Wykrywanie wariantów genetycznych w genie CALR za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości
26 sierpnia 2020
Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) jest czułym i szybkim rozwiązaniem do wykrywania wariantów genetycznych. Zależy to od różnic w sekwencji, które powodują, że heterodupleksy zmieniają kształt krzywej topnienia. Łącząc HRM i elektroforezę w żelu agarozowym, można zidentyfikować różne rodzaje wariantów genetycznych, takich jak indele.
Metoda ta dokładnie określa mutacje kalretikuliny u pacjentów z podejrzeniem choroby hematologicznej, zwłaszcza gdy inne opcje diagnostyczne są ograniczone lub występują u nich stany niehematologiczne. Główną zaletą techniki lustra o wysokiej rozdzielczości jest wykrywanie powszechnych somatycznych wariantów genetycznych w obszarze hotspotu genu kalretykuliny przy akceptowalnej granicy wykrywalności i przystępnych kosztach. Technika ta umożliwia szybką i nieinwazyjną diagnostykę zaburzeń mieloproliferacyjnych, zwłaszcza nadpłytkowości pierwotnej i pierwotnego zwłóknienia szpiku.
Obecnie nie ma to wpływu na wybór terapii u tych pacjentów. W przyszłości może się to jednak zmienić. Rozpocznij od przygotowania głównej mieszanki qPCR HRM zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, co wystarcza na trzy powtórzenia każdej próbki DNA i kontroli.
Wymieszaj zawartość reakcji, delikatnie stukając i odwracając probówkę i wirując przez dwie do trzech sekund, a następnie krótko obróć probówkę, aby zebrać rozproszone kropelki. Przenieś 19 mikrolitrów głównej mieszanki qPCR HRM do każdej studzienki 96-dołkowej płytki reakcji optycznej. Odpipetować jeden mikrolitr kontroli ujemnych, kontroli dodatnich i próbek do odpowiednich dołków płytki do kontroli bez matrycy lub NTC przy jednym mikrolitrze sterylnego RNA i wolnej wody DNA używanej do przygotowania głównej mieszanki qPCR HRM zamiast DNA.
Szczelnie uszczelnij płytkę reakcyjną optyczną folią samoprzylepną, aby zapobiec parowaniu podczas pracy. Następnie wiruj go w temperaturze 780 razy G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Sprawdź, czy ciecz znajduje się na dnie studzienek na płytce reakcyjnej i uruchom test.
Przypisz elementy sterujące i próbki do odpowiednich studzienek w oprogramowaniu systemu przyrządu i zmień domyślny protokół wzmocnienia instrumentu. Zaprogramuj przyrząd zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym, aby przeprowadzić analizę dysocjacji natychmiast po qPCR. Po zakończeniu przebiegu przejrzyj i zweryfikuj wykres wzmocnienia.
W menu eksperymentu w oprogramowaniu systemu przyrządu wybierz opcję wykresu wzmocnienia. Jeśli nie są wyświetlane żadne dane, kliknij zielony przycisk analizy. Na karcie Wykres wzmocnienia z menu rozwijanego typu wykresu wybierz wykres, na którym wyświetlane są dane wzmocnienia jako odczyty fluorescencji, znormalizowane do fluorescencji z odniesienia pasywnego w funkcji numeru cyklu, W menu rozwijanym koloru wykresu wybierz próbkę.
Z menu rozwijanego typu wykresu wybierz typ wykresu wzmocnienia liniowego, sprawdź, czy cykl początkowy i końcowy linii bazowej jest ustawiony prawidłowo. Cykl końcowy należy ustawić na kilka cykli przed numerem cyklu, w którym wykryty zostanie znaczący sygnał fluorescencyjny. Z menu rozwijanego typu wykresu wybierz typ wykresu wzmocnienia log 10, aby wyświetlić linię progową na wykresie, wybierając opcję progu i dostosuj próg.
Linia progowa powinna przecinać fazę wykładniczą na krzywych qPCR. Sprawdzić, czy wszystkie studzienki do pobierania próbek i kontroli dodatniej mają normalne krzywe amplifikacji i czy w studzienkach NTC nie ma amplifikacji. Normalny wykres amplifikacji pokazuje wykładniczy wzrost kwitnienia, który przekracza próg między cyklami od 15 do 35.
W pochodnych krzywych topnienia przejrzyj obszary przed i po stopieniu lub linie temperatury. Obszary przed i po topnieniu powinny znajdować się na płaskim obszarze, na którym nie ma dużych szczytów ani nachyleń w poziomach fluorescencji. W razie potrzeby ustaw początek i koniec linii temperatury przed i po topnieniu, w odległości około 0,5 stopnia Celsjusza od siebie.
Uruchom ponownie analizę, jeśli parametry zostaną dostosowane, klikając przycisk analizy. W zakładce ustawień wykresu w zakładce doniczki różnicowej wybierz jedną z replik kontrolnych typu dzikiego jako referencyjne DNA i uruchom ponownie analizę, klikając przycisk analizy. W wyrównanej zakładce Krzywe topnienia potwierdź, że wszystkie kontrole dodatnie mają prawidłowy genotyp i że NTC nie udało się amplifikować.
Z tabeli studzienek wybierz studzienkę kontrolną, aby podświetlić odpowiednią krzywą topnienia na wykresach analizy i potwierdzić, że kolor linii odpowiada prawidłowemu genotypowi. Na karcie wyrównane krzywe topnienia dokładnie przejrzyj wykresy wyświetlane dla nieznanych próbek i porównaj je z wykresami wyświetlanymi dla kontroli. Wybrać studzienki zawierające nieznaną próbkę powtórzone i wyrównać krzywe topnienia z kontrolami w uporządkowanej kolejności, wybierając kolejno studzienki zawierające kontrole.
Przeanalizuj wynik dla nieznanej próbki na karcie Wykres różnicowy, aby sprawdzić, czy uzyskane wyniki są spójne. Wybrać studzienki zawierające nieznane powtórzenia próbki i wyrównać krzywe topnienia z kontrolami w uporządkowanej kolejności, wybierając kolejno studzienki zawierające kontrole. Uruchom produkty qPCR HRM na 4% prefabrykowanym żelu agarozowym zawierającym fluorescencyjny szczep kwasu nukleinowego.
Uruchom tylko jedną dodatnią ujemną NTC i próbkę qPCR HRM. Wyjmij żel prefabrykowany i kasetę z opakowania, a następnie wyjmij grzebień i włóż żel do urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć próbkę o objętości 10 mikrolitrów do 20 mikrolitrów sterylną wodą wolną od RNA i DNA i załadować każdą studzienkę 20 mikrolitrami rozcieńczonej próbki.
Rozcieńczyć trzy mikrolitry roztworu wzorcowego wielkości DNA do 20 mikrolitrów i załadować go do dołka markera. Napełnij puste studzienki 20 mikrolitrami sterylnego RNA i wolnej od DNA wody. Natychmiast wybierz program zgodnie z procentową zawartością uruchamianego żelu i ustaw czas pracy w aparacie na 20 minut.
Rozpocznij elektroforezę w ciągu jednej minuty od załadowania próbek. Po zakończeniu elektroforezy zwizualizuj DNA i żel za pomocą światła niebieskiego lub transoświetlenia UV. Pomyślna amplifikacja obszaru zainteresowania DNA z wykładniczym wzrostem fluorescencji, który przekracza próg między cyklami 15 i 35 oraz bardzo wąskimi wartościami cyklu kwantyfikacji we wszystkich powtórzeniach i kontrolach, jest warunkiem wstępnym wiarygodnej identyfikacji wariancji genetycznej za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości.
Analiza HRM jest wykonywana natychmiast po qPCR, aktywne obszary topnienia próbek, kontrole i NTC są wykorzystywane do tworzenia wyrównanych wykresów krzywej topnienia. Prawidłowo ustawione obszary przed i po stopieniu są ważne dla prawidłowej wizualizacji i identyfikacji zmienności genetycznej w próbkach. Wyrównane krzywe topnienia i różne garnki są pokazane tutaj.
Nieznane próbki są ściśle dopasowane do jednej z kontroli pozytywnych. Nieprawidłowo ustawione obszary przed i po topnieniu lub linie temperatury skutkują wyrównaniem krzywych topnienia i różnymi wykresami, na których prawidłowa identyfikacja wariancji genetycznej jest trudniejsza. Wariant genetyczny w próbce można zidentyfikować, porównując wzór prążków próbki z kontrolnymi.
I poprzez połączenie HRM i elektroforezy w żelu agarozowym. Prawidłową identyfikację wariantu genetycznego można przeprowadzić tylko w przypadku próbek, które zawierają ten sam wariant genetyczny, co jedna z kontroli użytych w teście HRM. Próbki zawierające rzadkie warianty genetyczne kalretykuliny różnią się wynikiem HRM i wzorem pasma elektroforezy.
Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest, aby dokładnie porównać wyrównane wykresy krzywej topnienia znanych i kontrolnych próbek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Analiza wysokorozdzielczego topnienia (HRM) jest szybką metodą wykrywania wariantów genetycznych, szczególnie skuteczną w identyfikacji mutacji kalretikuliny u pacjentów z chorobami hematologicznymi. Technika ta łączy HRM z elektroforezą w żelu agarozowym w celu rozróżnienia poszczególnych wariantów genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wykrywanie wariantów genetycznych
- Hematologia
- Techniki diagnostyczne
Wstęp
- Mutacje kalretikuliny mają istotne znaczenie w schorzeniach mieloproliferacyjnych.
- HRM stanowi nieinwazyjną opcję diagnostyczną.
- Inne metody diagnostyczne mogą być ograniczone w określonych przypadkach.
- Efektywność kosztowa jest istotną zaletą tej techniki.
Cel badania
- W celu dokładnego zdefiniowania mutacji kalretikuliny.
- W celu ułatwienia szybkiej diagnostyki nadpłytkowości samoistnej oraz pierwotnej mielofibrozy.
- W celu zbadania potencjalnego przyszłego wpływu na wybór terapii.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mieszaniny master mix do qPCR HRM.
- Przeprowadzenie analizy HRM dla próbek DNA.
- Wykorzystanie elektroforezy w żelu agarozowym do identyfikacji wariantów.
- Wykonanie wielokrotnych powtórzeń w celu zapewnienia dokładności.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja powszechnych somatycznych wariantów genetycznych.
- Metoda HRM wykazała akceptowalną granicę wykrywalności.
- Osiągnięto szybką i nieinwazyjną diagnozę.
- Nie odnotowano bezpośredniego wpływu na wybór terapii.
Wnioski
- HRM jest cennym narzędziem do wykrywania mutacji kalretikuliny.
- Metoda ta rokuje przyszłe zastosowania diagnostyczne.
- Dalsze badania mogą wpłynąć na strategie leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza wysokorozdzielczego topnienia (HRM) umożliwia szybkie i kosztowo efektywne wykrywanie somatycznych wariantów genetycznych w genie CALR, wspierając wczesną diagnostykę nowotworów mieloproliferatywnych w sytuacjach, gdy inne metody są ograniczone. Podejście to stanowi nieinwazyjne i dostępne narzędzie do walidacji celów w procesach odkrywania leków w onkologii hematologicznej, szczególnie w przypadku pacjentów z ujemnym wynikiem w kierunku JAK2 V617F, u których konieczny jest alternatywny screening biomarkerów. Poprzez połączenie HRM z elektroforezą w żelu agarozowym, metoda ta poprawia dyskryminację wariantów w regionach podatnych na indele, zwiększając pewność predykcyjną w przedklinicznej walidacji celów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie mutacji CALR u pacjentów z MPN u których nie stwierdzono mutacji JAK2 V617F, co pozwala na wyjaśnienie istotnych dla choroby czynników genetycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez szybkie genotypowanie wariantów somatycznych w regionie hotspot genu CALR z wykorzystaniem przystępnej cenowo i powszechnie dostępnej metody HRM opartej na qPCR.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez rozróżnienie alleli typu dzikiego od zmutowanych za pomocą analizy krzywej topnienia, co ogranicza liczbę wyników fałszywie dodatnich w początkowej fazie identyfikacji celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez potwierdzenie statusu wariantu genetycznego w próbkach pochodzących od pacjentów przed testowaniem związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu dzięki powtórzeniowym analizom HRM i potwierdzeniu za pomocą żelu agarozowego, co poprawia odtwarzalność w obrębie zestawów próbek.
