Name: Wykrywanie wariantów genetycznych w genie CALR za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Naucz się wykrywać mutacje kalretykuliny w genie CALR za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szybką i nieinwazyjną diagnostykę zaburzeń mieloproliferacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim ekspertom akademickim i pracownikom Specjalistycznego Laboratorium Hematologicznego, Oddziału Hematologii, Oddziału Chorób Wewnętrznych, Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Lublanie.

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Lekarskiej Republiki Słowenii. Wszystkie procedury były zgodne z Deklaracją Helsińską.
1. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i post-qPCR oparta na fluorescencji za pomocą HRM
<ol>
	<li>Zawiesić startery wymienione w tabeli materiałów do 100 μM sterylnym, wolnym od RNaz i DNazH2O(patrz tabela materiałów). Wykonaj 10 μM podkład o stężeniu roboczym. Startery użyte w protokole zostały opublikowane przed2.</li>
	<li>Ilościowo oznaczyć DNA granulocytów metodą barwienia fluorescencyjnego zgodnie z instrukcją producenta11 (patrz Tabela Materiałów). Przygotować roztwór DNA o stężeniu 20 ng/μl przy użyciu 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Oprócz próbek DNA należy przygotować co najmniej trzy kontrole DNA: dwie kontrole pozytywne z wariantem genetycznym NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs*46) (delecja 52 pz lub mutacja typu 1) i NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (insercja 5 pz lub mutacja typu 2) wariant genetyczny, a także DNA typu dzikiego i kontrola negatywna jako kontrola bez matrycy (NTC). 
UWAGA: Przed wykonaniem konfiguracji HRM upewnij się, że przyrząd qPCR jest skalibrowany do eksperymentów HRM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj qPCR HRM Master Mix zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów) w następujący sposób: 10 μL 2x qPCR Master Mix z barwnikiem, 0,2 μL 10 μM Forward Primer, 0,2 μL 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL sterylnego, wolnego od RNaz i DNazH2O. Użyj podkładów z Tabeli Materiałów. Uruchom trzy powtórzenia dla każdej próbki DNA i kontroli.
	<ol>
		<li>Przygotować qPCR HRM Master Mix w zależności od liczby przetwarzanych próbek. W obliczeniach należy uwzględnić nadmierną objętość wynoszącą co najmniej 10%, aby zapewnić nadwyżkę objętości dla strat występujących podczas przenoszenia odczynników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj zawartość reakcji, delikatnie stukając i odwracając probówkę i wirując przez 2-3 s. Zbierz wszystkie rozproszone kropelki ze ścianki probówki na dno przez krótkie wirowanie.</li>
	<li>Przygotować płytkę reakcyjną odpowiednią do instrumentu i doświadczenia HRM (patrz Tabela Materiałów). Przenieść 19 μl qPCR HRM Master Mix do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki reakcji optycznej.</li>
	<li>Odpipetować 1 μl kontroli ujemnych, kontroli dodatnich i próbek do odpowiednich studzienek na optycznej płytce reakcyjnej. W przypadku NTC przenieść 1 μl sterylnego, wolnego od RNaz i DNazH2Oużytego do przygotowania qPCR HRM Master Mix zamiast DNA.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę reakcyjną optyczną folią samoprzylepną. Zrób to mocno, aby zapobiec parowaniu podczas biegu. Sprawdź, czy optyczna folia samoprzylepna jest płaska w poprzek wszystkich dołków na płytce reakcyjnej, aby zapewnić prawidłowe wykrywanie fluorescencji.</li>
	<li>Obracać płytkę reakcyjną o gramaturze 780 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 minutę. Sprawdź, czy ciecz znajduje się na dnie studzienek na płycie reakcyjnej. Kontynuuj uruchamianie testu. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny. Pozwól, aby płytka przechowywana w temperaturze 4 °C rozgrzała się do temperatury pokojowej, a następnie krótko obróć płytkę przed jej uruchomieniem.</li>
	<li>Zgodnie z instrukcją producenta przygotuj i rozpocznij serię w celu amplifikacji i stopienia DNA oraz wygenerowania danych fluorescencyjnych HRM w aparacie qPCR. W oprogramowaniu systemu przyrządów przypisać elementy sterujące i próbki do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>W celu wykrycia wariantu genetycznego CALR należy zmienić domyślny protokół amplifikacji instrumentu i amplifikować DNA przy użyciu następującego protokołu cykli termicznych: 95 °C przez 10 minut, a następnie 50 cykli po 95 °C przez 10 s i 62,5 °C przez 60 s.</li>
	<li>Przeprowadzić etap krzywej topnienia/dysocjacji (HRM) bezpośrednio po qPCR zgodnie z instrukcjami producenta12 w następujący sposób: 95 °C przez 10 s, 60 °C przez 1 min, a następnie szybkość narastania 0,025 °C/s aż do 95 °C. Utrzymuj temperaturę na poziomie 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 15 s.</li>
	<li>Przebieg kończy się automatycznie. Najpierw przejrzyj i zweryfikuj wykres wzmocnienia (Rysunek 2).</li>
	<li>W menu eksperymentu w oprogramowaniu systemu instrumentu wybierz opcję wykresu wzmocnienia. Jeśli nie są wyświetlane żadne dane, kliknij zielony przycisk Analizuj.
	<ol>
		<li>Na karcie wykresu wzmocnienia, z menu rozwijanego typu wykresu, wybierz wykres, na którym wyświetlane są dane wzmocnienia w postaci surowych odczytów fluorescencji znormalizowanych do fluorescencji z pasywnego odniesienia (ΔRn) w funkcji numeru cyklu (ΔRn vs cykl). Z menu rozwijanego koloru wydruku wybierz opcję Próbka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z menu rozwijanego typu wykresu wybierz typ wykresu wzmocnienia liniowego. Pokaż początek i koniec cyklu linii bazowej na wykresie wzmocnienia liniowego, wybierając opcję początku linii bazowej. Sprawdź, czy linia bazowa jest ustawiona poprawnie. Cykl końcowy należy ustawić na kilka cykli przed numerem cyklu, w którym wykryty zostanie znaczny sygnał fluorescencyjny. Linia bazowa jest zwykle ustawiana na okres od 3 do 15 cykli (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Z menu rozwijanego typu wykresu wybierz typ wykresu wzmocnienia log10. Pokaż linię progową na wykresie, wybierając opcję próg. Dostosuj odpowiednio próg, jeśli nie jest ustawiony prawidłowo. Prawidłowo ustawiony próg oznacza, że linia progowa przecina fazę wykładniczą krzywych qPCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Sprawdzić, czy we wszystkich studzienkach do pobierania próbek i kontroli dodatniej występują normalne krzywe amplifikacji. Sprawdź, czy nie ma amplifikacja w studzienkach NTC przed cyklem 40. Normalny wykres wzmocnienia pokazuje wykładniczy wzrost fluorescencji, który przekracza próg między cyklami 15 i 35 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Wyłączyć studzienki na próbki z analizy, jeśli nie ma amplifikacji w miejscu studzienki. 
