8.</li>
	<li>W dniu 12 wykonaj ICC, wykonując czynności wymienione w kroku 9.</li>
	<li>Aby rozmrozić kriokonserwowane BMEC, umieść kriokonserwowane fiolki w ciepłej wodzie lub kąpieli perełkowej w temperaturze 37oC. Następnie przenieś rozmrożone BMEC do 5 ml hESFM uzupełnionego rozcieńczoną (1:200) B27.
	<ol>
		<li>Zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w hESFM uzupełnionym rozcieńczoną (1:200) B27, 10 μM RA i 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Po 24 godzinach zmień pożywkę na hESFM uzupełnioną rozcieńczonym (1:200) B27 i 10 μM Y-27632 bez RA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
W tym protokole dokonaliśmy pewnych modyfikacji w użyciu powszechnie stosowanej macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywki do hodowli komórkowych podczas hodowli iPSC w celu wyprowadzenia BMEC (Figura 1). Zmiany te nie wpłynęły na zdolność do wyprowadzania BMECS z ludzkich iPSC, jak opisano w protokole Lippmanna1. Zastosowano linię iPSC od innego zdrowego dawcy, aby wykazać, że ten zmodyfiko...

Funkcja bariery krew-mózg 
Bariera krew-mózg (BBB) tworzy granicę, która ogranicza przepływ substancji z krwi do mózgu. Bariera krew-mózg składa się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC), które tworzą monowarstwę wyściełającą naczynia krwionośne. BMEC wraz z astrocytami, neuronami, perycytami, mikroglejem i macierzą zewnątrzkomórkową tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową. BMEC mają ściśle regulowaną strukturę parakomórkową, która pozwala BBB utrzymywać wysoki przezśródbłonkowy opór elektryczny (TEER), który ogranicza bierną dyfuzję i służy jako wskaźnik integralności bariery1,2. BMEC zawierają również białka, które pomagają w ruchu międzykomórkowym, takim jak endocytoza, transcytoza i transmigracja, a także wynaczynienie leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej3. BMEC polegają na transporterach napływu i odpływu w celu odżywiania i usuwania produktów przemiany materii, w celu utrzymania równowagi homeostatycznej w mózgu3. Na przykład nośnik substancji rozpuszczonej z rodziny 2 członek 1 (SLC2A1) jest transporterem napływu odpowiedzialnym za ruch glukozy przez BBB4, podczas gdy transportery wypływu, takie jak podrodzina kasety wiążącej ATP B member 1 (ABCB1) i podrodzina kasety wiążącej ATP C Member 1 (ABCC1) są odpowiedzialne za powrót substratów z powrotem do krwiobiegu3, 5,6,7. Substraty ABCB1 obejmują morfinę, werapamil4 oraz leki przeciwpsychotyczne, takie jak olanzapina i risperidon8, podczas gdy transporter ABCC1 ma różne substraty, w tym koniugaty siarczanowe, winkrystynę i koniugaty glukuronidowe4.
Zastosowanie modeli BBB w zaburzeniach psychicznych 
Dysfunkcja BBB jest związana z wieloma zaburzeniami neurologicznymi i psychiatrycznymi, w tym schizofrenią i chorobą afektywną dwubiegunową9,10. Ostatnio modele komórkowe ex vivo pochodzące z iPSC są wykorzystywane do badania komórkowych i molekularnych podstaw zaburzeń psychicznych, ale modele te obecnie nie uwzględniają potencjalnej roli odgrywanej przez neurovasculature11,12,13. Przypuszcza się, że cytokiny zapalne obwodowe krążące we krwi mogą niekorzystnie wpływać na BBB14,15,16,17, ale istnieją również dowody na paracellular18,19,20,21,22, transcellular23,24,25,26,27,28,29, and extracellular matrix20,29,30,31,32 nieprawidłowości przyczyniające się do dysfunkcji bariery krew-mózg. Zaburzenie bariery krew-mózg może spowodować, że zawartość krwi dostanie się do miąższu mózgu i aktywuje astrocyty i/lub mikroglej w celu uwolnienia cytokin prozapalnych, które z kolei inicjują reakcję zapalną33, która może mieć szkodliwy wpływ na mózg34. BMEC są głównym składnikiem bariery krew-mózg, a badanie struktury i funkcji tych komórek może poprawić zrozumienie dysfunkcji bariery krew-mózg w zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych.
