Name: Wizualizacja Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji Pseudomonas aeruginosa i egzopolisacharydu Psl w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą. Technika ta pozwala badać organizację przestrzenną bakterii i ich wpływ na skuteczność leczenia przeciwdrobnoustrojowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Mukowiscydozy, która zapewniła fundusze na te badania oraz MedImmune za hojne przekazanie przeciwciał anty-Psl0096. Na potrzeby tego badania obrazowanie wykonano w zakładzie obrazowania CAMiLoD na Uniwersytecie w Toronto.

Zgoda Komisji Etyki Badań (REB) jest wymagana do pobierania i przechowywania próbek plwociny od ludzi. Przedstawione w niniejszym artykule badania zostały zatwierdzone przez Szpital dla Dzieci Chorych REB#1000058579.
1. Pobieranie plwociny
<ol>
	<li>Odkrztuszoną plwocinę przechowywać w sterylnym kubku do pobierania próbek i natychmiast przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny przed utrwaleniem. 
	UWAGA: Pozostawienie plwociny zbyt długo w temperaturze 4 °C bez utrwalenia może prowadzić do degradacji komórek, szczególnie degradacji białych krwinek. Preferowana jest fiksacja tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Przenieść próbki plwociny do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać równą objętość 4% paraformaldehydu (PFA) do próbek plwociny. Na przykład, jeśli próbka plwociny ma 0,5 ml, dodaj 0,5 ml 4% PFA. Wymieszaj przez delikatne odwrócenie.</li>
	<li>Inkubować plwocinę przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać próbkę, dodając 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdych 2 ml utrwalonej plwociny. 
	UWAGA: Na tym etapie mycia nie jest wymagane wirowanie.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. 
	UWAGA: Unikaj zasysania plwociny pipetą, kierując końcówkę z dala od plwociny i bardzo powoli odsysaj płyn z powierzchni. Etap mycia nie obejmuje wirowania, aby nie naruszyć integralności strukturalnej czopów plwociny.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.6-1.7 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2-krotności objętości PBS z 0,01 % (w/v) azydkiem sodu.</li>
	<li>Przechowywać plwocinę w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. MiPACT (technika oczyszczania tkanek) przetwarzanie plwociny
<ol>
	<li>Odgazować składniki hydrożelu (30% 29:1 akrylamid: bis-akrylamid, utwardzacz i PBS) w szczelnie zamkniętym pojemniku zawierającym pakiet beztlenowy przed 72 godzinami 
	UWAGA: Pakiet beztlenowy i szczelny pojemnik są niezbędne, ponieważ tlen hamuje polimeryzację akrylamidu. Alternatywnie, tlen można usunąć, wykonując ten krok w okapie beztlenowym, stosując próżnię do szczelnie zamkniętego pojemnika lub bulgocząc gaz N2 przez mieszaninę akrylamidu.
	<ol>
		<li>Dodać 2 ml 30% roztworu akryloamidu:bis-akrylamidu w proporcji 29:1 do probówki o pojemności 15 ml ze zdjętą nakrętką wewnątrz szczelnie zamkniętego pojemnika anaerobowego.</li>
		<li>Przygotuj skoncentrowany zapas 10% (w/v) utwardzacza, dodając 0,5 g utwardzacza do 5 ml PBS w probówce o pojemności 15 ml. Pozostaw nakrętkę z tubki i przechowuj w szczelnie zamkniętym pojemniku anaerobowym.</li>
		<li>Pozostawić kilka ml sterylnego PBS w probówce, bez nakrętki, wewnątrz pojemnika beztlenowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 5 ml roztworu hydrożelu o końcowym stężeniu 0,2% utwardzacza i 4% 29:1 akrylamidu:bis-akrylamidu w PBS w probówce o pojemności 15 ml. Wymieszać przez inwersję i wysterylizować filtrem.</li>
	<li>Wyjmij próbki plwociny z lodówki, a następnie pokrój je na małe kawałki (o średnicy około 5 mm) w sterylnych warunkach za pomocą skalpela. 
	UWAGA: Jeśli plwocina jest dość płynna, ten krok można nadal wykonać, jednak usunięcie plwociny z roztworu do przechowywania za pomocą pęsety wymaga większej cierpliwości i praktyki przed użyciem skalpela do oddzielenia pożądanych frakcji.</li>
	<li>Umieść pocięte próbki plwociny w studzience z 8-komorowym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Dodać 300 μl wysterylizowanego przez filtr roztworu hydrożelu z kroku 2.2 do każdej z studzienek zawierających plwocinę.</li>
