Name: Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu w modelu 3D organ-on-a-chip z wykorzystaniem tomografii konfokalnej i uczenia maszynowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Steeg Lab w National Cancer Institute za hojną darowiznę komórek MDA-MB-231-BR-GFP. Mikroskopię konfokalną przeprowadzono w Instytucie Biointerfejsów Uniwersytetu Michigan (BI). Cytometrię przepływową przeprowadzono w University of Michigan Flow Cytometry Core. Wektory wirusowe zostały stworzone przez University of Michigan Vector Core. Dziękujemy również Kelley Kidwell za wskazówki w analizie statystycznej tych danych.
FINANSOWANIE:
C.R.O. był częściowo wspierany przez NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) i 1R21CA245597-01. T.M.W. był częściowo wspierany przez 1R21CA245597-01 i National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health w ramach Nagrody Numer UL1TR002240. Finansowanie materiałów i charakterystyki zostało zapewnione przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody o numerze 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation oraz Breast Cancer Research Foundation. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health

<ol><li>Rastogi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palliation+of+Brain+Metastases%3A+Analysis+of+Prognostic+Factors+Affecting+Overall+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Palliative+Care%22%5BJournal%5D)">Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival.</a> Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinicopathological+features+and+survival+outcomes+of+patients+with+different+metastatic+sites+in+stage+IV+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).</li>
<li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37 (2), 208-215 (2005).</li>
<li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2Finvasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li>
<li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415(2009).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boyden+chamber+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Boyden chamber assay.</a> Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Poissonnier, A., Legembre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boyden+Chamber+Assay+to+Study+of+Cell+Migration+Induced+by+Metalloprotease+Cleaved-CD95L%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L.</a> Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).</li>
<li>Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CELLCOUNTER%3A+novel+open-source+software+for+counting+cell+migration+and+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro.</a> BioMed Research International. 2014, 863564(2014).</li>
<li>Little, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4%2FIL-13+Stimulated+Macrophages+Enhance+Breast+Cancer+Invasion+Via+Rho-GTPase+Regulation+of+Synergistic+VEGF%2FCCL-18+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling.</a> Frontiers in Oncology. 9, 456(2019).</li>
<li>Allen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Enhance+Migration+in+Inflammatory+Breast+Cancer+Cells+via+RhoC+GTPase+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling.</a> Scientific Reports. 6, 39190(2016).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Migration+Chip+for+Chemotaxis-based+Microfluidic+Selection+of+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations.</a> Scientific Reports. 5, 9980(2015).</li>
<li>Choi, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblast+promote+transmigration+through+endothelial+brain+cells+in+three-dimensional+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models.</a> International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell%2Fastrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+W+%22The+Visualization+Toolkit.+4th+edn%22">The Visualization Toolkit. 4th edn</a>. , Kitware. (2006).</li>
<li>Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+segmentation+of+MRI+data%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Adaptive segmentation of MRI data.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).</li>
<li>Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiological+assessment+of+the+Indian+children+with+congenital+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss.</a> International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759(2014).</li>
<li>Mansfield, P., Maudsley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+imaging+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Medical imaging by NMR.</a> The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).</li>
<li>Plewes, D. B., Kucharczyk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics+of+MRI%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Physics of MRI: a primer.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).</li>
<li>Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-Printed+Models+for+Surgical+Planning+in+Complex+Congenital+Heart+Diseases%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 23(2019).</li>
<li>Thibault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+for+surgical+planning+in+patients+with+breast+cancer+who+undergo+preoperative+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy.</a> American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).</li>
<li>Oliver, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+artificial+intelligence+based+identification+of+the+extravasation+potential+of+cancer+cells+into+the+brain+metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytic+S1P3+signaling+modulates+the+blood-tumor+barrier+in+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases.</a> Nature Communications. 9 (1), 2705(2018).</li>
<li>Badilescu, S., Packirisamy, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBadilescu%2C+S+%22BioMEMS%3A+Science+And+Engineering+Perspectives%22">BioMEMS: Science And Engineering Perspectives</a>. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+C+%22Foundations+of+MEMS.+2nd+edn%22">Foundations of MEMS. 2nd edn</a>. , Prentice Hall. (2012).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28muBBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB).</a> Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).</li>
<li>Lockman, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+blood-tumor+barrier+permeability+determines+drug+efficacy+in+experimental+brain+metastases+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).</li>
<li>Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyan+Oliver%2C+C+%22Zenodo%22">Zenodo</a>. , Version 0.8, 3825719 (2020).</li>
<li>Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+the+Marching+Cubes+Algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer+Graphics+and+Applications%22%5BJournal%5D)">History of the Marching Cubes Algorithm.</a> IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).</li>
<li>Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinbaum%2C+DG+%22Applied+regression+analysis+and+other+multivariable+methods%22">Applied regression analysis and other multivariable methods</a>. , Duxbury Press. (1978).</li>
<li>Berg, M. d <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+Md+%22Computational+geometry+%3A+algorithms+and+applications%2C+2nd+rev.+edn%22">Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn</a>. , Springer. (2000).</li>
<li>Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+in+vitro+endothelial+linings+grown+within+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).</li>
<li>Brinkley, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+cell+form+and+cytoskeleton+in+human+breast+carcinoma+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro.</a> Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+Central+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33(2013).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+Central+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Dello Russo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microglial+HMC3+cell+line%3A+where+do+we+stand%3F+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259(2018).</li>
<li>Dun, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteotranscriptomic+Profiling+of+231-BR+Breast+Cancer+Cells%3A+Identification+of+Potential+Biomarkers+and+Therapeutic+Targets+for+Brain+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).</li>
<li>Xing, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+promote+the+metastatic+growth+of+breast+cancer+stem-like+cells+by+activating+Notch+signalling+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).</li>
<li>Zhang, B., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip+devices+advance+to+market%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip devices advance to market.</a> Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).</li>
</ol>