Alternatywne modele BMEC 
Przed opracowaniem wydajnych protokołów do wyprowadzania BMEC z iPSCs1,6,35,36, naukowcy wykorzystali unieśmiertelnione BMECs37 do zbadania funkcji BBB. Jednak wielu z tych modeli nie udało się osiągnąć pożądanych fenotypów BBB, takich jak fizjologiczny zakres wartości TEER38,39. Wykorzystanie iPSC ma tę zaletę, że zachowuje tło genetyczne osoby, od której pochodzą komórki. Naukowcy aktywnie pracują nad stworzeniem modeli mikrośrodowiska ex vivo opartych na iPSC, które podsumowują strukturę i funkcje ludzkiego mózgu. Naukowcy opracowali metody uzyskiwania BMEC, które są strukturalnie i fizjologicznie podobne do BMEC znalezionych in vivo. Metody uzyskiwania oczyszczonych populacji BMEC pochodzących z iPSC wymagają wielu różnych kroków, a protokoły zostały zoptymalizowane w ciągu ostatnich kilku lat1,6,35,36. Ogólnie rzecz biorąc, BMEC pochodzące z iPSC są hodowane w pożywce Essential 6 (E6) przez 4 dni, a następnie przez 2 dni w pożywce wolnej od surowicy śródbłonka (hESFM) uzupełnionej podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF), kwasem retinowym (RA) i suplementem B27. Komórki są następnie hodowane na matrycy kolagenu IV (COL4) i fibronektyny (FN) w celu uzyskania >90% jednorodnych BMECs1.
Tożsamość BMEC jest potwierdzona przez immunofluorescencję wykazującą koekspresję białek BMEC, w tym cząsteczki adhezyjnej komórek płytkowo-śródbłonkowych-1 (PECAM1), SLC2A1 i białek o ścisłym połączeniu, takich jak białko ścisłego połączenia 1 (TJP1), okludyna (OCLN) i klaudyna-5 (CLDN5)6. Testy kiełkowania zostały wykorzystane do potwierdzenia potencjału angiogennego BMEC pochodzących z iPSC. 6 Integralność BBB BMEC jest oceniana na podstawie obecności fizjologicznych wartości TEER in vitro (~2000Ω x cm2)37 oraz mierzalnej aktywności dla transporterów wypływu, takich jak ABCB1 i ABCC11,6,36. Ostatnie postępy metodologiczne grupy Lippmanna doprowadziły do powstania protokołów BMEC opartych na iPSC o zmniejszonej zmienności eksperymentalnej i zwiększonej odtwarzalności1. Nie wiadomo jednak, czy można je rozszerzać i przechodzić poza etap podhodowli. Nasz zmodyfikowany protokół ma na celu rozwiązanie tego problemu poprzez przejście BMEC pochodzących z iPSC po 8 dniu i ocenę, czy można je dalej rozszerzać, aby zachować właściwości BBB po krioprezerwacji. Chociaż żadne badania nie opisywały pasażowania BMEC pochodzących z iPSC, istnieje protokół kriokonserwacji BMEC, który zachowuje fizjologiczne właściwości BBB po przejściu cyklu zamrażania i rozmrażania40. Nie wiadomo jednak, czy BMEC po krioprezerwacji mogą być pasażowane i zachowywać właściwości BBB.
