Protokół iniekcji lipidico do pomiarów krystalografii seryjnej w australijskim synchrotronie

Protokół ten daje naukowcom możliwość scharakteryzowania kryształów białkowych osadzonych w materiałach o wysokiej lepkości, a także innych miękkich materiałów, które są obecnie trudne do scharakteryzowania przy użyciu istniejących układów. Za pomocą tej metody próbki są przygotowywane w szklanych strzykawkach, montowanych bezpośrednio na wtryskiwaczu, dzięki czemu system wtryskiwaczy jest łatwy w użyciu i minimalizuje ilość odpadów próbki. Aby przygotować kryształy w ośrodku o wysokiej lepkości, najpierw odwiruj roztwór kryształów z niską prędkością, aby utworzyć miękką krystaliczną osadkę.

Po usunięciu nadmiaru pożywki przymocować łącznik do końca jednej szklanej strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów i załadować 28 mikrolitrów roztworu krystalicznego do cylindra strzykawki. Powoli włożyć tłok do górnej części strzykawki i delikatnie wepchnąć roztwór do końca końcówki łącznika. Aby usunąć pęcherzyki, należy użyć palca w rękawiczce, aby bardzo delikatnie docisnąć górną część stępionego punktu igły łącznika, aby utworzyć uszczelnienie i cofnąć tłok, aby odciągnąć roztwór od końcówki igły, aby wytworzyć nagromadzenie ciśnienia w strzykawce, a następnie usunąć palec, aby szybko zwolnić ciśnienie i rozbić wszelkie pęcherzyki wewnątrz strzykawki.

Alternatywnie, należy trzymać strzykawkę w jednej ręce, z igłą skierowaną do góry i tłokiem zaklinowanym między dwoma palcami i szybko obrócić ramię trzymające strzykawkę w jednym kierunku dwa do trzech razy. Powstała siła odśrodkowa wypchnie pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy za pomocą cienkiej szpatułki dodać 42 mikrolitry wysokopróżniowego smaru silikonowego bezpośrednio na wierzch drugiej strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów i wcisnąć tłok do samego końca, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i upewnić się, że na końcu strzykawki nie ma szczeliny powietrznej.

Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z obu strzykawek, trzymając obie strzykawki za końce, połączyć strzykawki ze złączką. Aby wymieszać ze sobą próbki, delikatnie wciśnij kolejno zarówno roztwór krystaliczny, jak i tłoki strzykawki ze smarem silikonowym od 50 do 100 razy, aż materiały dokładnie się wymieszają i będą wydawać się jednorodne. Następnie wizualizuj kryształy pod mikroskopem optycznym.

Aby określić stężenie kryształów w smarze silikonowym, policz liczbę kryształów w określonym obszarze za pomocą obrazów z mikroskopu optycznego. Aby zmniejszyć stężenie kryształów, powtórz przygotowanie kryształów przy użyciu większej objętości smaru silikonowego lub rozcieńcz kryształ w buforze krystalizacyjnym przed ustawieniem strzykawki. Aby zwiększyć stężenie kryształów, powtórz przygotowanie kryształów przy użyciu mniejszej objętości smaru silikonowego, uważając, aby nie zmniejszyć lepkości poniżej 10 sekund paskalowych.

Po uzyskaniu odpowiedniego stężenia kryształów należy przenieść całą próbkę do jednej strzykawki i zastąpić łącznik igłą iniekcyjną o średnicy wewnętrznej 108 mikronów, bardzo mocno wkręconą w podstawę strzykawki. Aby skonfigurować wtryskiwacz, wybierz narzędzia i tryb bazowania oraz ujemny wyłącznik krańcowy, a następnie rozpocznij bazowanie i pozwól oprogramowaniu działać, aż śruba zostanie cofnięta na tyle, aby strzykawka o pojemności 100 mikrolitrów zmieściła się pod śrubą. Wprowadzić igłę pustej strzykawki przez szczelinę w uchwycie strzykawki, aby zamontować strzykawkę na wstrzykiwaczu i przyłożyć strzykawkę do wspornika.

Owinąć jeden O-ring w poprzek środkowej części strzykawki, mocując pierścień do haczyków po obu stronach strzykawki i owinąć drugi O-ring wokół haczyków w górnej części strzykawki. Upewnij się, że jedna część drugiego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym jest umieszczona na górze szklanej strzykawki. Aby przygotować strzykawkę z próbką, należy ją zalać, umieścić nasadkę wtryskiwacza na głowicy tłoka strzykawki z próbką i załadować strzykawkę do wstrzykiwacza.

Przesuń napędową do górnej części nasadki. W oprogramowaniu sterującym wtryskiwaczem wybierz tryb prędkości i aktywuj tryb prędkości. Ustaw wartość ustawienia na 3 000 obrotów na minutę i kliknij zastosuj wartość ustawienia.

Gdy śruba zbliża się do nasadki na głowicy tłoka strzykawki, zmień wartość ustawienia na zero. Po nawiązaniu kontaktu kliknij przycisk Zastosuj wartość ustawienia, aby aktywować ustawioną wartość, natychmiast zatrzymując. Następnie delikatnie poruszaj nasadką, aby upewnić się, że jest mocno trzymana na miejscu.

Aby uruchomić wtryskiwacz, zmień wartość ustawienia na 100 obrotów na minutę i sprawdź wzrokowo końcówkę, aby obserwować próbkę, gdy zaczyna się wytłaczać. Po zamknięciu budki zmniejszaj wartość ustawienia o 10, aż do zaobserwowania powolnego, ale stabilnego strumienia materiału. Jeśli strumień próbki nie przepływa prawidłowo, zwiększaj wartość ustawienia w krokach co 10 obrotów na minutę, aż strumień stanie się prostszy.

Jeśli strumień nie ustabilizuje się, umieść polistyrenowy łapacz próbki pod strumieniem próbki, aby ułatwić prowadzenie próbki. Alternatywnie można włożyć lejek ssący Venturiego do łapacza próbek, który można podłączyć do rurki wylotowej powietrza znajdującej się w klatce australijskiego synchrotronu. Aby określić natężenie przepływu strumienia, należy skorzystać z kalkulatora przepływu urządzenia Lipidico.

Określenie optymalnej prędkości przepływu próbki dla wtryskiwacza ma kluczowe znaczenie dla stabilności strumienia. Niskie natężenie przepływu powoduje rozszerzanie się smaru silikonowego wytłaczanego z wtryskiwacza, podczas gdy większe natężenie przepływu wytwarza cieńszy strumień. Regularnie obserwowano zwijanie się lepkiego strumienia mediów.

Aby przezwyciężyć ten problem w silnie naładowanych próbkach, można użyć chwytacza polistyrenowego do wprowadzenia słabej siły elektrostatycznej. W niniejszej analizie użyto szklanej strzykawki zawierającej 26 mikrolitrów kryształów lizozymu zawieszonych w smarze silikonowym. W ciągu 38 minut zebrano wystarczającą ilość danych, co umożliwiło wygenerowanie mapy gęstości elektronów otaczającej wiązania dwusiarczkowe w strukturze lizozymu.

Należy pamiętać, aby użyć małej objętości próbki na szkiełku podstawowym do oceny stężenia kryształów w próbce w celu określenia, czy należy skorygować lepkość. Wszechstronność wtryskiwacza pozwala na charakteryzację rentgenowską innych materiałów o wysokiej lepkości. Na przykład struktury cieczy jonowej wykorzystujące badania baterii lub materiały koloidalne wykorzystujące produkty mleczne.