Name: Protokół iniekcji lipidico do pomiarów krystalografii seryjnej w australijskim synchrotronie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę przygotowania kryształów białkowych w lepkich mediach za pomocą wysokolepkiego iniekora Lipidico w australijskim synchrotronie. Protokół minimalizuje stratę próbek i usprawnia zbieranie danych krystalograficznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Centrum Doskonałości Zaawansowanego Obrazowania Molekularnego (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/) Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych. Badania te zostały częściowo przeprowadzone przy użyciu linii badawczej MX2 w australijskim synchrotronie, będącym częścią ANSTO, i z wykorzystaniem detektora Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Przygotowanie kryształów w ośrodku o wysokiej lepkości za pomocą szklanych strzykawek
<ol>
	<li>Delikatnie odwirować roztwór krystaliczny (~1 000 x g, ~10 min w temperaturze 22 °C) do uzyskania miękkiego kryształowego osadu i usunąć nadmiar buforu. Spowoduje to wysokie stężenie kryształów w granulce, które można wykorzystać do zbierania danych. 
	UWAGA: Aby zapobiec rozcieńczeniu lepkich mediów, należy zwiększyć stężenie kryształów na tym etapie. Zoptymalizuj stosunek lepkich mediów do objętości kryształów dla każdej próbki, aby uzyskać wysokie stężenie kryształów przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej lepkości mediów. Odwirować roztwór krystaliczny w celu utworzenia osadu i usunąć nadmiar buforu w celu zwiększenia stężenia kryształów w roztworze, jak opisano w Darmanin i in. al.29.</li>
	<li>Ustawić dwie strzykawki o pojemności 100 μl ze złączką.</li>
	<li>Przymocować łącznik do końca pierwszej strzykawki i dodać 28 μl roztworu krystalicznego do górnej części strzykawki. Powoli włożyć tłok do górnej części strzykawki i delikatnie wepchnąć roztwór do końca końcówki łącznika, usuwając wszelkie tworzące się pęcherzyki powietrza. W tym celu należy postępować zgodnie z jedną z dwóch metod omówionych poniżej. 
	UWAGA: Objętość kryształów, które mają być dodane do podłoża o wysokiej lepkości, może być zmieniana, jeśli nie zmienia to znacząco lepkości całej próbki.
	<ol>
		<li>Pierwsza metoda: Użyj szybkich zmian ciśnienia, aby rozerwać pęcherzyki powietrza.
		<ol>
			<li>Ostrożnie umieść jeden palec w rękawiczce na czubku igły łącznika i (bardzo delikatnie) dociśnij, aby uzyskać uszczelnienie. Nie należy wywierać zbyt dużego nacisku, ponieważ może to spowodować zranienie igłą.</li>
			<li>Teraz odciągnąć tłok do tyłu, aby odciągnąć roztwór od punktu igły, co spowoduje wzrost ciśnienia w strzykawce.</li>
			<li>Szybko zwolnić nacisk w górnej części strzykawki, wyjmując palec w rękawicy z końcówki igły. Zachowaj ostrożność, jeśli próbka znajduje się zbyt blisko końcówki po zdjęciu palca, może rozprysnąć się, powodując utratę próbki. Gwałtowna zmiana ciśnienia w strzykawce spowoduje pęknięcie pęcherzyków powietrza. Powtarzaj, aż wszystkie bąbelki zostaną usunięte.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Druga metoda: Użycie "wirówki ludzkiej" w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
		<ol>
			<li>Umieścić strzykawkę w jednej ręce, z igłą skierowaną do góry i tłokiem zaklinowanym między dwoma palcami, tak aby nie mogła się poruszać.</li>
			<li>Szybko obróć ramię trzymające strzykawkę w jednym kierunku 2-3 razy, powstała siła odśrodkowa działająca na próbkę wypchnie pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Bądź ostrożny, jeśli zrobisz to zbyt wolno, próbka może zostać utracona.</li>
			<li>Sprawdzić, czy w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza, jeśli pozostaną pęcherzyki, powtórz kroki 1.3.2.1 – 1.3.2.2, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą cienkiej szpatułki dodaj ~42 μl smaru silikonowego o wysokiej próżni bezpośrednio na wierzch drugiej strzykawki. Wcisnąć tłok do samego końca, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza i upewniając się, że na końcu strzykawki nie ma szczeliny powietrznej. 