BMEC pochodzące z iPSC za pomocą protokołu Lippmanna zostały wykorzystane do modelowania zaburzeń BBB w zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba Huntingtona7. Takie BMEC pochodzące z iPSC zostały również wykorzystane do zbadania wpływu infekcji bakteryjnej, takiej jak Neisseria meningitidis lub Streptococcus grupy B, na zakłócenie bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy i odpowiednio BBB41,42. Ponadto, wykorzystując BMEC pochodzące z iPSC od pacjentów ze schizofrenią z zespołem delecji 22q, naukowcy zaobserwowali wzrost międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (ICAM-1), głównej cząsteczki adhezyjnej w BMEC, która pomaga w rekrutacji i wynaczynieniu leukocytów do mózgu43. Podsumowując, badania te wykazują przydatność BMEC pochodzących z iPSC do badania zaburzeń bariery krew-mózg w złożonych zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&-dichlorodihydrofluoresceina dioctan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6964-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anty-mysi IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anty-królik IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mysia</td> sygnalizacja <td>komórkowa</td> mAb <td>3528S</td><td></td></tr><tr><td>CLDN5 (Claudin-5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL Fiolka kriogeniczna z polipropylenu z gwintem wewnętrznym&nbsp;</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 8670</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnem (6-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Płytki do hodowli komórkowych Falcon z płaskim dnem (24-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa Corning Transwell z przepuszczalnymi wkładkami z membrany poliestrowej (12-dołkowa)</td><td>Prowadnice Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (bez czerwieni fenolowej)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>A1413202</tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2438-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Nabłonkowy miernik napięcia/oma (TEER) (EVOM2) STX2</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>A1516401</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-2mg</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Obniżony czynnik wzrostu Matrix Matryca błony podstawnej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli Hanksa z wapniem i magnezem&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trójchlorowodorek, Trójwodzian</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bez ludzkiej surowicy śródbłonka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 6000</td><td>General Electric</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MK-571</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7571-5MG</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Occludin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td> <td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Envision 2103 wielopłytkowy Czytelnik</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A Rekombinowany</td><td></td></tr><tr><td>ludzki VEGF 165</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 (GLUT-1)</td> <td>ThermoFisher</td><td>PA1-21041</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>81778S</td><td></td></tr><tr><td>TJP-1 (ZO-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA5-28869</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%) do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Valspodar (Sigma) (cyklosporyna A)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0572-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Versene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor ROCK)</td><td>Tocris/ Thermo Fisher Scientific</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu (BMEC) mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu opracowania modeli komórkowych ex vivo do badania funkcji bariery krew-mózg (BBB). Ten zmodyfikowany protokół zawiera szczegółowe kroki w celu uzyskania, namnażania i krioprezerwacji BMEC z ludzkich iPSC przy użyciu innego dawcy i odczynników niż te zgłoszone w poprzednich protokołach. iPSC są traktowane pożywką essential 6 przez 4 dni, a następnie przez 2 dni pożywką hodowlaną bez surowicy śródbłonka ludzkiego uzupełnioną podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, kwasem retinowym i suplementem B27. W 6 dniu komórki są hodowane na matrycy kolagenu/fibronektyny przez 2 dni. Immunocytochemię przeprowadza się w 8 dniu w celu analizy markerów BMEC przy użyciu CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 i SLC2A1. Western blot jest wykonywany w celu potwierdzenia ekspresji markera BMEC i braku SOX17, markera endodermalnego. Potencjał angiogenny wykazuje się za pomocą testu kiełkowania. Prześródbłonkowy opór elektryczny (TEER) mierzy się za pomocą elektrod pałeczek i woltoomomierza, począwszy od 7 dnia. Aktywność transportera wypływu dla podrodziny B kasety wiążącej ATP członka 1 i podrodziny C kasety wiążącej ATP 1 mierzy się za pomocą czytnika wielopłytkowego w 8 dniu. Pomyślne wyprowadzenie BMEC potwierdza obecność odpowiednich markerów komórkowych, niski poziom SOX17, potencjał angiogenny, aktywność transportera i wartości TEER ~2000 Ω xcm2. BMEC są ekspandowane do 10 dnia przed przejściem na świeżo pokryte płytki kolagenu/fibronektyny lub kriokonserwowane. Protokół ten pokazuje, że BMEC pochodzące z iPSC mogą być rozszerzane i pasażowane co najmniej raz. Po krioprezerwacji zaobserwowano jednak niższe wartości TEER i gorszą lokalizację markerów BMEC. BMEC mogą być wykorzystywane w eksperymentach z innymi typami komórek (neurony, glej, perycyty), w trójwymiarowych modelach mózgu (narząd-chip i hydrożel), do unaczynienia organoidów mózgowych oraz do badania dysfunkcji BBB w zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Różnicowanie BMEC 
Kilka krytycznych etapów niniejszego protokołu powinno być ściśle przestrzeganych (Rycina 1). Zastosowanie pożywki E6 w 1. dniu jest istotne, ponieważ jest ona często wykorzystywana do wyprowadzania linii neuroektodermalnej z iPSC w stosunkowo krótkim czasie, co pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników w wielu liniach komórkowych36. Kolejnym ważnym krokiem jest 4. dzień różnicowania, w którym pożywkę E6 należy zastąpić pożywką ...