Nie ma żadnych ujawnień do zadeklarowania.

Opracowaliśmy i zaprezentowaliśmy nową metodę, która adaptuje narzędzia często wykorzystywane w analizach obrazowania klinicznego do pomiaru wynaczynienia i migracji komórek nowotworowych przez barierę śródbłonkową do tkanki mózgowej. Uważamy, że takie podejście może być przydatne zarówno w przypadku pomiarów in vivo, jak i in vitro; Pokazaliśmy jego zastosowanie w systemie mikroprzepływowym 3D rekapitulującym unaczynienie mózgu. Pomiary komórek rakowych, w tym odległość wynaczyniona, procent wynaczynionych objętości, sf...

Przerzuty do mózgu są najbardziej śmiertelnymi zmianami nowotworowymi; 10-30% wszystkich nowotworów daje przerzuty do mózgu, z medianą przeżycia wynoszącą tylko ~5-20 miesięcy, w zależności od typu nowotworu1,2. Głównym pytaniem, które pojawia się podczas badania przerzutów raka, jest to, w jaki sposób subklony migrują ze środowiska humoralnego krwiobiegu do narządu takiego jak mózg3,4. To pytanie doprowadziło do powstania wielu wariantów testów migracji, inwazji i wynaczynienia. Wszystkie te metody mają wspólny krytyczny etap, jakim jest zliczanie lub mierzenie właściwości komórek, które przemieszczają się z jednego miejsca do drugiego w odpowiedzi na bodziec. Większość łatwo dostępnych testów migracji jest wykorzystywana do badania dwuwymiarowej (2D) migracji komórek nowotworowych. Wyjaśniły one bogactwo wiedzy; Nie podsumowują one jednak trójwymiarowej natury systemu in vivo, którą mogą zapewnić inne metody<klasa SUP="xref">5. W związku z tym konieczne jest badanie mikrośrodowiska nowotworu (TME) w systemach trójwymiarowych (3D), ale dostępne podejścia analityczne dla struktur 3D są ograniczone i często niespójne.
Jednym z najpopularniejszych narzędzi 3D jest komora Boydena, która składa się z membrany zawieszonej na dnie studni, oddzielającej dwa odrębne obszary. Boyden przedstawił test do badania chemotaksji leukocytów4. Dolne obszary mogą być zróżnicowane w zależności od chemii lub w inny sposób6,7, aby skłonić komórki w górnym obszarze do migracji do dolnego obszaru. Najczęstszym podejściem do ilościowego określania liczby komórek, które migrowały, jest uwolnienie komórek z dna błony za pomocą roztworu buforowego, ich liza, a następnie policzenie na podstawie ilości zawartości DNA w roztworze7. To pośrednie podejście jest podatne na błędy operatora ze względu na zmienność techniki, a procedura niszczy informacje o fenotypie raka i mikrośrodowisku. Warianty testu z komorą Boydena polegają na utrwaleniu komórek migrujących, które pozostają na błonie, ale zapewniają tylko liczbę komórek, które nie są już zdolne do kontynuowania badania6,8,9.
Ze względu na ograniczenia komory Boydena i rozwój innowacji w społeczności mikroprzepływowej, opracowano chipy do testowania migracji, które obserwują ruch komórek w odpowiedzi na bodziec w jednym kierunku, a nie w trzech10,11,12. Te testy migracji ułatwiają kontrolę nad takimi czynnikami, jak przepływ lub separacja pojedynczych komórek13,14, które umożliwiają lepszą interpretację wyników; jednak ich format 2D nieuchronnie traci część dynamicznych informacji. Ostatnie badania koncentrowały się na wynaczynieniu (tj. przemieszczaniu się komórek z krążenia do tkanki, takiej jak bariera krew-mózg) w środowisku 3D14,15. Odległość wynaczynienia w tkance i zachowanie sondujące, które zachodzi na barierze/błonie komórkowej, jest bardziej wyrafinowane niż pomiary zebrane przy użyciu komory Boydena lub urządzenia do migracji mikroprzepływowej 2D16. W związku z tym urządzenia, które umożliwiają odpowiednie obrazowanie i analizę wynaczynienia 3D, mają kluczowe znaczenie dla uchwycenia tych wyrafinowanych pomiarów, ale brakuje ich w literaturze.
Niezależnie od testów migracji, opracowano solidne techniki obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i tomografii, które są w stanie zidentyfikować i dokładnie zrekonstruować tkankę w przestrzeni 3D17,18. Techniki te polegają na pozyskiwaniu obrazów w stosach z i segmentowaniu części obrazu na podstawie właściwości tkanki, a następnie przekształcaniu podzielonych na segmenty obrazów w trójwymiarowe siatki19,20,21. Dzięki temu lekarze mogą wizualizować w 3D poszczególne narządy, kości i naczynia, aby pomóc w planowaniu chirurgicznym lub diagnozowaniu raka lub choroby serca22,23. Tutaj pokażemy, że podejścia te można dostosować do stosowania na próbkach mikroskopowych i urządzeniach do wynaczynienia 3D.