	UWAGA: Dokładny skład smaru silikonowego nie ma decydującego znaczenia, ponieważ działa on jak obojętny nośnik. Wartość lepkości >10 Pa.s lub stosunek około 60:40 smaru silikonowego do roztworu kryształu jest optymalna do iniekcji, jednak możliwe jest, że może się ona różnić w zależności od dokładnej charakterystyki próbki. Dostosuj objętość roztworu krystalicznego dodawanego do smaru silikonowego, aby zoptymalizować stężenie kryształów w mieszaninie, zgodnie z opisem w dyskusji. Można stosować media o wysokiej lepkości, inne niż smar silikonowy, o ile są one kompatybilne z próbką30,31,32,33.</li>
	<li>Upewnij się, że w żadnej z dwóch strzykawek nie ma pęcherzyków powietrza i połącz strzykawki ze sobą za pomocą łącznika. Trzymać strzykawki pionowo, chwytając tylko za koniec strzykawki, ponieważ rozgrzanie strzykawki spowodowane ciepłem wytwarzanym przez palce może mieć wpływ na próbkę.</li>
	<li>Wymieszać próbkę ze sobą, delikatnie naciskając tłok po stronie roztworu krystalicznego, tak aby zmieszał się ze smarem silikonowym, a następnie popchnąć tłok po stronie smaru silikonowego, tak aby popchnął próbkę z powrotem w kierunku strony roztworu krystalicznego. Delikatnie powtórz ten proces od 50 do 100 razy, aby próbka została dokładnie wymieszana i wyglądała na jednorodną. 
	UWAGA: Jeśli kryształy są hodowane bezpośrednio w podłożach o wysokiej lepkości (np. lipidowej fazie sześciennej, LCP), kroki 1.1–1.6 nie są wymagane. Protokoły hodowli kryształów w strzykawkach można znaleźć w Liu et.al. 34,35. Postępuj zgodnie z tym protokołem aż do konsolidacji próbki, kroku 10, w którym cała próbka jest teraz zawarta w jednej strzykawce, a bufor krystalizacyjny jest usuwany. Dodanie 7.9MAG nie jest wymagane dla tego protokołu. Zamiast tego należy usunąć cały nadmiar płynu ze strzykawki, delikatnie wciskając tłok w próbce, aż w strzykawce nie pozostanie już płyn.</li>
	<li>Wizualizuj kryształy pod mikroskopem optycznym przez strzykawkę lub, aby uzyskać najlepsze wyniki, wyekstrahuj niewielką ilość (~1 μl) na szkiełko podstawowe i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.</li>
	<li>Sprawdź stężenie kryształów.
	<ol>
		<li>Określ stężenie kryształów w smarze silikonowym, zliczając liczbę kryształów w określonym obszarze za pomocą obrazów z mikroskopu optycznego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, idealna jest wysoka gęstość kryształów równomiernie rozmieszczonych w pożywce (>106 kryształów/ml) w celu uzyskania wysokiego współczynnika trafień kryształów.</li>
		<li>Wyregulować stężenie kryształów w strzykawce, zmieniając stosunek kryształów do lepkich mediów w krokach 1.3 i 1.4.
		<ol>
			<li>Aby zmniejszyć stężenie kryształów, należy rozcieńczyć kryształy w strzykawce, zwiększając ilość smaru silikonowego/podłoża HV w kroku 1.4 lub rozcieńczając kryształowy osad w roztworze z buforem krystalizacyjnym przed ustawieniem strzykawek w kroku 1.1.</li>
			<li>Aby zwiększyć stężenie kryształów, zmniejsz ilość smaru silikonowego w kroku 1.4, ale pamiętaj, aby nie zmniejszać lepkości poniżej 10 Pa.s. 
			UWAGA: Przedstawione tutaj stężenie kryształów zostało zoptymalizowane dla tej konkretnej próbki i rozmiaru kryształu. Jednak idealne stężenie kryształów będzie zależeć od rozmiaru kryształu, rozmiaru wiązki, wewnętrznej średnicy igły (ID) i padającego strumienia promieniowania rentgenowskiego. Można to określić na podstawie współczynnika trafień przy optymalnym współczynniku trafień wynoszącym ~30% uznanym za "dobry". W praktyce stężenie kryształów musi być zoptymalizowane dla różnych próbek w czasie wiązki, aby uzyskać pożądaną szybkość trafień. Zacznij od wysokiego stężenia kryształów, 109 kryształów / ml. Procedura regulacji stężenia kryształów jest podana w Liu et.al. 35.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W tym miejscu protokół można wstrzymać do czasu, aż wtryskiwacz będzie gotowy do zbierania danych.
		<ol>
