Name: Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę obrazowania pojedynczych cząsteczek do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki w systemach bezkomórkowych. Technika zachowuje właściwości translacji masowej i zapewnia rozdzielczość pojedynczej cząsteczki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); oraz MSKCC Functional Genomics Initiative.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W porównaniu z typowymi eksperymentami jednocząsteczkowymi TIRF in vitro, obrazowanie pojedynczych cząsteczek za pomocą opisanego tutaj testu jest dodatkowo skomplikowane ze względu na zastosowanie ekstraktu komórkowego i wysokie stężenie przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. W porównaniu z bardziej powszechną praktyką jednej rundy pegylacji powierzchniowej, druga runda PEGylacji (etap 2) znacznie zmniejsza wiązanie przeciwciał niespecyficznych z powierzchniąwykrywania 15. Wysokie stę...

Translacja w systemach eukariotycznych zachodzi głównie poprzez szlaki zależne od kapu 7-metylopanozyny (m7G)1. Badania wskazują, że etap inicjacji translacji eukariotycznej ogranicza szybkość i jest wspólnym celem regulacji2,3,4. Mechanizmy translacji zależnej od czapeczki zostały szeroko zbadane przy użyciu podejść zbiorczych genetic5, biochemical6,7,8, structural9 i genomic10 masowych. Chociaż metody te zidentyfikowały różne mechanizmy, które regulują inicjację zależną od czapeczki, ich rozdzielczość ogranicza je do grupowego uśredniania sygnałów z heterogenicznych i asynchronicznych zdarzeń inicjacyjnych. Ostatnio poszczególne zdarzenia translacji in vivo zostały zobrazowane za pomocą metod, które mierzą wiązanie przeciwciał fluorescencyjnych z epitopami na powstających polipeptydach11,12,13,14. Jednak te nowe podejścia mają również ograniczoną zdolność do rozwiązywania indywidualnych zdarzeń inicjacyjnych, ponieważ wiele przeciwciał fluorescencyjnych musi związać powstający peptyd, aby umożliwić rozwiązanie pojedynczych zdarzeń translacji na tle o wysokiej fluorescencji wewnątrzkomórkowej. W wielu interakcjach biologicznych rozwiązane pojedyncze zdarzenia kinetyczne dostarczyły krytycznych informacji na temat zrozumienia złożonych, wieloetapowych i powtarzalnych procesów biologicznych, których nie można zsynchronizować na poziomie molekularnym. Potrzebne są nowe metody, które mogą śledzić dynamikę poszczególnych zdarzeń translacji, aby lepiej zrozumieć inicjację i regulację zależną od CAP.
Niedawno opracowaliśmy test in vitro, który mierzy kinetykę inicjacji zależnej od czapeczki z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki15. Biorąc pod uwagę dużą liczbę znanych i nieznanych czynników białkowych zaangażowanych w ten szlak inicjacji3,16, test pojedynczej cząsteczki został opracowany tak, aby był kompatybilny z istniejącymi systemami translacji bezkomórkowej in vitro, aby czerpać korzyści z zachowania czynników komórkowych i solidnej aktywności translacyjnej17,18,19,20,21,22,23,24,25. Co więcej, zastosowanie bezkomórkowych systemów translacji pozwala na bardziej kompatybilne porównania między obserwacjami pojedynczych cząsteczek a wcześniejszymi wynikami masowymi. Podejście to zapewnia prostą integrację nowych spostrzeżeń kinetycznych pojedynczych cząsteczek z istniejącymi mechanistycznymi ramami inicjacji zależnej od czapeczki. Aby ustalić test pojedynczej cząsteczki, tradycyjny bezkomórkowy system translacji jest modyfikowany na trzy sposoby: sekwencja kodująca epitop jest wprowadzana na początku otwartej ramki odczytu (ORF) reporterowego mRNA; koniec 3′ mRNA reporterowego jest biotynylowany, aby ułatwić wiązanie mRNA z powierzchnią wykrywania pojedynczej cząsteczki; a przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są uzupełniane do ekstraktu translacyjnego. Modyfikacje te wymagają jedynie podstawowych technik biologii molekularnej i powszechnie dostępnych odczynników. Co więcej, te modyfikacje i warunki obrazowania pojedynczej cząsteczki zachowują kinetykę translacji masowych reakcji translacji bez komórek15.
W tym teście (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), 5′-endowe i 3′-końcowe biotynylowane mRNA reporterowe jest unieruchomione na pokrytej streptawidyną powierzchni detekcyjnej w komorze przepływowej. Komora przepływowa jest następnie wypełniana bezkomórkową mieszaniną translacyjną uzupełnioną fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Po tym, jak nastąpiła translacja mRNA dla około 30-40 kodonów poniżej sekwencji epitopu26,27, epitop wyłania się z tunelu wyjściowego rybosomu i staje się dostępny do interakcji z przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie. Oddziaływanie to jest szybkie, a jego wykrywanie za pomocą technik obrazowania fluorescencji pojedynczej cząsteczki umożliwia śledzenie kinetyki translacji z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki podczas aktywnej translacji bezkomórkowej. Test ten powinien przynieść szerokie korzyści w badaniach in vitro kinetyki translacji zależnej od czapeczki i jej regulacji, szczególnie w przypadku systemów z testem in vitro o masie roboczej.
Warunkiem wstępnym do ustanowienia tego testu pojedynczej cząsteczki jest działający masowy test translacji bez komórek, który można osiągnąć przy użyciu ekstraktu translacyjnego, który jest dostępny na rynku lub przygotowany zgodnie z wcześniej opisanymi metodami28. Ekstrakt z translacji eukariotycznej można uzyskać z różnych komórek, w tym grzybów, ssaków i roślin28. Do obrazowania test ten wymaga mikroskopu TIRF wyposażonego w przestrajalną intensywność lasera i kąt padania, zmotoryzowany stolik na próbkę, zmotoryzowany system fluidyki i urządzenie do kontroli temperatury próbki. Wymagania te są ogólne dla nowoczesnych eksperymentów in vitro z pojedynczymi cząsteczkami TIRF i mogą być spełnione w różny sposób. W przedstawionym tu eksperymencie wykorzystano obiektywny system TIRF składający się z dostępnego na rynku mikroskopu, oprogramowania i akcesoriów, które są wymienione w Tabeli Materiałów.

<table><tbody><tr><td>Obiektyw olejowy 100X, brak danych 1.49</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Akrioamid/bis (40%, 19:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Alkaliczny detergent w płynie</td><td>Decon</td><td>5332</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilan (N-(2-aminoetylo)-3-aminopropylottrimetoksysilan)</td><td>UCT Specialties, LLC</td><td>A0700</td><td></td></tr><tr><td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Andor Solis</td><td>Andor</td><td></td><td>Do sterowania Andor EMCCD</td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma</td><td>532/640/25</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma</td><td>NF03-405/488/532/635E-25</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Biotyna-PEG-SVA</td><td></td></tr><tr><td>Koenzym A wolny kwas</td><td>Prolume</td><td>309-250</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Coolterm <td>Do sterowania pompą strzykawkową</td></tr><tr><td>Komputer stacjonarny</td><td>Dell</td><td></td><td>Do sterowania mikroskopem, kamerą, stolikiem i pompą.</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>R405/488/532/635</td><td></td></tr><tr><td>Mikropreparat Direct-zol RNA 50RNX</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1139450</td><td></td></tr><tr><td>System testowy reporterowy z podwójną lucyferazyą</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Epoksyd</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>Świetlik Lucyferyna D-Lucyferyna Wolny kwas</td><td>Prolume</td><td>306-250</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185500</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Olympus</td><td>Z-81226A</td> System oznaczania lucyferazy <td>o niskiej autofluorescencji</td></tr><tr>Zestaw<td>do transkrypcji</td><td>Promega</td><td>E1500</td><td></td></tr><tr><td>MEGASCRIPT T7</td><td>Thermo fisher</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Mikroskop MMX04751</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalny anty-FLAG M2-Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9594</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>MS(PEG)4</td><td>Thermo Scientific</td><td>22341</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Mikroskop Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>nr 1,5 Szkło osłonowe</td><td>Fisherband</td><td>12-544-C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td><td>Olympus cyfrowy system</td><td>laserowy CMR-LAS 532nm 100mW</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Olympus TirfCtrl</td><td>Olympus</td><td></td><td>Do kontrolowania intensywności lasera i kąta padania</td></tr><tr><td>Stół optyczny</td><td>Kontrola drgań TMC</td><td>63-563</td><td>Z izolacją drgań</td></tr><tr><td>Mieszanina alkoholu izoamylowego chloroformu fenolowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do biotynylacji Pierce RNA 3' End</td><td>Thermo Scientific</td><td>20160</td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wcześniejszy zmotoryzowany etap translacji XY</td><td>Wcześniejszy</td><td>PS3J100</td><td></td></tr><tr><td>Wcześniejszy Oprogramowanie PriorTest</td><td>Prior</td><td></td><td>Do kontrolowania wcześniejszego etapu zmotoryzowanego</td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor RNazy RNasin</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>Stage top Inkubator</td><td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td><td>98710-1</td><td>Z niestandardową akrylową klatką</td></tr><tr><td>Słoik do barwienia</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>43-4301</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300212</td><td></td></tr><tr><td>SYBR zielony II</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7564</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>1725RN</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>55-3333</td><td></td></tr><tr><td>Tris (1M), pH = 7,0</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td></td><td></td>CPX1800H</tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>System zamykania krowianki</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td> Zymo-Spin IC Kolumny <td></td></tr><tr><td></td><td>Zymo Research</td><td>C1004</td><td></td></tr></tbody></table>

test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Synteza białek zależna od kapu jest dominującym szlakiem translacyjnym w komórkach eukariotycznych. Podczas gdy różne podejścia biochemiczne i genetyczne umożliwiły szeroko zakrojone badania nad translacją zależną od czapeczki i jej regulacją, nadal brakuje wysokiej rozdzielczości kinetycznej charakterystyki tego szlaku translacji. Niedawno opracowaliśmy test in vitro do pomiaru kinetyki translacji zależnej od czapeczki z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki. Test opiera się na fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałie wiążącym się z powstającym polipeptydem znakowanym epitopem. Obrazując wiązanie i dysocjację przeciwciał do i z powstających kompleksów peptyd-rybosom-mRNA, można śledzić postęp translacji na poszczególnych mRNA. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia tego testu, w tym preparaty mRNA i szkiełek pegylowanych, obrazowanie translacji w czasie rzeczywistym oraz analizę trajektorii pojedynczych cząsteczek. Test ten umożliwia śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji zależnych od czapeczki i rozwiązuje kluczowe kwestie związane z kinetyką translacji, takie jak szybkość inicjacji i wydłużenia. Test ten może być szeroko stosowany do różnych systemów translacji i powinien przynieść szerokie korzyści w badaniach in vitro kinetyki translacji zależnej od czapeczki i mechanizmów kontroli translacji.

Postępowanie zgodnie z opisanym protokołem umożliwia obrazowanie pojedynczych oddziaływań przeciwciał z powstającymi polipeptydami z tagiem N-końcowym z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki podczas aktywnej translacji bezkomórkowej mRNA reporterowego przytwierdzonego końcem 3' (Rysunek 1). Przedstawiono minimalny eksperyment demonstracyjny z wykorzystaniem trzech syntetycznych mRNA: LUC (kodującego nieoznakowaną lucyferazę), LUCFLAG (kodującego lucyfer...

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia wykorzystanie istniejących bezkomórkowych systemów translacyjnych do analizy pojedynczych cząsteczek aktywnej translacji eukariotycznej. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zachowuje ona właściwości translacji masowej, zapewnia rozdzielczość pojedynczej cząsteczki i jest stosunkowo łatwa do zaadaptowania z innych testów translacji masowej. Metodę tę można zastosować do dowolnego systemu translacji bezkomórkowej, który został zweryfikowany pod kątem umożliwienia wydajnej translacji zależnej od limitu w warunkach masowych.Procedurę zademonstrują Hongyun Wang, pracownik naukowy, i Anthony Gaba, starszy naukowiec z laboratorium Xiaohui Qu. Co najmniej trzy godziny przed wykonaniem eksperymentu z pojedynczą cząsteczką włącz inkubator mikroskopowy i zmniejsz przepływ powietrza do niskiej prędkości, aby uniknąć nadmiernych zakłóceń akustycznych eksperymentu. Następnie ustaw temperaturę inkubatora na optymalną temperaturę specyficzną dla bezkomórkowego systemu translacji.Co najmniej godzinę przed eksperymentem naciśnij przycisk zasilania lasera za skrzynką laserową, przekręć bezpieczeństwa lasera i naciśnij przycisk start, aby włączyć laser. Włącz mikroskop i wybierz tryb obrazowania, obiektyw i zestaw filtrów. Włącz kamerę EMCCD, kontroler sceny, pompę strzykawkową i komputer, a następnie otwórz oprogramowanie kamery, lasera, zmotoryzowanego stolika i pompy strzykawkowej.W oprogramowaniu do sterowania laserem kliknij przycisk Połącz, aby ustawić intensywność lasera, odznacz pole migawki i kliknij przycisk sterowania, aby przeciągnąć suwak intensywności w wyskakującym oknie sterowania laserem. Wprowadź głębokość penetracji, aby ustawić laser pod żądanym kątem i upewnij się, że skrzynka migawki jest zamknięta, aby utrzymać laser w trybie wyłączenia, gdy nie obrazuje. Gdy aparat ostygnie i ustabilizuje się do wyznaczonej temperatury pracy, w oprogramowaniu aparatu wybierz kinetyczny jako tryb akwizycji i wprowadź czas ekspozycji, długość serii kinetycznej i parametry wartości wzmocnienia mnożenia elektronów.Wybierz katalog i przypisz nazwy plików do zapisania pliku obrazu danych. Ustaw pompę strzykawkową na skromne lub szybkie natężenie przepływu i dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu do rurki do mikrofuge. Włóż końcówkę rurki pompy strzykawkowej do roztworu etanolu i użyj oprogramowania pompy strzykawkowej, aby przełączyć pompę strzykawkową między trybami pobierania i dozowania, aby umyć rurkę trzy razy etanolem i trzy razy wodą wolną od RNaz.Po ostatnim umyciu wodą przetrzyj końcówkę rurki czystą chusteczką higieniczną, aby usunąć resztki wody z wnętrza rurki i umieść koniec rurki w czystej rurce do mikrofugi. W przypadku immobilizacji biotynylowanego mRNA na trzech końcach należy umieścić komorę przepływową w uchwycie próbki mikroskopu stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w dół i zabezpieczyć komorę taśmą. Użyj taśmy, aby zakryć wloty i wyloty kanałów przepływowych, które nie są używane, i dodaj 1,5-krotność objętości 200 mikrogramów na mililitr roztworu streptawidyny do kanału przepływowego.Po 10 minutach w temperaturze pokojowej umyj i przetrzyj kanał trzykrotnie trzykrotnie większą objętością bufora płuczącego T50 na pranie i złożoną chusteczką laboratoryjną. Po ostatnim myciu umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie mikroskopu i umieść uchwyt i komorę na stoliku mikroskopu. Następnie zbliż obiektyw do szkiełka nakrywkowego, aż olejek immersyjny na obiektywie zetknie się z szkiełkiem nakrywkowym i przesuń stolik próbki tak, aby kanał przepływu znajdował się bezpośrednio nad soczewką obiektywu.Na ekranie dotykowym sterowania mikroskopem wybierz kartę ostrości, a następnie kliknij przycisk Wyszukiwanie ostrości i uruchom. Po pomyślnym osiągnięciu płaszczyzny ostrości rozlegnie się sygnał dźwiękowy. W oprogramowaniu aparatu wybierz tryb na żywo.W oprogramowaniu do sterowania laserem otwórz migawkę lasera i wyreguluj poziom intensywności lasera. Obserwuj obraz fluorescencji w czasie rzeczywistym w trybie na żywo i na ekranie dotykowym sterowania mikroskopem za pomocą precyzyjnego sterowania krokowego do regulacji pozycji obiektywu. W oprogramowaniu kamery przesuń stolik, aby ocenić poziom tła fluorescencyjnego w różnych obszarach powierzchni detekcji kanału przepływowego.Jeśli fluorescencja jest niska, zatrzymaj tryb na żywo i zamknij migawkę lasera w oprogramowaniu sterującym laserem i zastąp bufor płuczący z kanału przepływowego dwukrotnie większą objętością biotynylowanego roztworu mRNA. Po 15 minutach umyj kanał trzykrotnie trzykrotnie większą objętością bufora kompatybilnego z translacją na pranie. W celu wykrycia pojedynczej cząsteczki zbierz trzykrotność objętości świeżo rozmrożonej mieszanki translacyjnej bez mRNA i uzupełnionej zoptymalizowanym stężeniem fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w probówce mikrowirówkowej na lodzie i krótko zakręć probówką, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki.Przenieś mieszaninę translacyjną do wnętrza nasadki rurki do mikrofug o pojemności 700 mikrolitrów i ustaw pompę strzykawkową w tryb pobierania. Włożyć końcówkę rurki pompy do mieszanki translacyjnej i rozpocząć pobieranie strzykawki. Gdy mieszanina translacyjna całkowicie dostanie się do rurki pompy, przerwij pobieranie, przekręć ustawienia pompy strzykawkowej w tryb dozowania i ustaw przepływ na optymalną szybkość dostarczania mieszanki translacyjnej.Uruchomić i zatrzymać strzykawkę, aby mieszanina translacyjna dotarła do końca rurki, jeśli to konieczne, a następnie włożyć końcówkę rurki pompy do wlotu kanału przepływowego, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Przykręć wykonany na zamówienie metalowy wspornik do płytki uchwytu próbki mikroskopu, aby ustabilizować połączenie i ocenić ostrość mikroskopu i fluorescencję obszaru obrazowania. Upewnij się, że parametry pozyskiwania filmu są poprawne oraz że została wprowadzona odpowiednia nazwa pliku i katalog do zapisania plików.Przesuń stolik, aby umożliwić obrazowanie obszaru w środku powierzchni wykrywania kanału przepływowego. A na karcie ciągły AF kliknij przyciski Start. Po pomyślnym osiągnięciu płaszczyzny ostrości rozlegnie się sygnał dźwiękowy.Po zmniejszeniu światła otoczenia otwórz migawkę lasera i kliknij przycisk odbierania sygnału, aby rozpocząć nagrywanie. Po pięciu sekundach wprowadź polecenie run, aby dostarczyć mieszankę tłumaczeń do kanału przepływu. Następnie nagrywaj dane przez maksymalnie dwie godziny w rozdzielczości od 0,5 do dwóch sekund na klatkę.Aby przeanalizować zdarzenia wiązania Cy3 ANTI-FLAG, intensywność fluorescencji wybranych plamek flagi Cy3 alfa została obliczona klatka po klatce dla całego filmu i połączona w celu utworzenia trajektorii intensywności. Surowe trajektorie mogą wydawać się zaszumione i mogą wymagać udoskonalenia za pomocą nieliniowego filtra do przodu/do tyłu w celu zmniejszenia szumów tła. Dalsze udoskonalenie można osiągnąć za pomocą algorytmów wykrywania kroków do digitalizacji trajektorii.Wiązanie przeciwciała z powstającym polipeptydem powoduje natychmiastowy wzrost fluorescencji, podczas gdy dysocjacja polipeptydu przeciwciała powoduje natychmiastowy spadek fluorescencji. Histogram czasu przebywania dla mRNA oznaczającego lucyferazy pasuje do logarytmicznego rozkładu normalnego i daje szybkość syntezy peptydów 2,5 plus minus 0,1 aminokwasów na sekundę. Histogram czasu pierwszego przybycia pasuje do przesuniętej funkcji logarytmicznej normalnej, co ilustruje wysoki stopień niejednorodności w aktywności translacyjnej pojedynczego mRNA.Jak wskazuje histogram, pierwsze zdarzenie syntezy peptydów na pojedynczych cząsteczkach mRNA flagi lucyferazy może rozpocząć się już po dwóch minutach i dopiero po 20 minutach od dostarczenia mieszanki translacyjnej. W porównaniu z translacją z mRNA flagi lucyferazy, histogram czasu pierwszego nadejścia z translacją mRNA flagi lucyferazy spinki do włosów wykazał wolniejsze wiązanie przeciwciał. Stosowanie masowych pomiarów luminescencji z bezkomórkowych reakcji translacji z tymi samymi mRNA nie rozwiązuje jednak różnic w kinetyce translacji.Rozdzielczość pojedynczej cząsteczki w tym teście zapewnia bardziej kinetyczne wglądy w translację zależną od czapeczki, które nie są łatwe do osiągnięcia przy użyciu innych podejść. Translacja bez komórek eukariotycznych jest wrażliwa na niewielkie zmiany i warunki eksperymentalne. Dlatego dbałość o szczegóły i spójność mają kluczowe znaczenie podczas korzystania z tego testu w celu dokładnego wykrycia niewielkich różnic w translacji.

an-vitro-single-molecule-imaging-assay-for-analysis-cap-dependent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI 1.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Tutaj opisujemy protokół charakterystyki biochemicznej enzymu modyfikującego RNA drożdży, Mod5, i omawiamy, jak ten protokół mógłby być zastosowany do innych enzymów modyfikujących RNA.

Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej

SINEUPs to syntetyczne, antysensowne, niekodujące RNA, które zawierają domenę wiążącą (BD) i domenę efektorową (ED) oraz regulują w górę translację docelowego mRNA. W tym miejscu opisujemy metody wykrywania SINEUP w hodowanych liniach komórkowych, analizę ich aktywności promującej translację za pomocą Western-blot oraz półautomatyczny system obrazowania o wysokiej przepustowości.

Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Ten protokół opisuje test reporterowy do badania regulacji translacji mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania in vitro.

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Protokół przedstawia dwie metody określania kinetyki aptamerów fluorogennego RNA: Szpinak2 i Brokuły. Pierwsza metoda opisuje, w jaki sposób mierzyć kinetykę aptamerów fluorogennych in vitro za pomocą czytnika płytkowego, podczas gdy druga metoda szczegółowo opisuje pomiar kinetyki aptamerów fluorogennych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA

Poznaj metodę obrazowania pojedynczych cząsteczek do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki w systemach bezkomórkowych. Technika zachowuje właściwości translacji masowej i zapewnia rozdzielczość pojedynczej cząsteczki.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Przeglądaj więcej filmów