- Wartość skalowalności: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy w procesach przesiewania genetycznego dzięki niskim kosztom, minimalnemu zużyciu materiału biologicznego oraz kompatybilności ze standardowymi urządzeniami do qPCR.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy wykrywanie wariantów w fazie odkrywania z ciągłością przedkliniczną poprzez identyfikację mutacji CALR istotnych dla modeli istotnej trombocytemii i pierwotnej mielofibrozy.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go), zapewniając stratyfikację genetyczną podtypów MPN, co umożliwia projektowanie badań przedklinicznych zgodnych z biomarkerami.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Redukuje niejednoznaczność w walidacji celu poprzez odróżnianie powszechnych wariantów somatycznych od wariantów rzadkich przy użyciu ortogonalnej metody HRM oraz potwierdzenia za pomocą elektroforezy żelowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza HRM wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – umożliwiając wczesną stratyfikację genetyczną próbek pacjentów przed przesiewaniem związków w programach onkologii hematologicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wykrywanie mutacji CALR, które definiują molekularne podtypy nowotworów mieloproliferacyjnych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki ilościowej analizie krzywych topnienia oraz potwierdzeniu wariantów w żelu, co zapewnia wiarygodną ocenę związków w kohortach zdefiniowanych genetycznie.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (zmiany temperatury topnienia, kształty krzywych), co pozwala na porównanie wariantów genetycznych w próbkach i kontrolach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość prekliniczną poprzez identyfikację mutacji CALR o znanej istotności fenotypowej w modelach MPN, wspierając walidację zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalna metoda genotypowania w projektach odkrywczych dzięki niskim kosztom, minimalnym wymaganiom szkoleniowym i kompatybilności z istniejącą infrastrukturą qPCR.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki dokładnej detekcji wariantów somatycznych CALR.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanym protokołom qPCR HRM oraz ortogonalnemu potwierdzeniu za pomocą elektroforezy w żelu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o stratyfikację genetyczną, co redukuje inwestycje w cele nieodpowiadające na terapię.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację podgrup z mutacją CALR o wyższym prawdopodobieństwie zaangażowania celu w modelach przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu qPCR, analizie krzywych topnienia oraz elektroforezie w żelu agarozowym w celu potwierdzenia wariantów.
- Zależne od instrumentów umożliwiających analizę wysokorozdzielczego topnienia (HRM) oraz specjalistycznego oprogramowania do dokładnego wyrównania krzywych i wykreślania różnic.
- Wymaga standaryzacji próbek kontrolnych (typ dziki, mutant, NTC) między zespołami, aby zapewnić spójne określanie wariantów w różnych ośrodkach.
- Wymaga adaptacji w przypadku zwiększenia długości produktu, ponieważ rozdzielczość heterodupleksów spada, co czyni elektroforezę żelową niezbędną do rozróżnienia indeli.
- Ograniczone koniecznością potwierdzenia sekwencjonowaniem metodą Sangera w przypadkach niejednoznacznych wyników HRM i elektroforezy, szczególnie w odniesieniu do rzadkich wariantów.