			<li>Jeśli kryształy są hodowane w LCP, zamknij je i pozostaw w strzykawkach do kilku dni w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Jeśli kryształy zostały przeniesione do innego medium o wysokiej lepkości (np. smaru silikonowego), przed pomiarem należy przeprowadzić test stabilności kryształów w czasie. Pozwoli to określić, jak długo kryształy są stabilne w obojętnym podłożu (najlepiej > 8 godzin) i limit czasu na zebranie danych. W tym przypadku kryształy lizozymu były stabilne przez wiele dni w smarze silikonowym i nie wykazywały oznak rozpuszczania podczas badania za pomocą mikroskopu optycznego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść całą próbkę do jednej strzykawki przed odłączeniem łącznika. Odłączyć łącznik od strzykawki i założyć igłę do wstrzykiwań. Mocno wkręcić igłę w podstawę strzykawki i upewnić się, że jest mocno zamocowana, aby zapobiec wyciekom. Do tego eksperymentu użyto igły o średnicy wewnętrznej 108 μm (długość igły 13 mm, typ punktowy 3). W zależności od rozmiaru kryształu i rozmiaru wiązki przymocuj igłę o średnicy wewnętrznej 51 μm lub 108 μm. 
	UWAGA: Wymagane jest wstępne testowanie strumienia próbki przed czasem wiązki, aby móc wybrać właściwy rozmiar igły wtryskiwacza. W zależności od charakterystyki próbki (tj. lepkości, napełnienia, składu buforu) i średnicy wewnętrznej igły, próbki będą płynąć w różny sposób. Dlatego zaleca się testowanie różnych rozmiarów igieł w celu wytworzenia najbardziej stabilnego strumienia z najmniejszą możliwą igłą o średnicy wewnętrznej, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu podczas zbierania danych.</li>
	<li>Jeśli wtryskiwacz jest już zamontowany i wyrównany na linii belki, przejdź do sekcji 3 i zamontuj strzykawkę z próbką bezpośrednio na wtryskiwaczu. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Montaż i sterowanie wtryskiwaczami
<ol>
	<li>Zamontuj wtryskiwacz na linii badawczej. Zdemontować dyszę kriogeniczną na linii badawczej MX2 i zastąpić ją wtryskiwaczem. Poluzuj mocującą dyszę kriogeniczną i przymocuj ją do wspornika znajdującego się obok zmotoryzowanego stage'a.</li>
	<li>Podnieś wtryskiwacz z wózka, trzymając za uchwyt i umieść go na zmotoryzowanym stoliku.
	<ol>
		<li>Aby przymocować wtryskiwacz do zmotoryzowanego stage'a; ręcznie dokręć czarne clamppokrętło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontować pustą strzykawkę na wtryskiwaczu
	<ol>
		<li>W interfejsie sterowania komputerowego wtryskiwacza (tj. w oprogramowaniu do sterowania położeniem EPOS) wybierz opcję Homing Mode (Tryb bazowania) w obszarze Tools (Narzędzia) w menu oprogramowania. Następnie wybierz Ujemny wyłącznik krańcowy i Rozpocznij bazowanie, pozwól oprogramowaniu działać, aż śruba zostanie cofnięta na tyle, aby strzykawka zmieściła się pod śrubą. W przypadku pozostawienia bez nadzoru wyłącznik krańcowy automatycznie zatrzymuje.</li>
		<li>Zamontować pustą ("fikcyjną") strzykawkę na wstrzykiwaczu, wprowadzając igłę przez szczelinę w uchwycie strzykawki. Przyłożyć strzykawkę do zamka.</li>
		<li>Zapiąć strzykawkę za pomocą dwóch pierścieni uszczelniających o przekroju okrągłym.
		<ol>
			<li>Owinąć pierwszy O-ring w poprzek środkowej części strzykawki, mocując go do haczyków po obu stronach strzykawki.</li>
			<li>Owiń drugi O-ring wokół haczyków w górnej części strzykawki, a następnie umieść jedną część O-ringu na górze szklanej strzykawki, jak pokazano na demonstracji i Rysunek 1B.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopasuj wtryskiwacz do wiązki promieniowania rentgenowskiego
	<ol>
		<li>Przesunąć zmotoryzowany stolik z wtryskiwaczem w kierunku punktu interakcji promieniowania rentgenowskiego za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą. Można to zobrazować za pomocą wbudowanej kamery. Rozmiar i położenie wiązki jest oznaczone czerwonym krzyżykiem na ekranie, a zmotoryzowany stolik można przesuwać, aby wyrównać igłę z obszarem interakcji promieniowania rentgenowskiego.</li>
		<li>Dostosuj położenie x i y stolika, aby wyrównać igłę z czerwonym krzyżykiem.</li>
		<li>Dostosuj położenie z, aż końcówka igły znajdzie się w ostrości.</li>
		<li>Sprawdź wizualne wyrównanie końcówki igły i wiązki promieniowania rentgenowskiego, sprawdzając, czy końcówka strzykawki styka się z krzyżykiem, który jest widoczny na obrazie mikroskopu optycznego wygenerowanym przez kamerę linii badawczej.</li>
		<li>Po wyrównaniu końcówki igły przesuń końcówkę powyżej krzyża nitkowego ~100 μm. Eliminuje to rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego z końcówki igły. 