W tym celu opracowaliśmy innowacyjną technikę tomografii konfokalnej, przedstawioną tutaj, która zapewnia elastyczność w badaniu wynaczynienia komórek nowotworowych przez błonę poprzez adaptację istniejących narzędzi tomografii. Takie podejście umożliwia badanie pełnej gamy zachowań komórek nowotworowych podczas interakcji z barierą komórkową, taką jak warstwa komórek śródbłonka. Komórki rakowe wykazują zachowania sondujące; Niektóre mogą zaatakować, ale pozostają blisko błony, podczas gdy inne łatwo przechodzą przez barierę. Ta technika jest w stanie dostarczyć informacji o fenotypie komórki we wszystkich wymiarach24. Zastosowanie tego podejścia do badania TME jest zarówno stosunkowo niedrogie, łatwe w interpretacji, jak i powtarzalne w porównaniu z bardziej złożonymi modelami mysimi in vivo. Przedstawiona metodologia powinna stanowić solidną podstawę do badania wielu typów nowotworów i mikrośrodowisk poprzez adaptację obszaru zrębu.
Opisujemy i demonstrujemy użycie platformy 3D mikroprzepływowej niszy krew-mózg (μmBBN) (<silna klasa="xfig">Rycina 1), gdzie krytyczne elementy bariery i niszy (komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu i astrocyty) mogą być hodowane przez dłuższy okres (około do 9 dni), obrazowane fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej, a obrazy rekonstruowane za pomocą naszej techniki tomografii konfokalnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2); Wszystkie miały na celu zrozumienie rozwoju mikroprzerzutów i zmian w mikrośrodowisku guza w sposób powtarzalny i ilościowy. Interfejs bariery krew-mózg z niszą mózgową składa się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, które są wzmocnione przez błonę podstawną, stopy astrocytów i perycyty25. Wybiórczo skupiliśmy się na składnikach astrocytów i śródbłonka, biorąc pod uwagę ich znaczenie w tworzeniu i regulacji bariery krew-mózg. Pokazujemy, jak wytwarzać, wysiewać, obrazować i analizować komórki rakowe oraz składniki komórkowe i humoralne mikrośrodowiska nowotworowego za pomocą tej platformy. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać uczenie maszynowe do identyfikacji wewnętrznych różnic fenotypowych komórek nowotworowych, które są zdolne do przejścia przez model μmBBN i przypisania im obiektywnego wskaźnika potencjału przerzutowego do mózgu24. Zbiory danych wygenerowane tą metodą mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na podstawowe i translacyjne pytania dotyczące przerzutów, strategii terapeutycznych i roli TME w obu.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA z czerwienią fenolową</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 1,5 mm z tłokiem</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 150 mm</td><td>Fisher Scientific FB0875714</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS, bez Ca i Mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety 200uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>4-calowy wafel</td><td>krzemowy University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Taśma pakowa o szerokości 48 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-072-097</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane 50 x 75 mm</td> Mikroskop konfokalny <td>Fisher Scientific</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>A1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9-20</td><td></td></tr><tr><td>antybiotyk/antybiotyk (penicylina/streptomycyna/amfoterycyna)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>nóż do pudełek</td><td></td> Nożyczki do cięcia NC1721575 <td></td><td>Fisher</td></tr><tr><td></td><td>Scientific Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z 4,5 g/L glukozy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>taśma dwustronna</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie</td><td>Oprogramowanie Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>Szklana</td> fiolka