	UWAGA: Jeśli wykres amplifikacji wygląda nieprawidłowo lub studzienka NTC wskazuje amplifikacja, zidentyfikuj i rozwiąż problem zgodnie z przewodnikiem rozwiązywania problemów producenta.</li>
	<li>Wyklucz wartość odstającą z wartością cyklu kwantyfikacji (Cq), która różni się od powtórzeń o więcej niż 2 w oprogramowaniu systemu przyrządu12. Wartości odstające mogą dawać błędne wyniki HRM.</li>
	<li>Na pochodnych krzywych topnienia przejrzyj obszary/linie temperatury przed i po topnieniu. Obszary przed i po topnieniu powinny znajdować się w płaskim obszarze, na którym nie ma dużych szczytów ani nachyleń w poziomach fluorescencyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). W razie potrzeby odpowiednio go dostosuj. Ustaw początek i koniec linii temperatury przed i po topnieniu w odległości około 0,5 °C od siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Uruchom ponownie analizę, jeśli parametry zostaną dostosowane, klikając przycisk Analizuj.</li>
	<li>Na karcie wykres różnicowy, w zakładce ustawień wykresu, wybierz jedną z replik kontrolnych typu dzikiego (homozygota) jako referencyjne DNA i uruchom ponownie analizę, klikając przycisk Analizuj.</li>
	<li>W zakładce wyrównane krzywe topnienia upewnij się, że wszystkie kontrole dodatnie mają prawidłowy genotyp, a NTC nie udało się amplifikować (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4). Z tabeli studzienek należy wybrać studzienki zawierające kontrolę dodatnią, aby wyróżnić odpowiednią krzywą topnienia na wykresach analizy. Upewnij się, że kolor linii odpowiada prawidłowemu genotypowi. Powtórzyć kroki dla studzienek zawierających inne kontrole dodatnie i NTC.</li>
	<li>Na karcie wyrównanych krzywych topnienia dokładnie przejrzyj wykresy wyświetlane dla nieznanych próbek i porównaj je z wykresami wyświetlanymi dla kontrolek (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4). Z tabeli studzienek wybrać studzienki zawierające nieznane kontrpróby próbek, sprawdzić kolor krzywej topnienia i wyrównać je z kontrolami w uporządkowanej kolejności, wybierając kolejno studzienki zawierające kontrole dodatnie. Powtórz ten proces dla wszystkich nieznanych próbek. 
	UWAGA: Nieznana próbka zawiera wariant jednej z kontroli, jeśli jej krzywa topnienia jest ściśle do niej dopasowana. Mogą być wyświetlane różne grupy wariantów (różne kolory) wskazujące, że nieznana próbka składa się z nieznanego wariantu, nieodpowiadającego kontrolom (<silna klasa = "xfig">Rysunek 8). W próbce pacjenta może występować niski poziom somatycznego wariantu genetycznego. Może to mieć wpływ na interpretację wyniku HRM, szczególnie na granicy wykrywalności testu (<silna klasa="xfig">Rysunek 9). W takich przypadkach kolor, a nawet kształt linii może bardzo przypominać genotyp typu dzikiego.
	<ol>
		<li>Gdy wynik jest niejednoznaczny, połącz wyniki HRM z wynikami elektroforezy w żelu agarozowym i metodami sekwencjonowania. Ponownie przetestuj próbkę lub poproś i w razie potrzeby ponownie przetestuj nową próbkę.</li>
		<li>Dokładnie przejrzyj zestaw danych dla krzywych replikacji i sprawdź, czy wyrównanie każdej kontrpróby w grupie jest ścisłe. Należy wykluczyć kontrpróbę, jeśli nie jest ona ściśle wyrównana z innymi próbkami w grupie (wartość odstająca). Ponownie przetestuj próbkę, jeśli występuje więcej wartości odstających, a wyniki są niejednoznaczne. Należy pamiętać, że ilość i jakość próbki DNA mają wpływ na wyniki HRM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj wynik dla nieznanej próbki na karcie Wykres różnicowy. Powtórz procedurę opisaną w kroku 1.21 i sprawdź, czy wyniki uzyskane dla nieznanej próbki są takie same.</li>
	<li>Następnie uruchom produkty qPCR HRM na żelu agarozowym. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas, ale nie dłużej niż 7 dni. Pozwól, aby płytka przechowywana w temperaturze 4 °C rozgrzała się do temperatury pokojowej, a następnie krótko obróć płytkę przed jej uruchomieniem. Pozostawić płytkę przechowywaną w temperaturze -20 °C do rozmrożenia i ogrzania do temperatury pokojowej, a następnie krótko obrócić płytkę przed jej uruchomieniem.</li>
</ol>
2. Elektroforeza w żelu agarozowym
<ol>
	<li>Uruchom produkty qPCR HRM na 4% prefabrykowanym żelu agarozowym zawierającym fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym, używając odpowiedniego systemu elektroforezy żelowej (patrz Tabela materiałów, <klasa silna = "xfig">Rysunek 5). Uruchom tylko jedną replikację HRM z dodatnim, ujemnym wynikiem NTC i próbką qPCR. 
	UWAGA: Podczas pracy z żelami należy zawsze nosić rękawice. Każdy inny system elektroforezy żelowej może spełnić ten cel, jeśli wybrano równoważny procent agarozy, fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym i format studni.</li>
	<li>Uruchomić system elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Wyjmij wstępnie obsadzony żel z kasety z opakowania, wyjmij grzebień i włóż go do urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Załaduj żel w ciągu 15 minut od otwarcia opakowania.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę o objętości 10 μl do 20 μl sterylnym, wolnym od RNaz i DNazH2O. Załadować każdą studzienkę 20 μl rozcieńczonej próbki.</li>
	<li>Rozcieńczyć 3 μl roztworu wzorcowego wielkości DNA do 20 μl sterylnym, wolnym od RNaz i DNazH2O(patrz tabela materiałów). Załaduj do M dobrze 20 μl rozcieńczonego roztworu wzorcowego wielkości DNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6).</li>
	<li>Napełnij puste studzienki 20 μl sterylnego, wolnego od RNaz i DNazH2O.</li>
	<li>Natychmiast wybierz program zgodnie z procentową zawartością uruchamianego żelu i ustaw czas pracy w aparacie na 10 minut.</li>
	<li>Rozpocznij elektroforezę w ciągu 1 minuty od załadowania próbki, naciskając przycisk GO. Czas elektroforezy może się wydłużyć w przypadku uzyskania niewystarczającej rozdzielczości. 
	UWAGA: Nie należy przekraczać maksymalnego zalecanego czasu trwania elektroforezy agarozowej zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po zakończeniu elektroforezy zwizualizuj DNA w żelu za pomocą niebieskiego światła lub transoświetlenia UV. Wizualizacja, analiza i przechowywanie obrazów elektroforezy są najczęściej wykonywane przez urządzenie do obrazowania żelowego z systemem dokumentacji fotograficznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Przeanalizuj i zinterpretuj zwizualizowany wzór żelu produktów qPCR HRM, porównując wyniki nieznanej próbki z kontrolami pozytywnymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 8).</li>
	<li>Jeśli wyniki nieznanej próbki HRM i elektroforezy żelowej wskazują, że obecny jest nieznany wariant genetyczny, zsekwencjonuj produkt qPCR HRM przy użyciu starterów opisanych w Tabeli Materiałów zgodnie z opisanym protokołem13. 
	UWAGA: Żele agarozowe zawierające fluorescencyjne barwniki kwasu nukleinowego muszą być odpowiednio zutylizowane zgodnie z przepisami instytucji.</li>
</ol>

<ol><li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).</li>
<li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).</li>
<li>Vainchenker, W., Kralovics, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+and+molecular+pathophysiology+of+classical+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. 129, 667-679 (2017).</li>
<li>Pietra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+clinical+effects+of+different+mutation+subtypes+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 30, 431-438 (2016).</li>
<li>Lim, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+CALR+exon+9+mutations+using+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis.</a> Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).</li>
<li>Lay, M. J., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+fluorescence+genotyping+of+factor+V+leiden+during+rapid-cycle+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR.</a> Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29+-+More+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening.</a> Human Mutation. 30, 860-866 (2009).</li>
<li>Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+for+revision+and+proposed+changes+of+the+WHO+diagnostic+criteria+for+polycythemia+vera%2C+essential+thrombocythemia+and+primary+myelofibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis.</a> Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).</li>
<li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).</li>
<li>Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CALR+mutations+in+a+cohort+of+JAK2+V617F+negative+patients+with+suspected+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms.</a> Scientific Reports. 9, 19838(2019).</li>
<li>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QubitTM+dsDNA+HS+Assay+Kits.+Manual+%28MAN0002326%2C+MP32851%2C+Revision%3A+B.0%29%22">QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0)</a>. , (last accessed 16 August 2020) (2015).</li>
<li>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22High+Resolution+Melt+Module+for+ViiA+TM+7+Software+v1.+Getting+Started+Guide.+Part+Number+4443531+Rev.+B%22">High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B</a>. , (last accessed 16 August 2020) (2011).</li>
<li>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22High-Resolution+Melt+Analysis+for+Mutation+Scanning+Prior+to+Sequencing.+Application+Note%22">High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note</a>. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).</li>
<li>Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+melting+analysis+for+simple+and+efficient+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics.</a> Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).</li>
<li>Gonzalez-Bosquet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+somatic+mutations+by+high-resolution+DNA+melting+%28HRM%29+analysis+in+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers.</a> PLoS One. 6, 14522(2011).</li>
<li>Van Der Stoep, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+guidelines+for+high-resolution+melting+curve+%28HRM%29+analysis%3A+An+interlaboratory+validation+of+BRCA1+mutation+scanning+using+the+96-well+LightScanner%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner.</a> Human Mutation. 30, 899-909 (2009).</li>
<li>Singdong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+Prognosis+Significance+of+JAK2+%28V617F%29%2C+MPL%2C+and+CALR+Mutations+in+Philadelphia-Negative+Myeloproliferative+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).</li>
<li>Erali, M., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+gene+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for gene scanning.</a> Methods. 50, 250-261 (2010).</li>
<li>Bilbao-Sieyro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Melting+Analysis%3A+A+Rapid+and+Accurate+Method+to+Detect+CALR+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations.</a> PLoS One. 9, 103511(2014).</li>
<li>Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+%28HRM%29+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+common+DNA+concentration+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of three common DNA concentration measurement methods.</a> Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).</li>
<li>Voytas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis.</a> Current Protocols in Immunology. 2, (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3923(2012).</li>
<li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Endonuclease+R%C2%B7EcoRI+Fragments+of+DNA+from+Lambdoid+Bacteriophages+and+Other+Viruses+by+Agarose-Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis.</a> Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Topienie DNA w wysokiej rozdzielczości jest prostym rozwiązaniem do genotypowania i skanowania wariantów genetycznych14. Zależy to od różnic w sekwencji, które skutkują heterodupleksami, które zmieniają kształt krzywej topnienia. W genie specyficznym dla pewnej grupy pacjentów z rakiem 1,2,15,16,10 można zaobserwować różne typy wariantów genetycznych o różnej częstości występowania.<sup class="...

Somatyczne warianty genetyczne w genie kalretykuliny (CALR) zostały rozpoznane w 2013 roku u pacjentów z nowotworami mieloproliferacyjnymi (MPN), takimi jak nadpłytkowość samoistna i pierwotne zwłóknienie szpiku1,2. Od tego czasu odkryto ponad 50 wariantów genetycznych w genie CALR, wywołując przesunięcie ramki ramki +1 (−1+2) class<="xref">3. Dwa najczęstsze warianty genetyczne CALR to delecja 52 pz (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs*46)), zwana również mutacją typu 1, oraz insercja 5 pz (NM_004343,3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), zwana również mutacją typu 2. Te dwa warianty genetyczne stanowią 80% wszystkich wariantów genetycznych CATR. Pozostałe zostały sklasyfikowane jako podobne do typu 1 lub typu 2 przy użyciu algorytmów opartych na zachowaniu α helisy zbliżonej do dzikiego typu CALR4. W tym miejscu przedstawiamy jedną z bardzo czułych i szybkich metod wykrywania wariantów genetycznych CALR, metodę analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM). Metoda ta umożliwia szybkie wykrycie wariantów genetycznych typu 1 i typu 2, które reprezentują większość mutacji CALR5. HRM został wprowadzony w połączeniu z »reakcją łańcuchową polimerazy« w czasie rzeczywistym (qPCR) w 1997 roku jako narzędzie do wykrywania mutacji w czynniku V Leiden6. W porównaniu do sekwencjonowania Sangera, które reprezentuje złoty standard, HRM jest metodą bardziej czułą i mniej specyficzną5. Metoda HRM jest dobrą metodą przesiewową, która umożliwia szybką analizę dużej liczby próbek z dużym stosunkiem kosztów do korzyści5. Jest to prosta metoda PCR wykonywana w obecności barwnika fluorescencyjnego i nie wymaga szczególnych umiejętności. Kolejną korzyścią jest to, że sama procedura nie uszkadza ani nie niszczy analizowanej próbki, co pozwala nam na ponowne wykorzystanie próbki do elektroforezy lub sekwencjonowania Sangera po procedurze HRM7. Jedyną wadą jest to, że czasami trudno jest zinterpretować wyniki. Ponadto HRM nie wykrywa dokładnej mutacji u pacjentów z mutacjami typu innego niż 1 lub typu 28. U tych pacjentów należy wykonać sekwencjonowanie Sangera (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).
HRM opiera się na amplifikacji określonego regionu DNA w obecności nasyconego DNA barwnika fluorescencyjnego, który jest włączony do dwuniciowego DNA (dsDNA). Barwnik fluorescencyjny emituje światło po włączeniu do dsDNA. Po postępującym wzroście temperatury dsDNA rozpada się na jednoniciowy DNA, który można wykryć na krzywej topnienia jako nagły spadek intensywności fluorescencji. Kształt krzywej topnienia zależy od sekwencji DNA, która jest używana do wykrywania mutacji. Krzywe topnienia próbek porównuje się z krzywymi topnienia znanych mutacji lub CALR typu dzikiego. Wyraźne krzywe topnienia reprezentują inną mutację, która nie jest typem 1 lub typem 29.
Algorytm wykrywania somatycznych wariantów genetycznych w genie CALR za pomocą HRM, elektroforezy w żelu agarozowym i metody sekwencjonowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) został użyty i zweryfikowany w retrospektywnym badaniu opublikowanym wcześniej10.

