Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki
15 września 2020
Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.
Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia wykorzystanie istniejących bezkomórkowych systemów translacyjnych do analizy pojedynczych cząsteczek aktywnej translacji eukariotycznej. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zachowuje ona właściwości translacji masowej, zapewnia rozdzielczość pojedynczej cząsteczki i jest stosunkowo łatwa do zaadaptowania z innych testów translacji masowej. Metodę tę można zastosować do dowolnego systemu translacji bezkomórkowej, który został zweryfikowany pod kątem umożliwienia wydajnej translacji zależnej od limitu w warunkach masowych.
Procedurę zademonstrują Hongyun Wang, pracownik naukowy, i Anthony Gaba, starszy naukowiec z laboratorium Xiaohui Qu. Co najmniej trzy godziny przed wykonaniem eksperymentu z pojedynczą cząsteczką włącz inkubator mikroskopowy i zmniejsz przepływ powietrza do niskiej prędkości, aby uniknąć nadmiernych zakłóceń akustycznych eksperymentu. Następnie ustaw temperaturę inkubatora na optymalną temperaturę specyficzną dla bezkomórkowego systemu translacji.
Co najmniej godzinę przed eksperymentem naciśnij przycisk zasilania lasera za skrzynką laserową, przekręć bezpieczeństwa lasera i naciśnij przycisk start, aby włączyć laser. Włącz mikroskop i wybierz tryb obrazowania, obiektyw i zestaw filtrów. Włącz kamerę EMCCD, kontroler sceny, pompę strzykawkową i komputer, a następnie otwórz oprogramowanie kamery, lasera, zmotoryzowanego stolika i pompy strzykawkowej.
W oprogramowaniu do sterowania laserem kliknij przycisk Połącz, aby ustawić intensywność lasera, odznacz pole migawki i kliknij przycisk sterowania, aby przeciągnąć suwak intensywności w wyskakującym oknie sterowania laserem. Wprowadź głębokość penetracji, aby ustawić laser pod żądanym kątem i upewnij się, że skrzynka migawki jest zamknięta, aby utrzymać laser w trybie wyłączenia, gdy nie obrazuje. Gdy aparat ostygnie i ustabilizuje się do wyznaczonej temperatury pracy, w oprogramowaniu aparatu wybierz kinetyczny jako tryb akwizycji i wprowadź czas ekspozycji, długość serii kinetycznej i parametry wartości wzmocnienia mnożenia elektronów.
Wybierz katalog i przypisz nazwy plików do zapisania pliku obrazu danych. Ustaw pompę strzykawkową na skromne lub szybkie natężenie przepływu i dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu do rurki do mikrofuge. Włóż końcówkę rurki pompy strzykawkowej do roztworu etanolu i użyj oprogramowania pompy strzykawkowej, aby przełączyć pompę strzykawkową między trybami pobierania i dozowania, aby umyć rurkę trzy razy etanolem i trzy razy wodą wolną od RNaz.
Po ostatnim umyciu wodą przetrzyj końcówkę rurki czystą chusteczką higieniczną, aby usunąć resztki wody z wnętrza rurki i umieść koniec rurki w czystej rurce do mikrofugi. W przypadku immobilizacji biotynylowanego mRNA na trzech końcach należy umieścić komorę przepływową w uchwycie próbki mikroskopu stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w dół i zabezpieczyć komorę taśmą. Użyj taśmy, aby zakryć wloty i wyloty kanałów przepływowych, które nie są używane, i dodaj 1,5-krotność objętości 200 mikrogramów na mililitr roztworu streptawidyny do kanału przepływowego.
Po 10 minutach w temperaturze pokojowej umyj i przetrzyj kanał trzykrotnie trzykrotnie większą objętością bufora płuczącego T50 na pranie i złożoną chusteczką laboratoryjną. Po ostatnim myciu umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie mikroskopu i umieść uchwyt i komorę na stoliku mikroskopu. Następnie zbliż obiektyw do szkiełka nakrywkowego, aż olejek immersyjny na obiektywie zetknie się z szkiełkiem nakrywkowym i przesuń stolik próbki tak, aby kanał przepływu znajdował się bezpośrednio nad soczewką obiektywu.
Na ekranie dotykowym sterowania mikroskopem wybierz kartę ostrości, a następnie kliknij przycisk Wyszukiwanie ostrości i uruchom. Po pomyślnym osiągnięciu płaszczyzny ostrości rozlegnie się sygnał dźwiękowy. W oprogramowaniu aparatu wybierz tryb na żywo.
W oprogramowaniu do sterowania laserem otwórz migawkę lasera i wyreguluj poziom intensywności lasera. Obserwuj obraz fluorescencji w czasie rzeczywistym w trybie na żywo i na ekranie dotykowym sterowania mikroskopem za pomocą precyzyjnego sterowania krokowego do regulacji pozycji obiektywu. W oprogramowaniu kamery przesuń stolik, aby ocenić poziom tła fluorescencyjnego w różnych obszarach powierzchni detekcji kanału przepływowego.
Jeśli fluorescencja jest niska, zatrzymaj tryb na żywo i zamknij migawkę lasera w oprogramowaniu sterującym laserem i zastąp bufor płuczący z kanału przepływowego dwukrotnie większą objętością biotynylowanego roztworu mRNA. Po 15 minutach umyj kanał trzykrotnie trzykrotnie większą objętością bufora kompatybilnego z translacją na pranie. W celu wykrycia pojedynczej cząsteczki zbierz trzykrotność objętości świeżo rozmrożonej mieszanki translacyjnej bez mRNA i uzupełnionej zoptymalizowanym stężeniem fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w probówce mikrowirówkowej na lodzie i krótko zakręć probówką, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki.
Przenieś mieszaninę translacyjną do wnętrza nasadki rurki do mikrofug o pojemności 700 mikrolitrów i ustaw pompę strzykawkową w tryb pobierania. Włożyć końcówkę rurki pompy do mieszanki translacyjnej i rozpocząć pobieranie strzykawki. Gdy mieszanina translacyjna całkowicie dostanie się do rurki pompy, przerwij pobieranie, przekręć ustawienia pompy strzykawkowej w tryb dozowania i ustaw przepływ na optymalną szybkość dostarczania mieszanki translacyjnej.
Uruchomić i zatrzymać strzykawkę, aby mieszanina translacyjna dotarła do końca rurki, jeśli to konieczne, a następnie włożyć końcówkę rurki pompy do wlotu kanału przepływowego, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Przykręć wykonany na zamówienie metalowy wspornik do płytki uchwytu próbki mikroskopu, aby ustabilizować połączenie i ocenić ostrość mikroskopu i fluorescencję obszaru obrazowania. Upewnij się, że parametry pozyskiwania filmu są poprawne oraz że została wprowadzona odpowiednia nazwa pliku i katalog do zapisania plików.
Przesuń stolik, aby umożliwić obrazowanie obszaru w środku powierzchni wykrywania kanału przepływowego. A na karcie ciągły AF kliknij przyciski Start. Po pomyślnym osiągnięciu płaszczyzny ostrości rozlegnie się sygnał dźwiękowy.
Po zmniejszeniu światła otoczenia otwórz migawkę lasera i kliknij przycisk odbierania sygnału, aby rozpocząć nagrywanie. Po pięciu sekundach wprowadź polecenie run, aby dostarczyć mieszankę tłumaczeń do kanału przepływu. Następnie nagrywaj dane przez maksymalnie dwie godziny w rozdzielczości od 0,5 do dwóch sekund na klatkę.
Aby przeanalizować zdarzenia wiązania Cy3 ANTI-FLAG, intensywność fluorescencji wybranych plamek flagi Cy3 alfa została obliczona klatka po klatce dla całego filmu i połączona w celu utworzenia trajektorii intensywności. Surowe trajektorie mogą wydawać się zaszumione i mogą wymagać udoskonalenia za pomocą nieliniowego filtra do przodu/do tyłu w celu zmniejszenia szumów tła. Dalsze udoskonalenie można osiągnąć za pomocą algorytmów wykrywania kroków do digitalizacji trajektorii.
Wiązanie przeciwciała z powstającym polipeptydem powoduje natychmiastowy wzrost fluorescencji, podczas gdy dysocjacja polipeptydu przeciwciała powoduje natychmiastowy spadek fluorescencji. Histogram czasu przebywania dla mRNA oznaczającego lucyferazy pasuje do logarytmicznego rozkładu normalnego i daje szybkość syntezy peptydów 2,5 plus minus 0,1 aminokwasów na sekundę. Histogram czasu pierwszego przybycia pasuje do przesuniętej funkcji logarytmicznej normalnej, co ilustruje wysoki stopień niejednorodności w aktywności translacyjnej pojedynczego mRNA.
Jak wskazuje histogram, pierwsze zdarzenie syntezy peptydów na pojedynczych cząsteczkach mRNA flagi lucyferazy może rozpocząć się już po dwóch minutach i dopiero po 20 minutach od dostarczenia mieszanki translacyjnej. W porównaniu z translacją z mRNA flagi lucyferazy, histogram czasu pierwszego nadejścia z translacją mRNA flagi lucyferazy spinki do włosów wykazał wolniejsze wiązanie przeciwciał. Stosowanie masowych pomiarów luminescencji z bezkomórkowych reakcji translacji z tymi samymi mRNA nie rozwiązuje jednak różnic w kinetyce translacji.
Rozdzielczość pojedynczej cząsteczki w tym teście zapewnia bardziej kinetyczne wglądy w translację zależną od czapeczki, które nie są łatwe do osiągnięcia przy użyciu innych podejść. Translacja bez komórek eukariotycznych jest wrażliwa na niewielkie zmiany i warunki eksperymentalne. Dlatego dbałość o szczegóły i spójność mają kluczowe znaczenie podczas korzystania z tego testu w celu dokładnego wykrycia niewielkich różnic w translacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół umożliwia analizę aktywnego eukariontycznego translacji na poziomie pojedynczej cząsteczki, wykorzystując systemy translacji bezkomórkowe. Zachowuje on właściwości translacji zbiorowej, jednocześnie dostarczając wysoce szczegółowych informacji na temat mechanizmów translacji zależnych od czepka.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Biochemia
- Biologia Komórkowa
Tło
- Badania jednocząsteczkowe pozwalają na szczegółowe badania kinetyczne.
- Translacja zależna od czepka jest kluczowym procesem w syntezie białek.
- Istniejące metody często nie posiadają rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.
- Tę technikę można zaadaptować z badań translacji zbiorowej.
Cel Badania
- Opracowanie metody analizy translacji na poziomie pojedynczej cząsteczki.
- Charakteryzacja kinetyki inicjacji i wydłużania podczas translacji.
- Wykorzystanie systemów bezkomórkowych do badania translacji eukariontycznej.
Wykorzystane Metody
- In vitro badanie jednocząsteczkowe z użyciem przeciwciał oznaczonych barwnikiem fluorescencyjnym.
- Obrazowanie interakcji między przeciwciałami a powstającymi peptydami.
- Wykorzystanie systemów bezkomórkowych.
- Konfiguracja komory hodowlanej z mikroskopem, aby zminimalizować zakłócenia.
Główne Wyniki
- Pomyślna charakteryzacja inicjacji i wydłużania translacji.
- Zachowanie właściwości translacji zbiorowej podczas analizy jednocząsteczkowej.
- Uzasadnienie zastosowania metody do różnych systemów bezkomórkowych.
- Wysoce szczegółowe informacje na temat mechanizmów translacji zależnych od czepka.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia potężne narzędzie do badania dynamiki translacji.
- Poszerza naszą wiedzę na temat mechanizmów syntezy białek.
- Podejście to jest elastyczne i może być stosowane w różnych systemach.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This single-molecule imaging assay enables high-resolution kinetic analysis of cap-dependent translation, addressing a critical gap in mechanistic understanding of eukaryotic protein synthesis. By resolving initiation and elongation rates at the individual mRNA level, it supports target validation and translational control studies in early discovery. The method enhances predictive confidence in de-risking therapeutic hypotheses related to translation dysregulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying translation initiation and elongation kinetics on single mRNAs.
- Operational Value: Provides quantitative readouts for functional target validation in cell-free systems.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving heterogeneity in translation activity across mRNA populations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence trajectories for quantitative comparison of translation conditions.
- Scalability: Compatible with various cell-free translation systems, enabling platform reuse across targets.
- Data Quality: Produces dwell time and first arrival time histograms that distinguish kinetic differences undetectable by bulk assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing mechanistic insights into cap-dependent translation regulation.
- Biomarker Alignment: Supports identification of translational biomarkers through kinetic profiling of mRNA-specific translation dynamics.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by revealing cell-free system sensitivity to experimental variables.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering kinetic resolution that complements bulk biochemical and phenotypic screening approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring real-time translation progression on individual mRNAs.
- Screening: Enables assay readiness through standardized immobilization and imaging of translation complexes.
- Analytics: Delivers single-molecule trajectory analysis, including dwell time and first arrival time measurements, for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant translation kinetics in eukaryotic systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for kinetic profiling across multiple translation systems and mRNA variants.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through resolution of initiation and elongation kinetics.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled cell-free translation and single-molecule imaging.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic assumptions about translation regulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative translation kinetics from single-molecule data.
Implementation Considerations
- Expertise in single-molecule fluorescence microscopy and cell-free translation systems.
- Instrumentation including TIRF-capable microscope, EMCCD camera, laser control, and syringe pump.
- Standardization of mRNA preparation, antibody labeling, and buffer conditions across teams.
- Adaptation considerations for different mRNA constructs and translation systems.
- Practical limitations including sensitivity to experimental conditions and requirement for consistent environmental control.