ImageJ <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D</td><td></td></tr><tr><td>glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>hCMEC/D3</td><td>EMD Millipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Notebook Jupyter</td><td>Anaconda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel - czynnik wzrostu zredukowany czerwienią fenolową</td><td>Corning</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231-BR-GFP</td><td>Dr Patricia Steeg, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suplement wzrostu N-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>normalnych ludzkich astrocytów (NHA)</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Orange</td><td>Uniwersytet w Lublanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Maski fotolitograficzne</td><td>Photosciences Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7-dsRed</td><td>University of Michigan Vector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EV-GFP</td><td>University of Michigan Vector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLOX-TERT-iresTK</td><td>Addgene</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr> membrana <tr><td>poliwęglanowa, wielkość porów 5um</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>PureCol, 3 mg/ml</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005</td> Wodorowęglan sodu <td>kolagen bydlęcy typu I</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Kubek Solo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1416545</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2075</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8 deweloper</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesive Company</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179965-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tricholoro perfluoro oktylosilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3d organ-on-a chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Przerzuty do mózgu są najbardziej śmiertelnymi zmianami nowotworowymi; 10-30% wszystkich nowotworów daje przerzuty do mózgu, a mediana przeżycia wynosi tylko ~5-20 miesięcy, w zależności od typu nowotworu. Aby zmniejszyć obciążenie guzem z przerzutami do mózgu, należy wypełnić luki w wiedzy podstawowej i translacyjnej. Do głównych wyzwań należy niedostatek powtarzalnych modeli przedklinicznych i związanych z nimi narzędzi. Trójwymiarowe modele przerzutów do mózgu mogą dostarczyć odpowiednich danych molekularnych i fenotypowych wykorzystywanych do zaspokojenia tych potrzeb w połączeniu z dedykowanymi narzędziami analitycznymi. Co więcej, w porównaniu z modelami mysimi, modele narządów na chipie komórek nowotworowych pacjenta przechodzących przez barierę krew-mózg do mikrośrodowiska mózgu generują wyniki szybko i są łatwiejsze do interpretacji za pomocą metod ilościowych, dzięki czemu są podatne na testy o wysokiej przepustowości. Tutaj opisujemy i demonstrujemy zastosowanie nowatorskiej platformy 3D mikroprzepływowej niszy krew-mózg (μmBBN), na której wiele elementów niszy może być hodowanych przez dłuższy czas (kilka dni), obrazowanych fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej, a obrazy rekonstruowane przy użyciu innowacyjnej techniki tomografii konfokalnej; wszystkie miały na celu zrozumienie rozwoju mikroprzerzutów i zmian w mikrośrodowisku guza (TME) w sposób powtarzalny i ilościowy. Pokazujemy, jak za pomocą tej platformy wytwarzać, wysiewać, obrazować i analizować komórki nowotworowe oraz komponenty komórkowe i humoralne TME. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób sztuczna inteligencja (AI) jest wykorzystywana do identyfikacji wewnętrznych różnic fenotypowych komórek nowotworowych, które są zdolne do przejścia przez model μmBBN i przypisywania im obiektywnego wskaźnika potencjału przerzutowego do mózgu. Zbiory danych wygenerowane tą metodą mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na podstawowe i translacyjne pytania dotyczące przerzutów, skuteczności strategii terapeutycznych oraz roli TME w obu tych obszarach.