		UWAGA: Montaż i ustawienie wtryskiwacza na linii badawczej MX2 na synchrotronie musi być wykonane przez naukowców linii badawczej i może być zakończone w czasie krótszym niż 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montaż strzykawki z próbką
<ol>
	<li>Zastąp pustą strzykawkę strzykawką próbką, postępując zgodnie z krokiem 2.3.</li>
	<li>Umieścić nasadkę wtryskiwacza na głowicy tłoka strzykawki z próbką.</li>
	<li>Przesuń napędową do górnej części nasadki.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym wtryskiwaczem wybierz tryb prędkości.</li>
	<li>Wprowadź 3000 obr./min (~115 nL/s) jako wartość ustawienia i naciśnij Zastosuj wartość ustawienia.</li>
	<li>Gdy śruba napędowa dotknie nakrętki na głowicy tłoka strzykawki, zatrzymaj silnik.
	<ol>
		<li>Ustaw wartość obrotów na zero w oprogramowaniu sterującym wtryskiwaczem, zmieniając wartość ustawienia na "0", gdy śruba zbliża się do nakrętki.</li>
		<li>Po nawiązaniu kontaktu aktywuj ustawioną wartość, naciskając Zastosuj wartość ustawienia, aby natychmiast zatrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie poruszaj nasadką, aby upewnić się, że jest mocno trzymana na miejscu. 
	UWAGA: Za każdym razem, gdy nowa wartość zadana zostanie wprowadzona w polu Wartość ustawienia w oprogramowaniu sterującym, jest ona aktywowana dopiero po naciśnięciu przycisku Zastosuj wartość ustawienia.</li>
</ol>
4. Uruchamianie wtryskiwacza
<ol>
	<li>Po tym, jak śruba napędowa kołpaka mocno zetknie się z górną częścią tłoka, zmień wartość ustawienia obrotów na 100. Odpowiada to ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo końcówkę igły, gdy próbka wychodzi po raz pierwszy lub spójrz na obraz igły z kamery linii badawczej, aby zaobserwować, kiedy próbka zaczyna wyciskać się z końcówki igły.</li>
	<li>Przeszukaj klatkę, zamknij drzwi klatki i włącz wiązkę promieniowania rentgenowskiego. Od tego momentu wtryskiwacz musi być obsługiwany zdalnie z zewnątrz budki.</li>
	<li>Dostosuj prędkość obrotową, aż zostanie wygenerowany stabilny strumień.
	<ol>
		<li>Zmniejsz wartość ustawienia prędkości obrotowej do 90.</li>
		<li>Powtórz krok 4.4.1, zmniejszając wartość ustawienia prędkości obrotowej w krokach co 10, aby spowolnić strumień, ale nadal utrzymać stabilny strumień. W przypadku smaru silikonowego zastosowano wartość 30 obr./min. 
		UWAGA: Typowy zakres prędkości obrotowych waha się między 30 – 100 obr./min (1 – 4 nL/s) w zależności od charakterystyki próbki i czasu ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie. Ogólnie rzecz biorąc, prędkość obrotowa powinna być dostrojona tak, aby wytwarzać najwolniejsze natężenie przepływu (w celu zminimalizowania zużycia próbki) przy jednoczesnym utrzymaniu stabilnego strumienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarządzanie strumieniem próbki, który nie przepływa prawidłowo.
	<ol>
		<li>Zwiększaj wartość ustawienia prędkości obrotowych w krokach co 10, aż strumień stanie się prostszy. Jeśli strumień nie stabilizuje się, nawet po zwiększeniu wartości ustawienia obrotów na minutę do maksymalnej wartości 100 obr./min spróbuj poprawić stabilność, stosując jedną z dwóch metod opisanych poniżej.
		<ol>
			<li>Pierwsza metoda: Umieść chwytacz próbek z polistyrenu pod strumieniem próbki, aby ułatwić prowadzenie próbki. Ta metoda działa dobrze w przypadku wysoce naładowanych strumieni próbek.</li>
			<li>Druga metoda: Włożyć lejek ssący Venturiego do łapacza próbki. Aby dostarczyć powietrze do lejka, podłącz go do rurki wylotu powietrza znajdującej się w budce. Ta metoda może pomóc w kierowaniu i stabilizowaniu przepływu próbki niezależnie od ładunku strumienia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po osiągnięciu stałego i stałego strumienia rozpocznij zbieranie danych i zoptymalizuj odległość detektora zgodnie z normalnym eksperymentem krystalografii rentgenowskiej. 
	UWAGA: Obroty są przeliczane na natężenie przepływu za pomocą dostarczonej tabeli przeliczeniowej w informacjach uzupełniających, "Kalkulator urządzenia Lipidico". Wprowadź wartość obrotów, średnice igły i objętość strzykawki, aby obliczyć natężenie przepływu za pomocą tego kalkulatora.</li>
</ol>

<ol><li>Boutet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+protein+structure+determination+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography.</a> Science. 337 (6092), 362-364 (2012).</li>
<li>Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+lasers+for+structural+and+dynamic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">X-ray lasers for structural and dynamic biology.</a> Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601(2012).</li>
<li>Aquila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+protein+nanocrystallography+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser.</a> Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nylon+mesh-based+sample+holder+for+fixed-target+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 9, 6971(2019).</li>
<li>Martin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+X-ray+diffraction+reveals+three-dimensional+nanostructure+and+disorder+in+self-assembled+lipid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Materials%22%5BJournal%5D)">Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases.</a> Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+fixed-target+serial+virus+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed fixed-target serial virus crystallography.</a> Nature Methods. 14 (8), 805(2017).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nature Communications. 5, 3309(2014).</li>
<li>Weierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li>
<li>Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+delivery+media+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample delivery media for serial crystallography.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094(2019).</li>
<li>Batyuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+phasing+of+x-ray+free-electron+laser+data+for+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor.</a> Science Advances. 2 (9), 1600292(2016).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+intermediates+of+Kok%27s+photosynthetic+water+oxidation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock.</a> Nature. 563 (7731), 421(2018).</li>
<li>Suga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxyl%2Foxo+mechanism+for+oxygen-oxygen+coupling+in+PSII+revealed+by+an+x-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser.</a> Science. 366 (6463), 334-338 (2019).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Pande, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+structural+dynamics+drives+the+trans%2Fcis+isomerization+in+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein.</a> Science. 352 (6286), 725-729 (2016).</li>
<li>Ishigami, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot+of+an+oxygen+intermediate+in+the+catalytic+reaction+of+cytochrome+c+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).</li>
<li>Nango, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+movie+of+structural+changes+in+bacteriorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin.</a> Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+isomerization+in+bacteriorhodopsin+captured+by+a+femtosecond+x-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser.</a> Science. 361 (6398), (2018).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+millisecond+crystallography+of+membrane+and+soluble+protein+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).</li>
<li>Berntsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+millisecond+crystallography+instrument+at+the+Australian+Synchrotron+incorporating+the+%22Lipidico%22+injector%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector.</a> Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110(2019).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).</li>
<li>DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDePonte%2C+DP+%22Advances+in+X-Ray+Free-Electron+Lasers%3A+Radiation+Schemes%2C+X-Ray+Optics%2C+and+Instrumentation%3A+Proceedings+of+Society+of+Photo-Optical+Instrumentation+Engineers%22">Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers</a>. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078(2011).</li>
<li>Park, S. Y., Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+delivery+using+viscous+media%2C+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li>
<li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li>
<li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li>
<li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345(2016).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484(2016).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463(2016).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li>
<li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science%3A+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li>
</ol>

MK sprawdza się w projektach Kusel. Dr Peter Bentsen z Uniwersytetu La Trobe i dr Tom Caradoc-Davies z ANSTO zaangażowali firmę Kusel Design, zajmującą się opracowywaniem niestandardowych urządzeń laboratoryjnych, w opracowanie taniego urządzenia, które umożliwiłoby badania o wysokiej lepkości na linii wiązki MX2 w australijskim synchrotronie. Urządzenie zostało opracowane w ścisłej konsultacji z dr Caradoc-Davies. Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opracowano alternatywny HVI, idealny do przeprowadzania eksperymentów SX w źródłach synchrotronowych. Ma dwie kluczowe zalety w porównaniu z istniejącymi HVI. Po pierwsze, jest łatwy do zainstalowania na linii badawczej, co pozwala na szybkie przełączanie między konwencjonalną krystalografią a SX, zaledwie ~30 minut jest potrzebne do instalacji i wyrównania na MX2. Po drugie, strzykawki z próbkami używane do hodowli kryształów mogą być bezpośrednio używane jako zbiorniki do wstrzykiwań, co ogranicza marnotrawstwo podczas...

Krystalografia szeregowa (SX) to technika, która została początkowo opracowana w kontekście rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFELs)1,2,3,4. Chociaż dla SX5,6,7, zazwyczaj systemy wtryskiwaczy są wykorzystywane do dostarczania kryształów w ciągłym strumieniu do wiązki promieniowania rentgenowskiego. Ponieważ łączy dane z dużej liczby kryształów, SX pozwala uniknąć konieczności ustawiania kryształów podczas eksperymentu i umożliwia zbieranie danych w temperaturze pokojowej8,9. Za pomocą odpowiedniego wtryskiwacza kryształy są przesyłane jeden po drugim do obszaru oddziaływania promieniowania rentgenowskiego, a uzyskane dane dyfrakcyjne są zbierane na detektorze obszarowym9,10. Do tej pory SX udało się rozwiązać wiele struktur białkowych1,11,12,13, w tym kryształy zbyt małe, aby można je było zmierzyć za pomocą konwencjonalnej krystalografii. Dostarczyło również nowych informacji na temat czasowo-rozdzielczej dynamiki molekularnej poprzez wykorzystanie czasu trwania impulsu femtosekundowego XFEL. Inicjując reakcje pompa-sonda z optycznymi źródłami lasera, przeprowadzono dogłębne badania nad fotosystemem II14,15, fotoaktywne żółte białko16,17, oksydaza cytochromu C18, a także bakteriorodopsyna19,20,21. Badania te dotyczyły dynamiki transferu elektronów, która zachodzi po aktywacji światła, wykazując znaczący potencjał krystalografii szeregowej w zrozumieniu czasowo-rozdzielczych procesów biologicznych.
Rozwój krystalografii szeregowej staje się również coraz bardziej powszechny w źródłach synchrotronowych9,12,20,22,23,24. Synchrotron SX pozwala na efektywny pomiar dużej liczby pojedynczych kryształów w temperaturze pokojowej przy użyciu odpowiedniego systemu wtryskiwaczy. Takie podejście jest odpowiednie dla mniejszych kryształów, dlatego oprócz wymagania detektora o dużej liczbie klatek na sekundę do zbierania danych, wymagana jest również wiązka mikroogniskowa. W porównaniu z konwencjonalną krystalografią, SX nie polega na montowaniu i ustawianiu poszczególnych kryształów w wiązce promieniowania rentgenowskiego. Ponieważ dane z dużej liczby pojedynczych kryształów są łączone, dawka promieniowania otrzymywana przez każdy kryształ może być znacznie zmniejszona w porównaniu z konwencjonalną krystalografią. Synchrotron SX może być również stosowany do badania reakcji rozdzielczych w czasie, nawet z dokładnością do milisekund, pod warunkiem, że dostępny jest detektor o wystarczająco wysokiej częstotliwości odświeżania (np. 100 Hz lub więcej). W synchrotronie przeprowadzono kilka eksperymentów krystalografii seryjnej przy użyciu wstrzykiwaczy, które początkowo zostały opracowane w źródłach XFEL20,22,23. Dwa najpopularniejsze typy wtryskiwaczy to wirtualna dysza dynamiczna gazu (GDVN)25 i wtryskiwacz o wysokiej lepkości (HVI)9,24,26,27,28. GRVN idealnie nadaje się do wstrzykiwania ciekłych próbek o niskiej lepkości, ale wymaga dużych natężeń przepływu w celu uzyskania stabilnych strumieni, co z kolei prowadzi do wysokiego zużycia próbek. Z kolei HVI nadają się do próbek o wysokiej lepkości, co pozwala na generowanie stabilnego strumienia przy znacznie niższych natężeniach przepływu, co prowadzi do znacznie niższego zużycia próbki. W związku z tym wtryskiwacz HVI sprzyja dostarczaniu próbek, w których preferowany jest lepki nośnik (np. na bazie lipidów dla białek błonowych) i/lub nie są dostępne duże ilości próbki. Wtryskiwacze SX są na ogół trudne w użyciu i wymagają intensywnego szkolenia w obsłudze. Wiążą się one również z długimi protokołami przenoszenia próbek, ponieważ próbka musi zostać załadowana do specjalistycznego zbiornika, co zazwyczaj wiąże się z wysokim ryzykiem utraty próbki w "martwej objętości" lub w wyniku nieszczelności połączeń. Dlatego pożądane jest zoptymalizowanie konstrukcji wtryskiwacza w celu złagodzenia wszelkich strat przed dotarciem próbki do wiązki promieniowania rentgenowskiego.
Niedawno, pierwsze wyniki SX zostały opublikowane za pomocą Lipidico23 z celem lizozymu, przy użyciu detektora Eiger 16M. Taka konstrukcja wtryskiwacza ogranicza marnotrawstwo próbki, minimalizując liczbę etapów związanych z przejściem od początkowej krystalizacji do przeniesienia kryształów do wtryskiwacza, a następnie dostarczenia próbki do wiązki promieniowania rentgenowskiego. Niniejszy manuskrypt opisuje i demonstruje procedurę przenoszenia próbki, począwszy od przygotowania próbki, przechodząc do procesu wstrzykiwania, a na końcu zbierania danych przy użyciu tego samego naczynia krystalizacyjnego. Opisana jest również praca wtryskiwacza.

<table><tbody><tr><td>Lizozym białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Służy do hodowli kryształów do testowania wtryskiwacza, a kryształy są przenoszone do smaru silikonowego. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Wysokopróżniowy smar silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td>Służy do testowania wtryskiwacza. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Igła wtryskiwacza (108 &mikro; m ID)</td><td>Hamilton</td><td>nr części: 7803-05</td><td>www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Szklane strzykawki gazoszczelne, 100 i mikro; l</td><td>Hamilton</td><td>nr części: 7656-01</td><td>Strzykawki używane do wstrzykiwania próbki. www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Łącznik strzykawki LCP</td><td>Formulatrix</td><td>209526</td><td>Łącznik strzykawkowy do mieszania próbek</td></tr><tr><td>Wtryskiwacz lipidico</td><td>La Trobe Univerity/ANSTO</td><td></td><td>Jest to specyficzny element wyposażenia, do którego można uzyskać dostęp za pośrednictwem Uniwersytetu La Trobe / ANSTO Australijskiego Ośrodka Synchrotronowego</td></tr></tbody></table>

protokół iniekcji lipidico do pomiarów krystalografii seryjnej w australijskim synchrotronie

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

W australijskim synchrotronie stworzono urządzenie do wykonywania pomiarów krystalografii szeregowej. Obiekt ten wyposażony jest w specjalnie skonstruowany wtryskiwacz o wysokiej lepkości, Lipidico, jako część linii badawczej krystalografii makromolekularnej (MX2) do pomiaru dużej liczby małych kryształów w temperaturze pokojowej. Celem tej techniki jest umożliwienie hodowli/przeniesienia kryształów do szklanych strzykawek, które mają być używane bezpośrednio w wtryskiwaczu do seryjnego zbierania danych krystalograficznych. Do zalet tego wtryskiwacza należy możliwość szybkiego reagowania na zmiany natężenia przepływu bez przerywania strumienia. Istnieje kilka ograniczeń dla tego wtryskiwacza o wysokiej lepkości (HVI), w tym ograniczenie dozwolonej lepkości próbki do >10 Pa.s. Stabilność strumienia może również stanowić problem w zależności od konkretnych właściwości próbki. Szczegółowy protokół konfiguracji próbek i obsługi wtryskiwacza do pomiarów krystalografii szeregowej w australijskim synchrotronie znajduje się tutaj. Metoda demonstruje przygotowanie próbki, w tym przeniesienie kryształów lizozymu do podłoża o wysokiej lepkości (smar silikonowy) oraz działanie wtryskiwacza w celu zbierania danych w MX2.

Lipidico to HVI zaprojektowany jako alternatywny system dostarczania do zastosowania w MX2 (Rysunek 1). Jest on idealnie dopasowany do SX, w których kryształy są hodowane w lipidowej fazie kubicznej lub przeniesione do wysokolepkiego medium obojętnego.
Aby zademonstrować zastosowanie inżektora, do zebrania danych SX na linii wiązki MX2 w australijskim synchrotronie wykorzystano smar silikonowy zmieszany z kryształami lizozymu. Aby zamontować inżektor na linii MX2,...

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przygotować próbki krystalografii seryjnej do zbierania danych na wtryskiwaczu o wysokiej lepkości, Lipidico, niedawno uruchomionym w australijskim synchrotronie.

Protokół iniekcji lipidico do pomiarów krystalografii seryjnej w australijskim synchrotronie

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Protokół ten daje naukowcom możliwość scharakteryzowania kryształów białkowych osadzonych w materiałach o wysokiej lepkości, a także innych miękkich materiałów, które są obecnie trudne do scharakteryzowania przy użyciu istniejących układów. Za pomocą tej metody próbki są przygotowywane w szklanych strzykawkach, montowanych bezpośrednio na wtryskiwaczu, dzięki czemu system wtryskiwaczy jest łatwy w użyciu i minimalizuje ilość odpadów próbki. Aby przygotować kryształy w ośrodku o wysokiej lepkości, najpierw odwiruj roztwór kryształów z niską prędkością, aby utworzyć miękką krystaliczną osadkę.Po usunięciu nadmiaru pożywki przymocować łącznik do końca jednej szklanej strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów i załadować 28 mikrolitrów roztworu krystalicznego do cylindra strzykawki. Powoli włożyć tłok do górnej części strzykawki i delikatnie wepchnąć roztwór do końca końcówki łącznika. Aby usunąć pęcherzyki, należy użyć palca w rękawiczce, aby bardzo delikatnie docisnąć górną część stępionego punktu igły łącznika, aby utworzyć uszczelnienie i cofnąć tłok, aby odciągnąć roztwór od końcówki igły, aby wytworzyć nagromadzenie ciśnienia w strzykawce, a następnie usunąć palec, aby szybko zwolnić ciśnienie i rozbić wszelkie pęcherzyki wewnątrz strzykawki.Alternatywnie, należy trzymać strzykawkę w jednej ręce, z igłą skierowaną do góry i tłokiem zaklinowanym między dwoma palcami i szybko obrócić ramię trzymające strzykawkę w jednym kierunku dwa do trzech razy. Powstała siła odśrodkowa wypchnie pęcherzyki powietrza ze strzykawki. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy za pomocą cienkiej szpatułki dodać 42 mikrolitry wysokopróżniowego smaru silikonowego bezpośrednio na wierzch drugiej strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów i wcisnąć tłok do samego końca, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i upewnić się, że na końcu strzykawki nie ma szczeliny powietrznej.Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z obu strzykawek, trzymając obie strzykawki za końce, połączyć strzykawki ze złączką. Aby wymieszać ze sobą próbki, delikatnie wciśnij kolejno zarówno roztwór krystaliczny, jak i tłoki strzykawki ze smarem silikonowym od 50 do 100 razy, aż materiały dokładnie się wymieszają i będą wydawać się jednorodne. Następnie wizualizuj kryształy pod mikroskopem optycznym.Aby określić stężenie kryształów w smarze silikonowym, policz liczbę kryształów w określonym obszarze za pomocą obrazów z mikroskopu optycznego. Aby zmniejszyć stężenie kryształów, powtórz przygotowanie kryształów przy użyciu większej objętości smaru silikonowego lub rozcieńcz kryształ w buforze krystalizacyjnym przed ustawieniem strzykawki. Aby zwiększyć stężenie kryształów, powtórz przygotowanie kryształów przy użyciu mniejszej objętości smaru silikonowego, uważając, aby nie zmniejszyć lepkości poniżej 10 sekund paskalowych.Po uzyskaniu odpowiedniego stężenia kryształów należy przenieść całą próbkę do jednej strzykawki i zastąpić łącznik igłą iniekcyjną o średnicy wewnętrznej 108 mikronów, bardzo mocno wkręconą w podstawę strzykawki. Aby skonfigurować wtryskiwacz, wybierz narzędzia i tryb bazowania oraz ujemny wyłącznik krańcowy, a następnie rozpocznij bazowanie i pozwól oprogramowaniu działać, aż śruba zostanie cofnięta na tyle, aby strzykawka o pojemności 100 mikrolitrów zmieściła się pod śrubą. Wprowadzić igłę pustej strzykawki przez szczelinę w uchwycie strzykawki, aby zamontować strzykawkę na wstrzykiwaczu i przyłożyć strzykawkę do wspornika.Owinąć jeden O-ring w poprzek środkowej części strzykawki, mocując pierścień do haczyków po obu stronach strzykawki i owinąć drugi O-ring wokół haczyków w górnej części strzykawki. Upewnij się, że jedna część drugiego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym jest umieszczona na górze szklanej strzykawki. Aby przygotować strzykawkę z próbką, należy ją zalać, umieścić nasadkę wtryskiwacza na głowicy tłoka strzykawki z próbką i załadować strzykawkę do wstrzykiwacza.Przesuń napędową do górnej części nasadki. W oprogramowaniu sterującym wtryskiwaczem wybierz tryb prędkości i aktywuj tryb prędkości. Ustaw wartość ustawienia na 3 000 obrotów na minutę i kliknij zastosuj wartość ustawienia.Gdy śruba zbliża się do nasadki na głowicy tłoka strzykawki, zmień wartość ustawienia na zero. Po nawiązaniu kontaktu kliknij przycisk Zastosuj wartość ustawienia, aby aktywować ustawioną wartość, natychmiast zatrzymując. Następnie delikatnie poruszaj nasadką, aby upewnić się, że jest mocno trzymana na miejscu.Aby uruchomić wtryskiwacz, zmień wartość ustawienia na 100 obrotów na minutę i sprawdź wzrokowo końcówkę, aby obserwować próbkę, gdy zaczyna się wytłaczać. Po zamknięciu budki zmniejszaj wartość ustawienia o 10, aż do zaobserwowania powolnego, ale stabilnego strumienia materiału. Jeśli strumień próbki nie przepływa prawidłowo, zwiększaj wartość ustawienia w krokach co 10 obrotów na minutę, aż strumień stanie się prostszy.Jeśli strumień nie ustabilizuje się, umieść polistyrenowy łapacz próbki pod strumieniem próbki, aby ułatwić prowadzenie próbki. Alternatywnie można włożyć lejek ssący Venturiego do łapacza próbek, który można podłączyć do rurki wylotowej powietrza znajdującej się w klatce australijskiego synchrotronu. Aby określić natężenie przepływu strumienia, należy skorzystać z kalkulatora przepływu urządzenia Lipidico.Określenie optymalnej prędkości przepływu próbki dla wtryskiwacza ma kluczowe znaczenie dla stabilności strumienia. Niskie natężenie przepływu powoduje rozszerzanie się smaru silikonowego wytłaczanego z wtryskiwacza, podczas gdy większe natężenie przepływu wytwarza cieńszy strumień. Regularnie obserwowano zwijanie się lepkiego strumienia mediów.Aby przezwyciężyć ten problem w silnie naładowanych próbkach, można użyć chwytacza polistyrenowego do wprowadzenia słabej siły elektrostatycznej. W niniejszej analizie użyto szklanej strzykawki zawierającej 26 mikrolitrów kryształów lizozymu zawieszonych w smarze silikonowym. W ciągu 38 minut zebrano wystarczającą ilość danych, co umożliwiło wygenerowanie mapy gęstości elektronów otaczającej wiązania dwusiarczkowe w strukturze lizozymu.Należy pamiętać, aby użyć małej objętości próbki na szkiełku podstawowym do oceny stężenia kryształów w próbce w celu określenia, czy należy skorygować lepkość. Wszechstronność wtryskiwacza pozwala na charakteryzację rentgenowską innych materiałów o wysokiej lepkości. Na przykład struktury cieczy jonowej wykorzystujące badania baterii lub materiały koloidalne wykorzystujące produkty mleczne.

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Powodzenie eksperymentu z seryjną krystalografią femtosekundową z rozdzielczością czasową zależy od efektywnego dostarczania próbki. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizujące wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny z wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Metodologia opiera się na homogenizacji próbki za pomocą nowatorskiego łącznika trójdrożnego i wizualizacji za pomocą szybkiej kamery.

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Poznaj metodę przygotowania kryształów białkowych w lepkich mediach za pomocą wysokolepkiego iniekora Lipidico w australijskim synchrotronie. Protokół minimalizuje stratę próbek i usprawnia zbieranie danych krystalograficznych.

Protokół iniekcji lipidico do pomiarów krystalografii seryjnej w australijskim synchrotronie

Przeglądaj więcej filmów