	<li>Umieścić 8-komorową szklankę nakrywkową w szczelnie zamkniętym pojemniku zawierającym pakiet beztlenowy na 3 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Po spolimeryzowaniu hydrożel z osadzoną plwociną powinien mieć konsystencję twardego żelu.</li>
	<li>Przenieść zestalone próbki plwociny hydrożelowej do probówki hodowlanej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml 8% dodecylosiarczanu sodu (SDS), pH 8 i pozostawić próbki do oczyszczenia przez 3-14 dni w temperaturze 37 °C (z wstrząsaniem lub bez), aż plwocina stanie się przezroczysta. 
	UWAGA: Czas oczyszczania zależy od składu plwociny i można go ogólnie skrócić za pomocą potrząsania. Należy jednak uważać, aby nie zwiększać prędkości wytrząsania do punktu, w którym naruszyłoby to integralność próbki. Usunięcie większej liczby próbek bogatych w DNA zajmuje więcej czasu w porównaniu z próbkami bogatymi w śluz</li>.
	<li>Przelać 8% roztwór SDS do pojemnika na odpady. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś każdą próbkę zatopioną w hydrożelu do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 10 ml PBS do każdej ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml, aby przepłukać hydrożele i pozostaw roztwór na 30 minut do 1 godziny przed zdekantacją. Powtórz to jeszcze 2 razy więcej razy. 
	UWAGA: Ten etap mycia nie obejmuje wirowania. Nadmiar płynu i supernatantu ostrożnie usuwa się pipetą.</li>
	<li>Umyte próbki należy przechowywać w PBS z 0,01% (w/v) azydkiem sodu i 1x inhibitorem RNazy w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Protokół hydrożelowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)
<ol>
	<li>Usuń próbki hydrożelu z roztworu do przechowywania za pomocą sterylnej pęsety i umieść próbki na sterylnej powierzchni (takiej jak szkiełko podstawowe lub szalka Petriego).</li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela pokrój hydrożele w plastry o grubości ~ 1 mm.</li>
	<li>Umieść 1 mm odcinki hydrożelu w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przygotować 1 ml buforu hybrydyzacyjnego (25% formamidu, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, oczyszczony i zdejonizowanyH2O) w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać znakowaną fluorescencyjnie sondę PseaerA (150,7 nM12) do buforu hybrydyzacyjnego i wymieszać przez inwersję. 
	UWAGA: Roztwór formaliny należy trzymać z dala od otwartego ognia. Bufor hybrydyzacyjny może być przygotowany w wersji zaawansowanej i przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C13.</li>
	<li>Dodaj 200-500 μl buforu hybrydyzacyjnego do każdego ~1 mm odcinka hydrożelu i upewnij się, że cała próbka hydrożelu jest zanurzona.</li>
	<li>Pozwól sondzie PseaerA na hybrydyzację z próbkami hydrożelu, umieszczając je w ciemności na ~ 18-24 h, w temperaturze 46 °C, bez wstrząsania.</li>
	<li>Zdekantować bufor hybrydyzacyjny do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Przepłukać próbki raz wysterylizowanym przez filtr buforem do płukania (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) [pH 7,2], 0,01% SDS oraz oczyszczonym i zdejonizowanymH2O), dodając 1 ml buforu do przemywania do każdej z probówek o pojemności 1,5 ml, a następnie usunąć go. 
	UWAGA: Bufor do mycia można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżego buforu do płukania do probówek, a następnie inkubować próbki w ciemności przez 6 godzin w temperaturze 48 °C, bez wstrząsania.</li>
</ol>
4. Wiązanie hydrożelu i przeciwciał Psl0096
<ol>
	<li>Sterylnie usunąć bufor do przemywania za pomocą pipetora o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przepłukać próbki 2% roztworem BSA (w/v) w roztworze PBS, dodając i usuwając 1 ml 2% roztworu BSA.</li>
	<li>Dodać 500 μl 2% roztworu BSA/PBS do próbek hydrożelu, aby zablokować niespecyficzne wiązanie białek. Następnie inkubować próbki przez noc, w ciemności, w temperaturze pokojowej, bez wstrząsania.</li>
	<li>Sterylnie usunąć roztwór blokujący za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała Psl0096-Texas Red, rozcieńczając przeciwciało do końcowego stężenia 0,112 μg/ml w 500 μl świeżego 2% BSA/PBS.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu przeciwciał do próbek hydrożelu i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, chroniąc przed światłem, bez wstrząsania.</li>
</ol>
5. Barwienie DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenyloindol)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła (RIMS), dodając 40 g ośrodka o niejonowym gradiencie gęstości, 30 μl Tween20, 3 μg azydku sodu i 30 ml PBS do kolby zawierającej mieszadło magnetyczne. Mieszaj roztwór przez 15 minut na mieszadle magnetycznym lub do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Filtruj roztwór sterylizuj do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i sterylnego filtra 0,2 μm. 
	UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała Psl0096-Texas Red za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przepłukać próbki hydrożelu, dodając, a następnie usuwając 1 ml PBS.</li>
	<li>Próbki hydrożelu inkubować z 250 μl roztworu RIMS i 10 μg/ml DAPI w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając, w ciemności, przez noc.</li>
	<li>Przed obrazowaniem konfokalnym umieścić próbki w komorach perfuzyjnych 0,9 mm lub 1,7 mm i uszczelnić szklanym szkiełkiem nakrywkowym. 
	UWAGA: Po badaniu FISH i/lub immunohistochemii, a przed zanurzeniem w RIMS, można zastosować fluorescencyjne barwienia lektyny, jeśli pożądana jest wizualizacja śluzu plwociny12.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Wykonuj obrazowanie w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej przy użyciu standardowych technik przy powiększeniach 25x, 40x, 63x lub 100x.</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis%3A+What+drug+and+which+way%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li>
<li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis%3A+Pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li>
<li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913(2019).</li>
<li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526(2013).</li>
<li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides%2C+alginate%2C+Pel%2C+and+Psl%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167(2011).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li>
<li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding%2C+clearing%2C+and+rRNA+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li>
<li>Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.molecularinstruments.com">www.molecularinstruments.com</a> 1-6 (2019).</li>
<li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+processing+time+and+storage+of+sputum+influence+quantitative+bacteriology+in+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis.</a> Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).</li>
<li>Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum%3A+Time+from+expectoration+to+processing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum: Time from expectoration to processing.</a> European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).</li>
<li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li>
<li>St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+fixation+methods+of+induced+sputum+specimens%3A+An+immunocytochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).</li>
<li>Hogardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+rapid+detection+by+fluorescent+situ+hybridization+of+bacteria+in+clinical+samples+obtained+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).</li>
<li>Hoffmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Novel+mouse+model+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+mimicking+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis.</a> Infection and Immunity. 73 (8), 5290(2005).</li>
<li>Nair, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+Gram+staining+for+evaluation+of+the+quality+of+cystic+fibrosis+sputum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).</li>
<li>Howlin, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Dose+Nitric+Oxide+as+Targeted+Anti-biofilm+Adjunctive+Therapy+to+Treat+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).</li>
<li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234(2019).</li>
</ol>

Celem tego protokołu jest umożliwienie wglądu w organizację in situ komórek P. aeruginosa w plwocinie od pacjentów z mukowiscydozą. Próbki plwociny powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia, jeżeli nie można ich natychmiast utrwalić. Wykazano, że liczba komórek P. aeruginosa w plwocinie nie zmienia się znacząco, jeśli jest przetwarzana w ciągu 1 godziny, 24 godziny lub 48 godziny, gdy jest przechowywana w temperaturze 4 °C, chociaż jeśli pozostawiona w temperaturze 25 °C przez...

W tym badaniu, eksperymenty zostały zaprojektowane w celu wizualizacji struktury in vivo Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą (CF) u dzieci. Zakażenia P. aeruginosa stają się przewlekłe u 30-40% populacji dzieci z mukowiscydozą; Gdy przewlekłe infekcje się utrwalą, ich wyeliminowanie jest prawie niemożliwe1. Izolaty P. aeruginosa od pacjentów z wczesnym zakażeniem są na ogół bardziej podatne na środki przeciwdrobnoustrojowe, dlatego są one leczone antybiotykami przeciw pseudomonom, aby zapobiec powstaniu przewlekłej infekcji2. Niestety, nie wszystkie izolaty P. aeruginosa są skutecznie usuwane z płuc po antybiotykoterapii. Dokładne mechanizmy związane z niepowodzeniem antybiotyków nie zostały w pełni wyjaśnione. Wcześniejsze badania wykazały, że różnice w gęstości komórek biofilmu, agregacji i produkcji polisacharydów mogą wpływać na skuteczność antybiotyku3. P. aeruginosa wytwarza trzy zewnątrzkomórkowe polisacharydy: Pel, Psl i alginian4. Większość szczepów P. aeruginosa ma genetyczną zdolność do ekspresji każdego z egzopolisacharydów, chociaż często jeden rodzaj polisacharydów jest wyrażany głównie 5. Alginian egzopolisacharydu jest związany z przewlekłymi infekcjami płuc mukowiscydozy, co skutkuje fenotypem śluzówki6,7. Polisacharydy Pel i Psl pełnią wiele funkcji, w tym wspomaganie początkowego przyłączania i utrzymywania struktury biofilmu oraz nadawanie oporności na antybiotyki8.
Metody mające na celu wizualizację struktur tkanek in vivo zostały opracowane dla różnych typów próbek9,10,11. Ostatnio zostały one dostosowane do wizualizacji in vivo społeczności drobnoustrojów w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą12. Optymalizacja protokołu oczyszczania tkanek specjalnie do identyfikacji społeczności drobnoustrojów w plwocinie została opracowana przez DePas et al., 201612. Termin MiPACT, który oznacza microbial identification od Passive CLARITY technique, został ukuty dla oczyszczania plwociny CF 11,12. W przypadku technik oczyszczania tkanek próbki są najpierw utrwalane, a następnie stają się przezroczyste, pozostawiając ich naturalną architekturę nienaruszoną do barwienia i wizualizacji mikroskopowej11. Utrwalanie i usuwanie próbek plwociny mukowiscydozy pozwala naukowcom odpowiedzieć na pytania związane ze strukturą biofilmu, gęstością komórek bakteryjnych, powiązaniami wielodrobnoustrojowymi oraz powiązaniami między patogenami a komórkami gospodarza. Zaletą bezpośredniego badania bakterii, które zachowały się w plwocinie, jest to, że można je analizować i wizualizować w kontekście specyficznym dla gospodarza. Chociaż hodowla in vitro izolatów klinicznych w laboratorium w celach eksperymentalnych może być bardzo pouczająca, takie metody nie są w stanie w pełni odtworzyć środowiska płuc mukowiscydozy, co powoduje rozdźwięk między wynikami laboratoryjnymi a wynikami pacjentów.
Przedstawione tutaj metody mogą być używane do utrwalania i usuwania plwociny w celu wizualizacji bakterii, czy to od pacjentów z mukowiscydozą, czy pacjentów z innymi infekcjami dróg oddechowych. Specyficznym rodzajem barwienia i analizy mikroskopowej opisanym w niniejszym dokumencie jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), po której następuje wiązanie przeciwciał anty-Psl w hydrożelu, a następnie analiza za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Po oczyszczeniu tkanek można również zastosować inne metody immunohistochemiczne i mikroskopowe.

<table><tbody><tr><td>29:1 bisakryloamid akrylamidu, roztwór 30 %</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8-komorowa szklana osłona Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Komory perfuzyjne Coverwell</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnazy</td><td>Inhibitor Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Szczegóły zamówienia: Produkt: Zmodyfikowany Oligo DNA; Nazwa: PseaerA; Sekwencja: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synteza: 50 nmol; Oczyszczanie: HPLC; Stan statku: Pełna wydajność (sucha)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>Czerwone przeciwciała Psl0096-Texas były prezentem uprzejmie dostarczonym przez Medimmune i należy skontaktować się z firmą w przypadku pytań dotyczących zamówienia.</td></tr><tr><td>VA-044 Utwardzacz</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Wczesne wykrycie i wyeliminowanie Pseudomonas aeruginosa w płucach pacjentów z mukowiscydozą może zmniejszyć ryzyko rozwoju przewlekłej infekcji. Rozwój przewlekłych zakażeń P. aeruginosa wiąże się ze spadkiem czynności płuc i zwiększoną zachorowalnością. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie wyjaśnieniem przyczyn niepowodzenia w zwalczaniu P. aeruginosa za pomocą antybiotykoterapii, która występuje u około 10-40% pacjentów pediatrycznych. Jednym z wielu czynników, które mogą wpływać na usuwanie P. aeruginosa przez gospodarza i wrażliwość na antybiotyki, są różnice w organizacji przestrzennej (takie jak agregacja lub tworzenie biofilmu) i produkcja polisacharydów. Dlatego byliśmy zainteresowani wizualizacją charakterystyki in situ P. aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą. Technikę oczyszczania tkanek zastosowano do próbek plwociny po osadzeniu próbek w matrycy hydrożelowej w celu zachowania struktur 3D względem komórek gospodarza. Po oczyszczeniu tkanek dodano fluorescencyjne etykiety i barwniki, aby umożliwić wizualizację. Fluorescencyjną hybrydyzację in situ przeprowadzono w celu wizualizacji komórek bakteryjnych, wiązania znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał anty-Psl w celu wizualizacji egzopolisacharydu i barwienia DAPI w celu barwienia komórek gospodarza w celu uzyskania wglądu strukturalnego. Metody te pozwoliły na obrazowanie P. aeruginosa w wysokiej rozdzielczości w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Rysunek 1 zawiera podsumowanie protokołów przetwarzania i klarowania plwociny. Przetwarzanie i klarowanie plwociny może trwać do 17 dni. Protokół można jednak przerwać, a próbki przechowywać po utrwaleniu PFA (dzień 2.) lub po klarowaniu tkanek (dni 5–17, w zależności od czasu klarowania). Na Rysunku 2 podsumowano protokoły hybrydyza...

Ten protokół dostarcza metod wizualizacji komórek bakteryjnych i polisacharydów syntezy locus (Psl) w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą.

Wizualizacja Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na bezpośrednią wizualizację Pseudomonas aeruginosa i egzopolisacharydu Psl w plwocinie mukowiscydozy. Technika ta pomaga odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, w jaki sposób organizacja przestrzenna P.aeruginosa, taka jak agregacja lub biofilmy, wpływa na usuwanie gospodarza i podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Odkrztuszoną plwocinę należy przechowywać w sterylnym kubku zbiorczym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie 24 godziny przed utrwaleniem.Gdy będziesz gotowy do utrwalenia próbek, przenieś je do sterylnej 15-mililitrowej probówki i dodaj równą objętość 4% PFA, a następnie inkubuj plwocinę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyj próbki, dodając pięć mililitrów PBS na każde dwa mililitry utrwalonej plwociny. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy.Zawiesić osad w podwójnej objętości PBS z 0,01% azydkiem sodu i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj dwa mililitry 30%29 do jednego roztworu akrylamidu/bisakryloamidu do trzymililitrowej probówki ze zdjętą nakrętką wewnątrz szczelnie zamkniętego pojemnika anaerobowego, a następnie dodaj 0,5 grama utwardzacza do dwóch mililitrów PBS w trzymililitrowej probówce. Pozostaw nakrętkę z tubki i przechowuj ją w szczelnie zamkniętym pojemniku beztlenowym.Pozostaw kilka mililitrów sterylnego PBS w probówce ze zdjętą nakrętką wewnątrz pojemnika beztlenowego. Odgazować składniki hydrożelu w szczelnie zamkniętym pojemniku z okładem beztlenowym przez 72 godziny. Przygotować 2,5 mililitra roztworu hydrożelu o końcowym stężeniu 0,2% utwardzacza i 4% akrylamidu/bisakryloamidu w PBS w 15-mililitrowej probówce i wymieszać hydrożel przez odwrócenie, a następnie przefiltrować sterylizację roztworu.Pokrój próbki plwociny na dwie małe części za pomocą skalpela, a następnie umieść każdą próbkę w studzience z ośmiokomorowym pokrytym szkiełkiem. Dodaj 300 mikrolitrów wysterylizowanego roztworu hydrożelu z filtrem do każdej studzienki zawierającej plwocinę i umieść ją w szczelnie zamkniętym pojemniku z okładem beztlenowym na trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś zestalone próbki plwociny hydrożelowej do 15-mililitrowej probówki hodowlanej z pięcioma mililitrami 8% SDS o pH ósmym i pozostaw próbki do oczyszczenia przez trzy do 14 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż plwocina stanie się przezroczysta.Użyj sterylnej pęsety, aby przenieść każdą próbkę zatopioną w hydrożelu do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i dodaj 10 mililitrów PBS, aby umyć hydrożel. Pozostaw roztwór na 30 do 60 minut przed zdekantacją, a następnie powtórz pranie jeszcze dwa razy. Umyte próbki należy przechowywać w PBS z 0,01% azydkiem sodu i inhibitorem RNazy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyjmij próbki hydrożelu z roztworu do przechowywania i umieść je na sterylnej powierzchni. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój hydrożele na plastry o grubości około jednego milimetra i umieść skrawki w tubkach o pojemności 1,5 mililitra. Przygotuj jeden mililitr buforu hybrydyzacyjnego w 1,5-mililitrowej probówce, a następnie dodaj fluorescencyjnie znakowaną sondę Seer A i wymieszaj przez inwersję.Dodaj 200 do 500 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do każdej sekcji, upewniając się, że cała próbka hydrożelu jest zanurzona. Pozwól sondzie Seer A na hybrydyzację z próbkami hydrożelu, umieszczając je w ciemności na około 18 do 24 godzin w temperaturze 46 stopni Celsjusza bez wstrząsania, a następnie dodaj jeden mililitr świeżego buforu do płukania do probówek i inkubuj je w ciemności przez sześć godzin w temperaturze 48 stopni Celsjusza. Dodaj 500 mikrolitrów 2% BSA i PBS do próbek hydrożelu, aby zablokować niespecyficzne wiązanie białek, a następnie inkubuj próbki przez noc w ciemności.Następnego dnia przygotuj roztwór przeciwciała Psl0096-Texas Red, rozcieńczając przeciwciało do końcowego stężenia 0,112 mikrograma na mililitr w 500 mikrolitrach świeżego 2% BSA w PBS. Dodaj roztwór przeciwciała do próbek hydrożelu i inkubuj je w ciemności przez sześć godzin. Następnie wybarwić próbki hydrożelu DAPI, inkubując je z 250 mikrolitrami roztworu RIM i 10 mikrogramami na mililitr DAPI przez noc w ciemności z delikatnym potrząsaniem.Po zabarwieniu zamontuj próbki w komorach perfuzyjnych o średnicy 0,9 lub 1,7 milimetra i uszczelnij je szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Wykonaj konfokalną laserową mikroskopię skaningową z 25, 40, 63 lub 100-krotnym powiększeniem. Protokół ten wykorzystano do uzyskania obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości komórek P.aeruginosa i ich struktury NC2 w plwocinie.Pokazano tutaj agregację komórek w próbce plwociny. Indywidualne kształty pręcików były widoczne na zielono w wyniku specyficznego dla gatunku wiązania sondy Seer A-488 z komórkami P.aeruginosa. Przeciwciało Psl0096-Texas Red pokazuje, że egzopolisacharyd pseudomonalny w plwocinie w większości pokrywał się z komórkami P.aeruginosa.Metodę tę wykorzystano również do wizualizacji komórek rzekomych w plwocinie w stosunku do innych komórek bakteryjnych i struktur gospodarza. Zaobserwowano, że skupisko komórek P.aeruginosa fagocytoza znajduje się w komórce eukariotycznej, podczas gdy w pobliżu zaobserwowano inne małe skupiska komórek kokowych. Wykazano również, że przeciwciało PSL 0096 może wiązać się z PSL wytwarzanym z planktonu P.Aeruginosa.Główną zaletą tej techniki jest to, że wdraża ona podejście do oczyszczania tkanek, a następnie fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie przeciwciałami i mikroskopię konfokalną. Umożliwia to naukowcom wizualizację i wykorzystanie technik przetwarzania obrazu do ilościowego pomiaru różnic w strukturach kolonizacji P.aeruginosa w plwocinie mukowiscydozy w odniesieniu do wyników zdrowotnych pacjenta.

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Źródło: Beaudoin, T. i inni. Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu osłonowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film prezentuje metodę in vitro do oceny, jak plwocina mukowiscydozy pochodząca od pacjentów wpływa na tworzenie biofilmu bakteryjnego. Za pomocą szkiełek komorowych, barwienia fluorescencyjnego oraz mikroskopii konfokalnej ujawnia się zwiększona grubość, zmieniona architektura oraz wyższa żywotna biomasa w biofilmach hodowanych ze plwociną, podkreślając...

Konfokalne obrazowanie biofilmów bakteryjnych indukowanych przez filtry plwociny u pacjentów z mukowiscydozą

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Protokół tutaj demonstruje szybki i ustandaryzowany przepływ pracy szybkiej oceny mikrobiologicznej na miejscu (M-ROSE), obejmujący trzy kroki: tworzenie preparatów, barwienie i interpretację. Protokół ten pomoże lekarzom w podejmowaniu szybkich decyzji klinicznych.

Szybka ocena mikrobiologiczna na miejscu w kierunku chorób zakaźnych płuc

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Poznaj metodę wizualizacji Pseudomonas aeruginosa i egzopolisacharydu Psl w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą. Technika ta pozwala badać organizację przestrzenną bakterii i ich wpływ na skuteczność leczenia przeciwdrobnoustrojowego.

Wizualizacja Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą

Przeglądaj więcej filmów