Wykorzystując tę technikę, przeanalizowano typy komórek znakowanych różnymi białkami fluorescencyjnymi lub barwnikami. Prezentujemy zastosowanie tego podejścia z użyciem chipa µmBBN sformułowanego z hCMEC/D3-DsRed i niefluorescencyjnych astrocytów. Komórki śródbłonka mikrokrążenia mózgowego wysiano na porowatą membranę (pory trawione ścieżkowo o rozmiarze 5 µm) i umieszczono w inkubatorze34 w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Po trzech dniach potwierdzono konfluencję warstwy śródbłonka za...

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i hodowli mikrośrodowiska przerzutowego guza bariery krew-mózg, a następnie ilościowego określenia jego stanu za pomocą obrazowania konfokalnego i sztucznej inteligencji (uczenia maszynowego).

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

Tomografia konfokalna została opracowana w celu uzyskania pełnej gamy zachowań komórek nowotworowych, ponieważ oddziałują one z barierą komórkową i niszą. Metoda ta stanowi podstawę do badania przerzutów w miarę ich występowania. Takie podejście jest przydatne do ilościowego określania zachowania żywych komórek.Tomografia konfokalna w połączeniu z uczeniem maszynowym jest przydatna w przypadku różnych platform narządów na chipie. Analiza pierwotnego lub nawrotowego guza lub krążących komórek nowotworowych może stanowić ważne narzędzie diagnostyczne do przewidywania przerzutów do mózgu i odróżniania komórek przerzutowych do mózgu od komórek bez przerzutów do mózgu. Aby zmontować mikroprzepływowe urządzenie BBN, należy przenieść urządzenie z eksykatora próżniowego na odpowiednią powierzchnię z wlotami skierowanymi w dół i umieścić cały zestaw w komorze plazmowej.Umieść cały zestaw w komorze plazmowej i pociągnij próżnię, a następnie potraktuj urządzenie plazmą przez 30 sekund o mocy 80 watów. Pod koniec zabiegu użyj prowadnicy, aby szybko umieścić urządzenie stroną wlotową do góry na szklanym szkiełku na stole laboratoryjnym, aby stworzyć trwałe połączenie między PDM urządzenia a szkiełkiem. Następnie włóż końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, przetnij dwa milimetry od końcówki na wszystkie wloty i wyloty i umieść urządzenie w komorze plazmowej na ośmiominutową obróbkę plazmową o mocy 200 W.Po ostygnięciu urządzenia umieść je w sterylnym pojemniku wtórnym i w ciągu 15 minut od leczenia plazmidem przenieś 120 mikrolitrów roztworu astrocytów kolagenowych do urządzenia przez końcówkę pipety do dolnej komory. Poczekaj, aż roztwór przepłynie przez komorę do przeciwległej końcówki pipety i napełnij następny kanał urządzenia. Po napełnieniu wszystkich czterech kanałów urządzenia umieść chip w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę.Gdy kolagen stwardnieje, przełóż wszystkie końcówki pipet zasilające dolną komorę odpowiednią kompletną pożywką do hodowli komórkowych i pokryj górną komorę matrycą o obniżonym 2% czynniku wzrostu, w kompletnym podłożu śródbłonkowym. Po zakodowaniu obu komór należy umieścić urządzenie w inkubatorze na godzinę przed przepłukaniem górnej komory odpowiednim medium. Naprzemienne końcówki, patrz 30 mikrolitrów od jednej do 10 do szóstej komórki śródbłonka na mililitr odpowiedniej pożywki, przez końcówki do górnej komory co 15 minut, w sumie cztery porcje komórek na końcówkę.Inkubuj urządzenie między siewami. Gdy wszystkie komórki śródbłonka zostaną wysiane, wypełnij wszystkie końcówki pożywką i włóż urządzenie z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 48 godzin. Gdy warstwa śródbłonka dojrzeje, wymień pożywkę w chipie, aby uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowej i zasiej każdy kanał górnej komory 30 mikrolitrami od jednego razy 10 do sześciu komórek rakowych na mililitr odpowiedniej pożywki.Po wysianiu każdej 30 mikrolitrowej porcji komórek, należy umieścić urządzenie z powrotem w inkubatorze na 15 minut, a następnie napełnić wszystkie końcówki odpowiednią pożywką i umieścić urządzenie z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 48 godzin. Po wyhodowaniu i zobrazowaniu urządzenia, aby zmierzyć fenotyp komórek rakowych, otwórz dostarczone oprogramowanie i wczytaj obraz konfokalny do pamięci. Oprogramowanie zapisze każdy kanał koloru z obrazu konfokalnego 3D w osobnym pliku TIFF.Wybierz opcję Zmień wartości krycia dla każdego kanału mikroskopu" i dostosuj wartość alfa kanału dla kanałów kolorów obecnych na obrazie, tak aby tło zostało usunięte i pozostały tylko fluorescencje w komórkach. Aby zobrazować efekt, wybierz opcję Wyświetl renderowanie 3D, aby sprawdzić, czy próg jest ustawiony prawidłowo, a jeśli obraz wygląda poprawnie, zapisz wartości krycia w arkuszu kalkulacyjnym śledzenia eksperymentu. Następnie użyj sześcianów marszowych, aby przekonwertować obraz woluminu na pojedyncze trójkątne obiekty 3D z siatką zapisaną w formacie danych VTK.Aby dopasować płaszczyznę do bariery śródbłonka, najpierw zlokalizuj centroidy komórek. Użyj filtru połączeń polydata, aby iterować po liście siatek w pliku VTK w celu wyodrębnienia regionów, które nie są połączone. Oblicz środek ciężkości każdej siatki i dodaj pomiar do listy centroidów filtrujących siatki, które są zbyt duże lub zbyt małe.Aby dopasować płaszczyznę do listy centroidów dla komórek śródbłonka, użyj metody minimalizacji błędu, uruchom polecenie Wizualizuj centroidy RFP i dopasowanie płaszczyzny, aby wygenerować i wykreślić dopasowanie płaszczyzny oraz sprawdzić dopasowanie płaszczyzny, dostosowując dopasowanie ręcznie w razie potrzeby. Gdy samolot zostanie prawidłowo dopasowany, zapisz normalną płaszczyzny w pliku śledzenia eksperymentu. Aby zmierzyć każdy fenotyp komórek rakowych po scharakteryzowaniu warstwy śródbłonka za pomocą płaszczyzny, załaduj funkcję analizy komórek i uruchom polecenie Przeczytaj informacje o monitorze eksperymentu i przeanalizuj istniejące kanały"aby iterować i analizować każdy region w pliku VTK.Dla każdego regionu funkcja przytnie każdą komórkę, tak aby obliczona została siatka poniżej membrany. Aby zmierzyć fenotyp komórkowy, oblicz kształt, objętość i położenie każdej komórki rakowej. Następnie zmierz objętość i położenie każdej przyciętej komórki rakowej, aby obliczyć procent komórek, które wynaczyniły się przez barierę śródbłonka.Po wykonaniu tych kroków dla kilku eksperymentów uruchom Eksportuj dane jako pojedynczy plik xlsx'aby zapisać dane w arkuszu kalkulacyjnym. Mikroprzepływowy chip BBN z zlewającą się barierą śródbłonkową jest dopuszczalny do eksperymentów, podczas gdy mikroprzepływowy chip BBN ze szczególnie słabym pokryciem śródbłonka nie jest. W tej reprezentatywnej analizie linia komórkowa raka poszukująca mózgu wykazuje subpopulację komórek, które wynaczyniają się przez barierę śródbłonka i migrują w głąb przestrzeni niszy mózgowej mikroprzepływowego chipa BBN Po dwóch i dziewięciu dniach od ekspozycji rodzicielskie komórki rakowe utrzymywały znaczną część komórek na szczycie bariery z dala od przestrzeni niszy mózgowej, podczas gdy populacja komórek rakowych z przerzutami do mózgu utrzymywała odsetek komórek, które były w ponad 100% wynaczynione.Morfologiczna kwantyfikacja kształtu komórki rakowej wykazała, że komórki rodzicielskie wykazywały mniej komórek o kulistym kształcie pierwszego dnia po wysiewie, podczas gdy po dwóch i dziewięciu dniach interakcji obie linie komórek rakowych miały tendencję do zmniejszania swojej kulistości. Ponadto subpopulacje komórek rakowych, które wynaczyniły się do niszy astricydowej, były mniejsze w porównaniu z komórkami rakowymi, które pozostawały w interakcji z barierą śródbłonkową bez wynaczynienia do mózgu. Linie komórkowe raka poszukujące mózgu i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów wykazują fenotypowy wzór w mikroprzepływowym chipie BBN, który można wykorzystać do rozróżnienia między przerzutowymi i nieprzerzutowymi komórkami rakowymi do mózgu za pomocą uczenia maszynowego.Samodzielna selekcja jest ważna. Komórki śródbłonka o wyższej, niskiej liczbie pasaży wykazywały zmienne zachowania barierowe. Ponadto komórki rakowe i ich ekspresja fluorescencyjna mogą zmieniać się w czasie.Po tej procedurze naukowcy mogą zastosować profilowanie molekularne domu sekretu lub komórek w urządzeniu w celu zbadania mechanizmów molekularnych przerzutów. Technika ta umożliwia badanie złożonych interakcji między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskami poprzez połączenie zmodyfikowanego mikrośrodowiska z ilościowym obrazowaniem komponentów niszowych w czasie.

quantifying-brain-metastatic-tumor-micro-environment-using-an-organ

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Ten film pokazuje rozwój systemu kokultury 3D. Wycinki mózgu myszy umieszcza się na błonie, a znakowane fluorescencyjnie ludzkie komórki guza mózgu mogą na niej rosnąć. Gdy system jest gotowy, jest barwiony do obrazowania.

Ustalenie guza mózgu w organotypowym modelu kokultury warstw

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Obecny protokół rozwija technikę opartą na obrazie do szybkiego, nieniszczącego i bezznacznikowego regionalnego pomiaru gęstości komórek i żywotności w agregatach 3D guza. Wyniki ujawniły gradient gęstości komórek, z większą gęstością komórek w regionach rdzenia niż w warstwach zewnętrznych w rozwijających się agregatach i głównie śmiercią komórek obwodowych w agregatach HER2+ leczonych trastuzumabem.

Nieniszcząca ocena regionalnej gęstości komórek w agregatach nowotworowych po leczeniu farmakologicznym

Przerzuty do mózgu są przyczyną ciężkiej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z rakiem. Większość mysich modeli przerzutów do mózgu jest skomplikowana przez przerzuty ogólnoustrojowe, mylące analizę śmiertelności i wyników interwencji terapeutycznej. Przedstawiono tutaj protokół wewnętrznego wstrzykiwania komórek rakowych do tętnicy szyjnej, który wytwarza spójne guzy wewnątrzczaszkowe z minimalnymi guzami ogólnoustrojowymi.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Stereotaktyczna technika wstrzyknięć wewnątrzczaszkowa umożliwia precyzyjne i lokalne wszczepienie komórek nowotworowych do kory myszy, czyniąc ją potężnym modelem do badania kolonizacji przerzutowej mózgu.

Modelowanie przerzutów mózgowych: standaryzowana analiza kolonizacji przerzutowej i wzorców wzrostu histologicznego za pomocą stereotaktycznego zastrzyku wewnątrzkorowego

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj metodę kwantyfikacji mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu w modelu 3D organ-on-a-chip z wykorzystaniem tomografii konfokalnej i uczenia maszynowego.

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów