Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D

Protokół ten pozwala na analizę trójwymiarowej struktury mikroskopii baletowej bardzo dużego człowieka na tkance tłuszczowej myszy. Ułatwienie powiązania patologicznej dysfunkcji ze zmianami strukturalnymi tkanki tłuszczowej. Ten proces oczyszczania jest bardzo prosty, bardzo dobrze przystosowany do usuwania tkanki tłuszczowej człowieka na ciepłych myszach i wykorzystuje mniej toksycznych rozpuszczalników, takich jak etanol lub salicylan metylu w porównaniu z innymi przejrzystymi protokołami.

Zacznij od zanurzenia pobranej myszy lub ludzkiej białej tkanki tłuszczowej w co najmniej 10 mililitrach 4% formaldehydu energetycznego w PBS w 15-mililitrowej plastikowej tubie, najlepiej pod kapturem chemicznym. Potrząśnij chusteczką na szalce do walcowania w temperaturze pokojowej przez godzinę przed przeniesieniem probówki na płytkę do walcowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przepłucz utrwaloną białą tkankę tłuszczową w 10 mililitrach PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady utrwalacza i przenieś tkankę do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów 0,3% glicyny w PBS na godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obrotów na minutę.

Gdy pozostałe wolne grupy aldehydowe zostaną schłodzone, zanurz tkankę w 15-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów 0,2% Triton X-100 w PBS na dwugodzinną inkubację z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji potraktuj tkankę 10 mililitrami 0,2% Triton X-100 i 20% DMSO z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka zanurz tkankę w 15-mililitrowej plastikowej tubie zawierającej 10 mililitrów 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 0,1% deoksycholanu i 20% DMSO w PBS na co najmniej 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem.

Pod koniec inkubacji przepłukać tkankę 10 mililitrami 0,2% Triton X-100 w PBS na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obrotów na minutę przez jedną godzinę. Następnie zanurzenie w 15 mililitrach 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS na 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Do barwienia białej tkanki tłuszczowej.

Przenieś tkankę do 300 mikrolitrów 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS, uzupełnionych podstawowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania w 1,5 mililitrowej mikroprobówce, zabezpiecz ją przed światłem folią aluminiową i umieść probówkę w 50-mililitrowej probówce Falcon. Umieścić probówkę w wytrząsarce orbitalnej na dwudniową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Pod koniec inkubacji płukać tkankę dwa razy w 10 mililitrach 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem i ochroną przed światłem.

Po drugim płukaniu umyj chusteczkę w 10 mililitrach świeżych 0,2%Triton X-100, 10% DMSO i 3%BSA i PBS przez 16 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem, a następnie przenieś chusteczkę do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 300 mikrolitrów 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS, uzupełnione odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi i chronić probówkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Po dwudniowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce, umyj tkankę dwa razy w 10 mililitrach 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem chronionym przed światłem. Po drugim umyciu spłucz chusteczkę do probówki zawierającej 10 mililitrów świeżego 0,2%Triton X-100, 10% DMSO i 3%BSA w PBS przez 16 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem i ochroną przed światłem.

Następnie następuje dwugodzinne pranie w 10 mililitrach samego PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem i ochroną przed światłem. W celu usunięcia białej tkanki tłuszczowej pod koniec płukania PBS zanurzyć tkankę i 10 mililitrów rosnącej serii stężeń etanolu na dwugodzinną inkubację na stężenie w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, chroniąc przed światłem, jak wskazano. Następnego ranka zanurz chusteczkę w 20-mililitrowej szklanej butelce z plastikową nakrętką zawierającą pięć mililitrów salicylanu metylu w dygestorium.

Biała tkanka tłuszczowa jest jeszcze na tym etapie wyraźnie widoczna. Wstrząśnij pojemnikiem, chroń go przed światłem w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny. Biała tkanka tłuszczowa ulega całkowitemu przeszczepowi.

W celu obrazowania konfokalnego 3D barwionej i oczyszczonej białej tkanki tłuszczowej należy zamontować metalową komorę obrazowania wyposażoną w szklane dno i w dygestorium przenieść tkankę do komory. Napełnij komorę świeżym salicylanem metylu. Zakończ montaż komory, dodając małe szkiełko nakrywkowe, aby ustabilizować tkankę i duże szkiełko nakrywkowe, aby zamknąć komorę.

Umieść komorę na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego do obrazowania tkanek w małym powiększeniu, aby wygenerować kilka centymetrów sześciennych map 3D całej próbki tkanki tłuszczowej. Po wygenerowaniu mapy 3D użyj obiektywu pneumatycznego dalekiego zasięgu 20X, który zapewnia dobry stosunek rozdzielczości do głębokości, aby wybrać kilka obszarów do pobrania próbek tkanek w większym powiększeniu. W celu segmentacji komórek przekonwertuj stosy 3D na format oprogramowania, aby zwolnić miejsce w pamięci.

Przed otwarciem modułu komórkowego oprogramowania. Zmień ustawienie wykrywania komórek na barwienie błony plazmatycznej i wybierz kanał fluorescencyjny markera używanego do wyznaczania obwodu komórki. Następnie skonfiguruj progi, podaj zakres oczekiwanych rozmiarów komórek i uruchom segmentację.

Wpływ oczyszczania na białą tkankę tłuszczową u ludzi i myszy można zaobserwować gołym okiem. Oczyszczanie drastycznie poprawia również głębię obrazu tkanki, którą można pozyskać. Ułatwia obrazowanie 3D całych tkanek i generowanie map 3D przy 4-krotnym powiększeniu.

Mapowanie 3D umożliwia ponadto wybór różnych obszarów zainteresowania przy 20-krotnym powiększeniu do głębokości dwóch milimetrów. Specyficzne barwienie kropelek lipidów i adipocytów można uzyskać za pomocą odpowiednio perylipiny i przeciwciał anty-GLUT4. Naczynia krwionośne można wykryć za pomocą przeciwciała CD31 lub dożylnego wstrzyknięcia lektyny DyLight 649 na krótko przed ofiarą.

Makrofagi i limfocyty T można wizualizować za pomocą przeciwciała anty CD301 fikoerytryny i przeciwciała anty TCR beta Pacific blue. Obwodową sieć nerwową można wykryć za pomocą przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozyny. Za pomocą tych oznaczeń można następnie określić średnią wielkość i rozkład wielkości adipocytów oraz gęstość sieci naczyń krwionośnych w tkance tłuszczowej.

Bardzo ważne jest, aby przestrzegać czasu zajęć, jak pokazano, ponieważ złe przygotowanie próbki nie zapewni dobrej jakości obrazu. Protokół ten może być połączony z zaawansowanym systemem obrazowania lub może być sprzężony z darmowym oprogramowaniem do analizy obrazu po przetworzeniu.