<table><tbody><tr><td>E-Gel EX 4% Agaroza</td><td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td><td>G401004</td><td></td></tr><tr><td>Fuorometer 3.0 QUBIT</td><td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen E-Gel iBase i E-Gel Safe Imager Combo Kit</td><td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor HRM MasterMix 2X</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific</td><td>4415440</td><td>Komponenty: Polimeraza DNA AmpliTaqGold 360, barwnik HRM MeltDoctor trade, mieszanka dNTP, w tym dUTP, sole magnezu i inne składniki buforowe, precyzyjnie opracowane w celu uzyskania optymalnych wyników HRM</td></tr><tr><td>Płytka reakcyjna MicroAmp Fast 96-well (0,1 ml)</td><td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczny klej foliowy</td><td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Systemy</td><td>dokumentacji żelu</td>NuGenius <td>Syngene</td><td>NG-1045</td></tr><tr><td>Podkład CALRex9 Naprzód</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Sekwencja: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (o wysokiej czystości, bez soli)</td></tr> <tr><td>Podkład CALRex9 Odwrotna</td> sekwencja <td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (wysoka czystość, bez soli)</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>Zestaw do izolacji DNA z buforem do rozcieńczania DNA.</td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>QUBIT dsDNA HS</td><td>test Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Trackit 100bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td><td>10488058</td><td>Ladder składa się z 13 pojedynczych fragmentów z pasmami odniesienia przy 2000, 1500 i 600 pz.</td></tr><tr><td>ViiA7 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td><td>4453534</td><td></td></tr><tr><td>Water bez nukleaz</td><td>VWR, Life Science</td><td>436912C</td><td>, RNazy, DNazy i proteazy</td></tr></tbody></table>