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMEC wygenerowane z iPSC dostarczają nowych modeli eksperymentalnych do badania funkcji i dysfunkcji bariery krew-mózg. Wykorzystaliśmy ten protokół do zbadania, czy BMEC zachowują swoje właściwości barierowe po ekspansji i krioprezerwacji. Technika ta umożliwia generowanie specyficznych dla choroby BMEC od pacjentów z zaburzeniami, w których przerwanie bariery krew-mózg odgrywa rolę w patofizjologii choroby.Aby indukować różnicowanie BMEC od ludzkich iPSC, należy przemyć zlewającą się kulturę iPSC jednokrotnie DPBS przed inkubacją komórek z odpowiednią objętością enzymatycznego EDTA przez około pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki, należy zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK do liczenia. Rozcieńczyć komórki do 1,56 razy 10 do czwartej komórki na centymetr sześcienny stężenia i umieścić dwa mililitry komórek w pojedynczych dołkach o sześciodołkowym płaskim dnie.Po 24 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp supernatant w każdym dołku pożywką E6 i włóż płytkę do inkubatora na kolejne cztery dni. Aby oczyścić BMEC pochodzące z iPSC, pokryj płytki hodowlane odpowiednią objętością świeżo przygotowanego roztworu kolagenu IV i fibronektyny na dołek i inkubuj płytki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W szóstym dniu różnicowania zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w odpowiedniej objętości świeżej pożywki wolnej od ludzkiej surowicy śródbłonka, uzupełnionej witaminą B27, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i kwasem retinowym.W celu analizy TEER umieść zróżnicowane komórki w każdym dołku pokrytej kolagenem i fibronektyną płytki z filtrem 12-transwell. W celu analizy aktywności transportera wypływu umieść komórki w każdym dołku 24-dołkowej płaskiej płytki dolnej pokrytej kolagenem i fibronektyną. Po 24 godzinach subhodowli zastąp supernatant w każdym dołku świeżą pożywką bez ludzkiej surowicy śródbłonka, uzupełnioną tylko suplementem B27.Aby zmierzyć właściwości bariery krew-mózg BMEC za pomocą TEER, naładuj instrument TEER przez noc i delikatnie przetrzyj elektrody instrumentu i pałeczek 70% etanolem przed umieszczeniem ich w kapturze bezpieczeństwa. Włącz zasilanie i skalibruj omomierz zgodnie ze specyfikacją producenta. Podłącz elektrody i przepłucz je raz 70% etanolem, a drugi raz DPBS.Umieść krótszy koniec elektrody w nietypowej komorze wkładu, a dłuższy koniec w komorze podstawno-bocznej studni ślepej. Po zmierzeniu odpowiedzi kontroli ujemnej szybko przepłucz elektrody, jak pokazano, i zmierz pierwszą studzienkę doświadczalną. Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów ponownie wypłucz elektrody pałeczek, delikatnie wytrzyj elektrody i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze bezpieczeństwa.Aby ocenić aktywność transportera wypływu komórek, w ósmym dniu hodowli potraktuj odpowiednią liczbę studzienek 10 mikromolowym roztworem inhibitora transportera wypływu i umieść w inkubatorze na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy potraktować komórki 10-mikromolowym roztworem substratu transportera wypływu przez jedną godzinę w inkubatorze. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 500 mikrolitrami DPBS na studzienkę, a następnie poddać komórki lizie za pomocą 500 mikrolitrów DPBS uzupełnionych 5% Triton-X na studzienkę.Po pięciu minutach użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć fluorescencję zlizowanych komórek przy wzbudzeniu 485 nanometrów i emisji 530 nanometrów. W przypadku studzienek, które nie są używane w teście transportera, należy dwukrotnie przemyć komórki DPBS przed utrwaleniem 4% paraformaldehydem na jądra komórkowe. Po jednym dniu hodowli w pożywce E6 morfologia komórek jest podobna do morfologii iPSC.Czwartego dnia komórki wyraźnie odróżniają się od iPSC i pokrywają większość studni. Dwudniowa hodowla w pożywce wolnej od surowicy śródbłonka ludzkiego wywołuje w komórkach wydłużony i brukowany wygląd. Ósmego dnia pojedyncze komórki tworzą w większości duży wzór bruku.Można przeprowadzić test kiełkowania, aby wykazać potencjał angiogenny BMEC pochodzących z iPSC. Prowadzi to do rozwoju struktur przypominających rurki po trzech dniach leczenia czynnikiem wzrostu. BMEC pochodzące z iPSC wygenerowane przy użyciu tego protokołu ulegały koekspresji białek połączeń ścisłych ulegających ekspresji w komórkach śródbłonka w mózgu, płucach, wątrobie i nerkach, a także markerów śródbłonka naczyń krwionośnych ulegających ekspresji w barierze krew-mózg.Jak zaobserwowano, 48 godzin po subkulturze i zmianie pożywki BMEC pochodzące z iPSC wykazują wartości TEER w zakresie opisanym dla BMEC pochodzących z iPSC, które były hodowane wspólnie z pierwotnymi astrocytami szczurów. Na tym etapie zaobserwowano również aktywność transportera wypływu. Po krioprezerwacji, pomiary TEER są niższe w porównaniu ze świeżo uzyskanymi BMEC.Analiza Western blot ujawnia obniżony poziom markerów połączeń ścisłych, takich jak okludyna, podczas gdy immunocytochemia pokazuje piegowate i/lub postrzępione wzory białek połączeń ścisłych. Zbyt wysoka lub zbyt niska gęstość iPSC wpłynie na efektywność różnicowania i wpłynie na rozwój odpowiednich właściwości bariery krew-mózg. Metoda ta umożliwia badanie właściwości bariery, sygnalizacji komórkowej i aktywności transportera przy użyciu zindywidualizowanych BMEC do modelowania fizjologii i patofizjologii funkcji bariery krew-mózg.

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Ten film demonstruje protokół indukowania różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mózgu.

Generowanie komórek śródbłonka mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film demonstruje wieloetapowy proces różnicowania ludzkich iPSC w mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu. Powstałe w ten sposób zróżnicowane komórki ściśle naśladują komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, charakteryzujące się ścisłymi połączeniami, co czyni je idealnymi do badań nad chorobami mózgu.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Ten film demonstruje łatwą i niezawodną strategię przygotowania czystych kultur komórek śródbłonka z embrionalnej przodomózgowia w ciągu 10-12 dni i będzie przydatny do badań skoncentrowanych na wielu aspektach angiogenezy mózgowej.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Opisany tutaj protokół podkreśla główne etapy różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z mózgo-podobnych komórek śródbłonka, przygotowanie Neisseria meningitidis do infekcji oraz pobieranie próbek do innych analiz molekularnych.

Neisseria meningitidis Zakażenie indukowanych pluripotencjalnych komórek śródbłonka mózgu pochodzących z komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Poznaj protokół różnicowania i kriokonserwacji komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu z ludzkich iPSC. Ta metoda umożliwia badanie funkcji bariery krew-mózg w modelach chorób neurologicznych.

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów