Name: Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania salicylanem metylu do wizualizacji 3D tkanki tłuszczowej myszy i człowieka. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie struktury adipocytów, naczyń krwionośnych i komórek odpornościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez INSERM, Université Côte d'Azur, oraz przez granty z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR) za pośrednictwem Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programu UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) poprzez Academy 2 "Systèmes Complexes" i Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) oraz Program dla Młodych Badaczy dla J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Dziękujemy również Centralnemu Ośrodku Obrazowania C3M finansowanemu przez Conseil Départemental des Alpes-Maritimes i Région PACA, a także wspieranemu przez IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Dziękujemy Marion Dussot za pomoc techniczną w przygotowaniu tkanek. Dziękujemy Abby Cuttriss z UCA International Scientific Visibility za korektę manuskryptu.

Ten protokół został przetestowany i jest zatwierdzony dla wszystkich mysich i ludzkich magazynów białej tkanki tłuszczowej. Tkanki tłuszczowe ludzkie i mysie zostały pobrane zgodnie z prawem europejskim i zatwierdzone przez francuskie i szwedzkie komisje etyczne.
1. Utrwalenie mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Zanurz pobraną myszą lub ludzką białą tkankę tłuszczową w co najmniej 10 ml PBS zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA) w plastikowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Potrząsaj plastikową rurką w temperaturze pokojowej na walcarce przez 1 godzinę.</li>
	<li>Pozostawić plastikową rurkę w temperaturze 4 °C na płycie do walcowania na noc, aby zakończyć mocowanie. 
	UWAGA: Protokół ten jest dostosowany do dużych próbek tkanki tłuszczowej, takich jak całe poduszeczki tłuszczowe najądrza uzyskane od myszy karmionych normalną dietą (≈250 mg - ≈0,6 cm3). W przypadku większych próbek, takich jak poduszeczki tłuszczowe najądrza uzyskane od myszy karmionych dietą wysokotłuszczową (≈1,5 g - ≈4 cm3) lub próbek ludzkiej tkanki tłuszczowej, chociaż protokół oczyszczania powinien doskonale działać dla całej próbki (poprzez zwiększenie stężenia PFA i mieszanin przeciwciał), na ogół kroimy kawałki tkanek około 1 g (≈2,5 cm3), aby zarezerwować pozostałe próbki do dodatkowego barwienia lub zastosowań. W przypadku PFA (krok 1.1.) zalecamy użycie około 10-krotności objętości tkanki. W przypadku mieszanin przeciwciał (kroki 3.1 i 3.4) należy zwiększyć objętość, aby całkowicie zanurzyć tkankę, i użyć plastikowej probówki o pojemności 15 ml (patrz Tabela materiałów), jeśli tkanka jest zbyt duża dla plastikowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Permeabilizacja i nasycenie mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Utrwaloną białą tkankę tłuszczową płukać w 10 ml PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady PFA.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,3% glicyną (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej przez 1 godzinę przy 100 obrotach na minutę (obr./min) w celu ugaszenia pozostałych wolnych grup aldehydowych.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100 (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przez 2 godziny przy 100 obr./min.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100 i 20% DMSO (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez noc.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,1% Tween-20 (patrz tabela materiałów), 0,1% Triton X-100, 0,1% deoksycholanu (patrz tabela materiałów) i 20% DMSO i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przy 100 obr./min przez co najmniej 24 godziny.</li>
	<li>Wypłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100 i potrząśnij probówką w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przy 100 obr./min przez 12 godzin, aby nasycić wszelkie miejsca, które mogłyby niespecyficznie wiązać przeciwciała. 
	UWAGA: W kroku 2.7 BSA można zastąpić surowicą krwi gatunku użytego przeciwciała drugorzędowego.</li>
</ol>
3. Procedura barwienia mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Przenieś tkankę w plastikowej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA i przeciwciałami pierwszorzędowymi (10 razy bardziej skoncentrowanymi niż w przypadku barwienia kriosekcją, ale dla każdego przeciwciała należy ocenić optymalne stężenie przeciwciał). Chronić probówkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową i wstrząsać probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez co najmniej dwa dni (patrz uwaga w kroku 1.1 i kroku 3.7.1).</li>
	<li>Wypłucz chusteczkę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i potrząśnij probówką chronioną przed światłem w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze 100 obr./min przez 5 godzin. Wykonaj ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Wypłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i wstrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze 100 obr./min przez jedną noc do dwóch dni.</li>
	<li>Przenieś tkankę do plastikowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl PBS uzupełnionego 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA i przeciwciałami drugorzędowymi (10 razy bardziej skoncentrowanymi niż w przypadku barwienia kriosekcyjnego). Chronić probówkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową i wstrząsać probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez co najmniej dwa dni (patrz uwaga w kroku 1.1 i kroku 3.7.1).</li>
	<li>Opłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i potrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze 100 obr./min przez 5 godzin. Wykonaj ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Wypłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i wstrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przy 100 obr./min przez jedną noc do dwóch dni.</li>
	<li>Wypłukać chusteczkę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS i wstrząsnąć probówką, chroniąc przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez 2 h. 
	UWAGA: W celu znakowania specyficznych struktur, takich jak jądra lub aktyna, należy dodać 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI lub równoważny) i/lub znakowaną fluorescencyjnie falloidynę w kroku 3.1. gdy stosowane są tylko znakowane fluorescencyjnie przeciwciała pierwszorzędowe lub na etapie 3.4. gdy stosowane są przeciwciała drugorzędowe. 
	UWAGA: Do procedury barwienia można użyć przeciwciał pierwszorzędowych już sprzężonych z fluorochromami (takich jak te stosowane w cytometrii przepływowej) i zalecamy to ze względu na zysk czasu i swoistości. Rzeczywiście, nawet jeśli można zastosować mysie przeciwciała pierwszorzędowe, a następnie drugorzędowe przeciwciała mysie, jak wykazaliśmy tutaj, często obserwowaliśmy niespecyficzne zabarwienie naczyń krwionośnych spowodowane krążącą immunoglobuliną. Dlatego, aby uniknąć tego problemu, wysoce zalecane są przeciwciała pierwszorzędowe, które są już znakowane, a tutaj przedstawiamy dowody na to, że przeciwciała stosowane w cytometrii przepływowej są zgodne z naszą procedurą. Jednak w szczególnym przypadku antygenu, którego ekspresja jest na niskich poziomach, obowiązkowy jest etap amplifikacji sygnału za pomocą przeciwciał drugorzędowych; gdy jedyne dostępne przeciwciało pierwszorzędowe jest wytwarzane u myszy, perfuzja serca myszy z PBS przez co najmniej 5 minut podczas ofiarowania może usunąć dużą część krążącej immunoglobuliny, a tym samym niespecyficzne barwienie.</li>
</ol>
4. Procedura oczyszczania białej tkanki tłuszczowej myszy i człowieka
<ol>
	<li>Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 50% etanolu i potrząsaj probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 70% etanolu i potrząsaj probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 95% etanolu i potrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 100% etanolu i potrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 100% etanolu i wstrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez noc.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w szklanej butelce o pojemności 20 ml z plastikową nakrętką (patrz tabela materiałów) zawierającej 5 ml salicylanu metylu (patrz tabela materiałów) pod kapturem chemicznym i wstrząsnąć szklanym pojemnikiem, chronionym przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez co najmniej 2 godziny 
	UWAGA: Procedurę rozliczania można znacznie przyspieszyć (w razie potrzeby), unikając kroków 4.3. i 4,5., chociaż końcowa jakość czyszczenia byłaby nieznacznie obniżona.</li>
</ol>
5. 3D-konfokalne obrazowanie oczyszczonej białej tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Przenieść tkankę do metalowej komory obrazowania wyposażonej w szklane dno (patrz tabela materiałów) pod kapturem chemicznym i napełnić komorę świeżym salicylanem metylu. 
	UWAGA: Aby zabezpieczyć tkankę na miejscu, a tym samym zapobiec jej unoszeniu się lub przesuwaniu na boki w komorze, nałóż wiele okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm (patrz Tabela materiałów) na chusteczkę podczas wkładania jej do komory.</li>
	<li>Umieść komorę obrazowania na odwróconym mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Zobrazuj tkankę za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (np. obiektywu 4x), aby wygenerować mapy 3D o wielkości kilku cm3 całej tkanki tłuszczowej lub próbki tkanki ludzkiej.</li>
	<li>Wybierz kilka obszarów do pobrania tkanki w większym powiększeniu. Zazwyczaj używa się obiektywu powietrznego o dużym zasięgu 20x, który zapewnia dobry stosunek rozdzielczości do głębokości. Pozyskujemy duże obrazy mozaikowe ze stosami z o głębokości od 600 do 2000 μm. 
	UWAGA: Użyj obiektywu długodystansowego, aby zobrazować głębiej w tkance.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja wyników ilościowych z obrazów 3D tkanki tłuszczowej
UWAGA: Segmentacja różnych struktur i późniejsza ekstrakcja informacji ilościowych ze stosu obrazów 3D wygenerowanych w punkcie 5 może być przeprowadzona przy użyciu dowolnej z wielu istniejących opcji oprogramowania do analizy obrazu, zarówno komercyjnego, jak i darmowego. W poniższych punktach opisujemy strategię, która jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium w celu wydobycia informacji ilościowych z obrazów 3D tkanki tłuszczowej za pomocą komercyjnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przekonwertuj stosy 3D na format oprogramowania, aby zwolnić miejsce w pamięci.</li>
	<li>Podziel komórki na segmenty.
	<ol>
		<li>Otwórz moduł Cell w oprogramowaniu.</li>
		<li>Zmień ustawienie Cell Detection (Wykrywanie komórek) na Plasma membrane (Barwienie błony plazmatycznej).</li>
		<li>Wybierz kanał fluorescencyjny markera używanego do wyznaczania obwodu komórki (falloidyna, która oznacza aktynę korową lub markery błony plazmatycznej, takie jak F4 / 80 dla makrofagów, TCR-β dla limfocytów T lub klaster różnicujących białek CD specyficznych dla podtypów komórek odpornościowych).</li>
		<li>Ustaw progi i podaj zakres oczekiwanej wielkości komórki (tj. od 1 do 200 μm w przypadku wykrywania komórek).</li>
		<li>Uruchom segmentację. Objętość odpowiadająca stosowi z zostanie wygenerowana z segmentowanymi komórkami oznaczonymi innym kolorem dla każdej z sąsiednich komórek.</li>
		<li>Zastosuj filtry statystyczne (rozmiar, okrągłość, okrągłość itp.) w zakładce statystyki, aby wykluczyć artefakty segmentacji i/lub zawęzić segmentowane komórki do komórki będącej przedmiotem zainteresowania na podstawie ich wielkości (tj. 20-200 μm dla adipocytów; 5-25 μm dla makrofagów; 1-3 μm dla limfocytów).</li>
		<li>Wyodrębnij pomiary i dane ilościowe (objętość, liczba, rozmiar, średnica itp.) z zakładki statystyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Segmentuj składniki komórkowe (jądra, pęcherzyki itp.) lub naczynia jako strukturę. 
	UWAGA: Chociaż segmentacja włókien jest bardzo przydatna do badania połączeń naczyń, używamy segmentacji modułu powierzchniowego do wyodrębnienia danych o rozmiarze, objętości i średnicach naczyń. Rzeczywiście, kwantyfikacja rozmiarów naczyń jest tracona podczas korzystania z modułu filamentów.
	<ol>
		<li>Otwórz moduł Surface w oprogramowaniu.</li>
		<li>Wybierz kanał fluorescencyjny markera używanego do specyficznego oznaczania komponentu subkomórkowego, aby zrekonstruować go w 3D.</li>
		<li>Ustal progi i podaj zakres oczekiwanej średnicy struktury (tj. 0,5-5 μm dla jąder; 0-100 μm dla naczyń itp.).</li>
		<li>Uruchom segmentację. Zostanie wygenerowany wolumin z segmentowaną strukturą komórkową. Pomiary i dane ilościowe (objętość, liczba, rozmiar, średnica itp.) można pobrać z zakładki statystyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podziel naczynia na segmenty jako kontinuum rurowe. 
	UWAGA: Chociaż segmentacja włókien jest bardzo przydatna do badania połączeń naczyń, używamy segmentacji modułu powierzchniowego do wyodrębnienia danych o rozmiarze, objętości i średnicach naczyń. Rzeczywiście, kwantyfikacja rozmiarów naczyń jest tracona podczas korzystania z modułu filamentów.
	<ol>
		<li>Otwórz moduł Filamenty w oprogramowaniu.</li>
		<li>Wybierz kanał fluorescencyjny odpowiadający barwieniu naczynia.</li>
		<li>Ustaw progi intensywności fluorescencji i wybierz odpowiednią liczbę oczekiwanych węzłów łączących.</li>
		<li>Uruchom segmentację. Filamenty reprezentujące sieć naczyń zostaną wygenerowane w 3D. Pomiary można pobrać z zakładki statystyki, co pozwala na uzyskanie danych ilościowych m.in. długości naczynia, liczby rozgałęzień naczyń itp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+plasticity%3A+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li>
<li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin%2C+Leptin%2C+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li>
<li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metabolic+complications+in+obesity%3A+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Clinical+Nutrition+%26+Metabolic+Care%22%5BJournal%5D)">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li>
<li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li>
<li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375(2015).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li>
<li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592(2018).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity%3A+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li>
<li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).</li>
<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipo-Clear%3A+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271(2018).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553(2017).</li>
<li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22(2014).</li>
<li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+%28sDISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368(2019).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22%C3%9Cber+das+Durchsichtigmachen+von+Menchlichen+und+Tierichen+Pr%C3%A4paraten+und+Seine+Theoretischen%22">Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen</a>. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).</li>
<li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Adipose+Tissue+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li>
<li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li>
<li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li>
<li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).</li>
<li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+changes+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).</li>
<li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation%3A+plasticity+of+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li>
<li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li>
<li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).</li>
<li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Modyfikacje, które zachodzą w tkance tłuszczowej w trakcie patologicznej progresji, takie jak otyłość, mają fundamentalne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów stojących za patologią. Pionierskie badania, które ujawniły takie mechanizmy w tkance tłuszczowej, opierają się na globalnych podejściach, takich jak proteomika całej tkanki tłuszczowej21, cytometria przepływowa 22,23 i transkryptomika24,25<sup cla...

Otyłość charakteryzuje się wzrostem masy tkanki tłuszczowej i stała się głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, biorąc pod uwagę, że osoby z otyłością mają zwiększone ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2, chorób wątroby i niektórych nowotworów.
Podstawową funkcją fizjologiczną tkanki tłuszczowej jest modulowanie homeostazy glukozy i lipidów w całym ciele1,2. W okresie karmienia adipocyty (czyli główne komórki tkanki tłuszczowej) magazynują nadmiar glukozy i lipidów dostarczonych przez posiłek w trójglicerydy. Podczas postu adipocyty rozkładają trójglicerydy na nieestryfikowane kwasy tłuszczowe i glicerol, aby podtrzymać zapotrzebowanie organizmu na energię. Podczas rozwoju otyłości tkanka tłuszczowa rozszerza się poprzez zwiększenie rozmiaru (przerost) i/lub liczby (hiperplazja) adipocytów1, w celu zwiększenia ich pojemności magazynowej. Kiedy ekspansja tkanki tłuszczowej osiąga swój limit, stały, bardzo zmienny wśród pacjentów, pozostałe lipidy gromadzą się w innych narządach metabolicznych, w tym mięśniach i wątrobie3,4, prowadząc do ich niewydolności funkcjonalnej i inicjując powikłania sercowo-metaboliczne związane z otyłością1,5. Dlatego zidentyfikowanie mechanizmów rządzących rozrastaniem się tkanki tłuszczowej jest kluczowym wyzwaniem klinicznym.
Modyfikacje morfologiczne udokumentowane w tkance tłuszczowej podczas otyłości są związane z jej patologiczną dysfunkcją. Do opisania organizacji tkanki tłuszczowej zastosowano kilka procedur barwienia, w tym aktynę6, markery naczyniowe7, markery kropelek lipidów8 i specyficzne markery komórek odpornościowych9,10. Jednak ze względu na ogromną średnicę adipocytów (od 50 do 200 μm)11, konieczne jest przeanalizowanie dużej części całej tkanki w trzech wymiarach, aby dokładnie przeanalizować dramatyczne zmiany strukturalne AT obserwowane podczas otyłości. Ponieważ jednak światło nie przenika przez nieprzezroczystą tkankę, obrazowanie w 3D dużych próbek tkanek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej nie jest możliwe. Metody oczyszczania tkanek w celu nadania im przezroczystości zostały opisane w literaturze (przegląd, patrz12), co pozwala na oczyszczenie tkanek i przeprowadzenie dogłębnej mikroskopii fluorescencyjnej całych tkanek. Metody te oferują bezprecedensowe możliwości oceny organizacji komórkowej 3D w zdrowych i chorych tkankach. Każda z opisanych metod ma zalety i wady, dlatego musi być starannie dobrana w zależności od badanej tkanki (przegląd, patrz13). Rzeczywiście, niektóre podejścia wymagają długiego okresu inkubacji i/lub użycia materiałów lub związków, które są drogie, toksyczne lub trudne do uzyskania14,15,16,17,18,19. Korzystając z jednego z pierwszych związków użytych sto lat temu przez Wernera Spalteholza do oczyszczania tkanek20, stworzyliśmy przyjazny dla użytkownika i niedrogi protokół, który jest bardzo dobrze przystosowany do oczyszczania wszystkich mysich i ludzkich magazynów tkanki tłuszczowej w dowolnym laboratorium z typowym wyposażeniem, w tym kapturem chemicznym, wytrząsarką orbitalną o kontrolowanej temperaturze i mikroskopem konfokalnym.

<table><tbody><tr><td>Mikroprobówki Eppendorff 1,5 ml</td><td>- Dutscher</td><td>33528</td><td></td></tr><tr><td>Probówki plastikowe 15 ml</td><td>Probówki Falcon - Dutscher</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>18 mm okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>Mariendfeld</td><td>0117580</td><td></td></tr><tr><td>szklana butelka 20 ml</td><td>Wheaton</td><td>986546</td><td></td></tr><tr><td>sprzężone przeciwciało anty-mysie-alexa647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-605-150</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr>przeciwciało <tr><td>sprzężone anty-rabbit-alexa647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Przeciwciało Sigma-aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>CD301-PE</td><td>Biolegend</td><td>BLE145703</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD31</td><td>AbCam</td><td>ab215912</td><td>Rozcieńczenie: 1/50</td></tr><tr><td>Komercyjne oprogramowanie do analizy 3D - instrument</td><td></td> <td>IMARIS Oxford</td><td>z modułem komórkowym</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny - Nikon A1R Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Stężenie podstawowe: 5 mg / mL; rozcieńczenie 1/1000</td></tr><tr><td>Deoksycholan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Glut4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53566</td><td>Rozcieńczenie: 1/50</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Lectin-DyLight649</td><td>Vector Lab</td><td>DL-1178-1</td><td>Stężenie zapasów: 2 i mikro; g/&mikro; L; Wtrysk dożylny: 50 i mikro; L/myszy</td></tr>: <tr><td>Metaliczna komora obrazowania wyposażona w szklane dno - Komora AttoFluor</td><td>Thermofisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Salicylan metylu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało perylopinowe</td><td>Progen</td><td>651156</td><td>Rozcieńczenie: 1/50</td></tr><tr><td>Phalloidin-alexa488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>przeciwciało TCR-&beta;-PB</td><td>Biolegend</td><td>BLE109225</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>przeciwciało</td><td>TH AbCam</td><td>ab112</td><td>Rozcieńczenie: 1/50</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P416</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3d

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Otyłość jest głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, który zwiększa ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2 i chorób wątroby. Otyłość charakteryzuje się wzrostem masy tkanki tłuszczowej (AT) z powodu przerostu adipocytów i/lub przerostu, co prowadzi do głębokiej przebudowy jej trójwymiarowej struktury. Rzeczywiście, maksymalna zdolność AT do rozszerzania się podczas otyłości ma kluczowe znaczenie dla rozwoju patologii związanych z otyłością. Ta ekspansja AT jest ważnym mechanizmem homeostatycznym, umożliwiającym adaptację do nadmiaru pobieranej energii i unikającym szkodliwego rozlewania się lipidów na inne narządy metaboliczne, takie jak mięśnie i wątroba. Dlatego zrozumienie przebudowy strukturalnej, która prowadzi do niepowodzenia ekspansji AT, jest fundamentalnym pytaniem o dużym zastosowaniu klinicznym. W tym artykule opisujemy prostą i szybką metodę oczyszczania, która jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium do badania morfologii mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Ta zoptymalizowana metoda usuwania AT jest łatwo wykonywana w każdym standardowym laboratorium wyposażonym w kaptur chemiczny, wytrząsarkę orbitalną o kontrolowanej temperaturze i mikroskop fluorescencyjny. Co więcej, stosowane związki chemiczne są łatwo dostępne. Co ważne, metoda ta pozwala na rozpoznanie struktury 3D AT poprzez barwienie różnych markerów w celu specyficznej wizualizacji adipocytów, sieci neuronalnych i naczyniowych oraz wrodzonej i adaptacyjnej dystrybucji komórek odpornościowych.

Stosując opisaną tutaj i podsumowaną na Rysunku 1 procedurę, udało nam się przeprowadzić barwienie i optyczne klarowanie tkanki tłuszczowej białej człowieka oraz myszy, co przedstawiono odpowiednio na Rysunku 2A oraz Rysunku 2B. Sklarowaną tkankę przeniesiono do metalowej komory obrazowej w celu wykonania obrazowania konfokalnego (Rysunek 3A). Klarowanie drastycznie poprawiło głębokość obrazowania tkank...

Tutaj opisujemy prostą, tanią i szybką metodę oczyszczania struktury 3D zarówno mysjej, jak i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą kombinacji markerów do wizualizacji układu naczyniowego, jąder, komórek odpornościowych, neuronów i białek płaszcza lipidowo-kropelkowego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Protokół ten pozwala na analizę trójwymiarowej struktury mikroskopii baletowej bardzo dużego człowieka na tkance tłuszczowej myszy. Ułatwienie powiązania patologicznej dysfunkcji ze zmianami strukturalnymi tkanki tłuszczowej. Ten proces oczyszczania jest bardzo prosty, bardzo dobrze przystosowany do usuwania tkanki tłuszczowej człowieka na ciepłych myszach i wykorzystuje mniej toksycznych rozpuszczalników, takich jak etanol lub salicylan metylu w porównaniu z innymi przejrzystymi protokołami.Zacznij od zanurzenia pobranej myszy lub ludzkiej białej tkanki tłuszczowej w co najmniej 10 mililitrach 4% formaldehydu energetycznego w PBS w 15-mililitrowej plastikowej tubie, najlepiej pod kapturem chemicznym. Potrząśnij chusteczką na szalce do walcowania w temperaturze pokojowej przez godzinę przed przeniesieniem probówki na płytkę do walcowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przepłucz utrwaloną białą tkankę tłuszczową w 10 mililitrach PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady utrwalacza i przenieś tkankę do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów 0,3% glicyny w PBS na godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obrotów na minutę.Gdy pozostałe wolne grupy aldehydowe zostaną schłodzone, zanurz tkankę w 15-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów 0,2% Triton X-100 w PBS na dwugodzinną inkubację z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji potraktuj tkankę 10 mililitrami 0,2% Triton X-100 i 20% DMSO z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka zanurz tkankę w 15-mililitrowej plastikowej tubie zawierającej 10 mililitrów 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 0,1% deoksycholanu i 20% DMSO w PBS na co najmniej 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem.Pod koniec inkubacji przepłukać tkankę 10 mililitrami 0,2% Triton X-100 w PBS na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obrotów na minutę przez jedną godzinę. Następnie zanurzenie w 15 mililitrach 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS na 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Do barwienia białej tkanki tłuszczowej.Przenieś tkankę do 300 mikrolitrów 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS, uzupełnionych podstawowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania w 1,5 mililitrowej mikroprobówce, zabezpiecz ją przed światłem folią aluminiową i umieść probówkę w 50-mililitrowej probówce Falcon. Umieścić probówkę w wytrząsarce orbitalnej na dwudniową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Pod koniec inkubacji płukać tkankę dwa razy w 10 mililitrach 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem i ochroną przed światłem.Po drugim płukaniu umyj chusteczkę w 10 mililitrach świeżych 0,2%Triton X-100, 10% DMSO i 3%BSA i PBS przez 16 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem, a następnie przenieś chusteczkę do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 300 mikrolitrów 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS, uzupełnione odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi i chronić probówkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Po dwudniowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce, umyj tkankę dwa razy w 10 mililitrach 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA w PBS przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem chronionym przed światłem. Po drugim umyciu spłucz chusteczkę do probówki zawierającej 10 mililitrów świeżego 0,2%Triton X-100, 10% DMSO i 3%BSA w PBS przez 16 do 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem i ochroną przed światłem.Następnie następuje dwugodzinne pranie w 10 mililitrach samego PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem i ochroną przed światłem. W celu usunięcia białej tkanki tłuszczowej pod koniec płukania PBS zanurzyć tkankę i 10 mililitrów rosnącej serii stężeń etanolu na dwugodzinną inkubację na stężenie w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, chroniąc przed światłem, jak wskazano. Następnego ranka zanurz chusteczkę w 20-mililitrowej szklanej butelce z plastikową nakrętką zawierającą pięć mililitrów salicylanu metylu w dygestorium.Biała tkanka tłuszczowa jest jeszcze na tym etapie wyraźnie widoczna. Wstrząśnij pojemnikiem, chroń go przed światłem w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny. Biała tkanka tłuszczowa ulega całkowitemu przeszczepowi.W celu obrazowania konfokalnego 3D barwionej i oczyszczonej białej tkanki tłuszczowej należy zamontować metalową komorę obrazowania wyposażoną w szklane dno i w dygestorium przenieść tkankę do komory. Napełnij komorę świeżym salicylanem metylu. Zakończ montaż komory, dodając małe szkiełko nakrywkowe, aby ustabilizować tkankę i duże szkiełko nakrywkowe, aby zamknąć komorę.Umieść komorę na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego do obrazowania tkanek w małym powiększeniu, aby wygenerować kilka centymetrów sześciennych map 3D całej próbki tkanki tłuszczowej. Po wygenerowaniu mapy 3D użyj obiektywu pneumatycznego dalekiego zasięgu 20X, który zapewnia dobry stosunek rozdzielczości do głębokości, aby wybrać kilka obszarów do pobrania próbek tkanek w większym powiększeniu. W celu segmentacji komórek przekonwertuj stosy 3D na format oprogramowania, aby zwolnić miejsce w pamięci.Przed otwarciem modułu komórkowego oprogramowania. Zmień ustawienie wykrywania komórek na barwienie błony plazmatycznej i wybierz kanał fluorescencyjny markera używanego do wyznaczania obwodu komórki. Następnie skonfiguruj progi, podaj zakres oczekiwanych rozmiarów komórek i uruchom segmentację.Wpływ oczyszczania na białą tkankę tłuszczową u ludzi i myszy można zaobserwować gołym okiem. Oczyszczanie drastycznie poprawia również głębię obrazu tkanki, którą można pozyskać. Ułatwia obrazowanie 3D całych tkanek i generowanie map 3D przy 4-krotnym powiększeniu.Mapowanie 3D umożliwia ponadto wybór różnych obszarów zainteresowania przy 20-krotnym powiększeniu do głębokości dwóch milimetrów. Specyficzne barwienie kropelek lipidów i adipocytów można uzyskać za pomocą odpowiednio perylipiny i przeciwciał anty-GLUT4. Naczynia krwionośne można wykryć za pomocą przeciwciała CD31 lub dożylnego wstrzyknięcia lektyny DyLight 649 na krótko przed ofiarą.Makrofagi i limfocyty T można wizualizować za pomocą przeciwciała anty CD301 fikoerytryny i przeciwciała anty TCR beta Pacific blue. Obwodową sieć nerwową można wykryć za pomocą przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozyny. Za pomocą tych oznaczeń można następnie określić średnią wielkość i rozkład wielkości adipocytów oraz gęstość sieci naczyń krwionośnych w tkance tłuszczowej.Bardzo ważne jest, aby przestrzegać czasu zajęć, jak pokazano, ponieważ złe przygotowanie próbki nie zapewni dobrej jakości obrazu. Protokół ten może być połączony z zaawansowanym systemem obrazowania lub może być sprzężony z darmowym oprogramowaniem do analizy obrazu po przetworzeniu.

exploring-adipose-tissue-structure-methylsalicylate-clearing-3d

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) ma krytyczne braki w swoich obecnych pierwotnych modelach hodowli, co utrudnia rozwój farmakologiczny i badania metaboliczne. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania układu mikrofizjologicznego tkanki tłuszczowej poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek zrębu. Ta konstrukcja zapewnia stabilną i adaptowalną platformę dla podstawowej kultury WAT.

Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Przedmiotem niniejszego badania jest zademonstrowanie techniki barwienia immunologicznego i wizualizacji jako idealnej metody do obrazowania 3D architektury tkanki tłuszczowej i komponentu komórkowego.

Wizualizacja struktury 3D białej tkanki tłuszczowej za pomocą barwienia całościowego

Tworzenie nowych naczyń krwionośnych i unerwienie współczulne odgrywają kluczową rolę w przebudowie tkanki tłuszczowej. Pozostają jednak kwestie techniczne związane z wizualizacją i ilościowym pomiarem tkanki tłuszczowej. Poniżej przedstawiamy protokół, który pozwala skutecznie oznaczyć i ilościowo porównać gęstości naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w różnych tkankach tłuszczowych.

Współbarwienie naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w tkance tłuszczowej

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Zastąpienie zdrowej tkanki mięśniowej tłuszczem śródmięśniowym jest charakterystyczną cechą ludzkich chorób i schorzeń. Protokół ten określa, jak wizualizować, obrazować i określać ilościowo śródmięśniową tkankę tłuszczową, umożliwiając rygorystyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw tworzenia się śródmięśniowej tkanki tłuszczowej.

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Poznaj metodę oczyszczania salicylanem metylu do wizualizacji 3D tkanki tłuszczowej myszy i człowieka. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie struktury adipocytów, naczyń krwionośnych i komórek odpornościowych.

Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D

Przeglądaj więcej filmów