wykrywanie wariantów genetycznych w genie calr za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) to skuteczna metoda do genotypowania i skanowania zmienności genetycznej. Większość zastosowań HRM opiera się na nasycaniu barwników DNA, które wykrywają różnice w sekwencji, oraz heterodupleksów, które zmieniają kształt krzywej topnienia. Doskonała rozdzielczość przyrządów i specjalne oprogramowanie do analizy danych są potrzebne do identyfikacji małych różnic w krzywej topnienia, które identyfikują wariant lub genotyp. Różne typy wariantów genetycznych o różnej częstości występowania można zaobserwować w genie specyficznym dla pacjentów z określoną chorobą, zwłaszcza nowotworem, oraz w genie CALR u pacjentów z nowotworami mieloproliferacyjnymi z ujemnym chromosomem Philadelphia. Zmiany pojedynczych nukleotydów, insercje i/lub delecje (indele) w genie będącym przedmiotem zainteresowania można wykryć za pomocą analizy HRM. Identyfikacja różnych typów wariantów genetycznych opiera się głównie na kontrolach stosowanych w teście qPCR HRM. Jednak wraz ze wzrostem długości produktu różnica między krzywymi typu dzikiego i heterozygoty staje się mniejsza, a typ wariantu genetycznego jest trudniejszy do określenia. W związku z tym, gdy indele są dominującym wariantem genetycznym oczekiwanym w genie będącym przedmiotem zainteresowania, w celu wyjaśnienia wyniku HRM można zastosować dodatkową metodę, taką jak elektroforeza w żelu agarozowym. W niektórych przypadkach niejednoznaczny wynik musi zostać ponownie sprawdzony/ponownie zdiagnozowany za pomocą standardowego sekwencjonowania Sangera. W tym retrospektywnym badaniu zastosowaliśmy metodę u pacjentów z ujemnym JAK2 V617F-ujemnym i MPN.

Warunkiem niezbędnym do niezawodnej identyfikacji wariantów genetycznych za pomocą analizy HRM jest pomyślna amplifikacja badanego regionu DNA z wykładniczym wzrostem fluorescencji przekraczającym próg między 15. a 35. cyklem oraz bardzo wąskim zakresem wartości cyklu kwantyfikacji (Cq) we wszystkich powtórzeniach próbek i kontrolach (Rysunek 2). Osiąga się to poprzez precyzyjne oznaczenie ilości DNA z użyciem barwnika fluorescencyjnego oraz zastosowanie równej ilości DNA w eksperymencie qPC...

Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) jest czułym i szybkim rozwiązaniem do wykrywania wariantów genetycznych. Zależy to od różnic w sekwencji, które powodują, że heterodupleksy zmieniają kształt krzywej topnienia. Łącząc HRM i elektroforezę w żelu agarozowym, można zidentyfikować różne rodzaje wariantów genetycznych, takich jak indele.

Wykrywanie wariantów genetycznych w genie CALR za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości

High resolution melting analysis (HRM) is a powerful method for genotyping and genetic variation scanning. Most HRM applications depend on saturating DNA ...

Tadej Pajič 1,2, Tanja Belčič Mikič1, Helena Podgornik1,3, Jurka Klun1, Sandra Šućurović1,&#160;

genetic-variant-detection-calr-gene-using-high-resolution-melting

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Powiązania genetyczne często pozostają niewyjaśnione na poziomie funkcjonalnym. Niniejsza metoda ma na celu ocenę wpływu markerów genetycznych powiązanych z fenotypem na ekspresję genów poprzez analizę komórek heterozygotycznych w obrębie transkrybowanych SNP. Technologia ta umożliwia precyzyjny pomiar za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w celu ilościowego oznaczenia produktów specyficznego dla alleli przedłużania starterów.

Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Podczas gdy analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości oferuje możliwość różnicowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w heterogenicznej populacji, stronniczość amplifikacji zmutowanego allelu może zwiększyć jego zdolność do wykrywania alleli obecnych w stosunkowo niskich procentach w próbce. W tym protokole opisano ulepszenia, które poprawiają czułość analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Tutaj opisujemy innowacyjną metodę określania polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 (CR1) do wykorzystania w wielu zastosowaniach, szczególnie w ocenie podatności na choroby takie jak choroba Alzheimera (AD). Metoda ta może być przydatna do lepszego zrozumienia roli izoform CR1 w patogenezie choroby Alzheimera.

Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

Naucz się wykrywać mutacje kalretykuliny w genie CALR za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szybką i nieinwazyjną diagnostykę zaburzeń mieloproliferacyjnych.

Wykrywanie wariantów genetycznych w genie CALR za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów