Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Protokół pokazany w tym filmie po raz pierwszy łączy wykorzystanie chemicznego wymazywania epigenetycznego ze wskazówkami biomechanicznymi w celu wywołania i utrzymania pluripotencji w dorosłych terminalnie zróżnicowanych komórkach. Główną zaletą tego protokołu jest to, że nie wymaga wektorów transgenicznych ani wirusowych. Ponadto jest wytrzymały, wysoce powtarzalny i elastyczny.

Technika ta nie wymaga stosowania transfekcji genów, a zatem stanowi znaczący postęp technologiczny w medycynie translacyjnej i terapii komórkowej, wspierając jednocześnie długoterminową hodowlę komórek o wysokiej plastyczności. Procedurę zademonstrują Georgia Pennarossa, adiunkt i Teresina De Iorio, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od przygotowania świeżego jednomilimolowego roztworu podstawowego 5-aza-CR.

Zważ 2,44 miligrama 5-aza-CR i rozpuść go w 10 mililitrach DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Ponownie zawiesić proszek przez wirowanie i wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,22 mikrometra. Przygotować roztwór roboczy 5-aza-CR, rozcieńczając jeden mikrolitr roztworu podstawowego w jednym mililitrze pożywki hodowlanej fibroblastów.

Trypsynizować komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie i usuwać je delikatnym pipetowaniem. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i przenieść ją do stożkowej probówki. Policz komórki za pomocą komory liczącej pod mikroskopem optycznym.

Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 150 razy G przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, aby uzyskać 40 000 komórek w 30 mikrolitrach pożywki hodowlanej fibroblastów uzupełnionej jednomikromolowym 5-aza-CR. Napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego proszkiem PTFE, aby wytworzyć złoże i dozować 30 mikrolitrów komórek na złoże proszkowe.

Delikatnie obracaj szalkę Petriego ruchem okrężnym, aby upewnić się, że proszek PTFE całkowicie pokrywa powierzchnię kropli cieczy, tworząc mikrobioreaktor z ciekłego marmuru. Podnieś mikrobioreaktor z płynnego marmuru za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, która została przycięta tak, aby dopasować się do średnicy marmuru. Umieść mikrobioreaktor na czystej bakteriologicznej szalce Petriego, aby go ustabilizować.

Następnie przenieś mikrobioreaktor z szalki Petriego na 96-dołkową płytkę. Powoli dodawaj 100 mikrolitrów pożywki z brzegu studni. Mikrobioreaktor powinien unosić się na wierzchu pożywki.

Inkubuj mikrobioreaktor z płynnego marmuru przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji zbierz mikrobioreaktor z płynnego marmuru za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i umieść go na nowej 35-milimetrowej bakteriologicznej szalce Petriego. Użyj igły, aby przebić płynny marmur i rozbić go.

Odzyskaj uformowane sferoidy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów, która została przecięta na krawędzi pod mikroskopem stereoskopowym. Aby zmyć pozostałości 5-aza-CR, należy przenieść organoidy na szalkę Petriego zawierającą pożywkę ESC. Przygotować nową 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą łoże proszku PTFE i dozować pojedynczy organoid w 30-mikrolitrowej kropelce pożywki hodowlanej ESC na proszek za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Delikatnie obracaj naczynie ruchem okrężnym, aby utworzyć nowy mikrobioreaktor z płynnego marmuru i przenieś go do studzienki z 96-dołkową płytką. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki z brzegu studni, aby powoli kąpać marmur. Hoduj mikrobioreaktory z płynnego marmuru w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Z analiz morfologicznych wynika, że po 18-godzinnej inkubacji ze środkiem demetylującym 5-aza-CR fibroblasty trzech gatunków ssaków zamknięte w mikrobioreaktorach PTFE agregowały i tworzyły sferyczne struktury 3D o jednolitej geometrii wielkości. W warunkach 3D 86,31% otoczonych komórek znacznie zmodyfikowało swój fenotyp. W przeciwieństwie do tego, komórki post-5-aza-CR hodowane w standardowych warunkach 2D były znacznie mniejsze, z ziarnistymi jądrami i zachowywały rozkład jednowarstwowy.

Zmianom morfologicznym towarzyszył początek ekspresji genów związanych z pluripotencją, zarówno w komórkach 3D, jak i 2D post-5-aza-CR. Transkrypcję zaobserwowano dla homeoboksu pierwszego klasy piątej POU, homeoboxu NANOG, białka palca cynkowego ZFP42 i regionu determinującego płeć Ybox2, które są nieobecne w nieleczonych fibroblastach. Znaczącą regulację w górę cząsteczki adhezji komórek nabłonkowych translokacji 10-11 translokacji 2 i genów kadheryny 1 zaobserwowano również w komórkach 3D post-5-aza-CR w porównaniu z komórkami hodowanymi w standardowych plastikowych naczyniach 2D.

Równolegle wykryto regulację w dół specyficznego dla fibroblastów markera antygenu powierzchniowego komórek Thy1 zarówno w komórkach 3D, jak i 2D post-5-aza-CR. Znaczący spadek poziomu metylacji zarówno w komórkach post-5-aza-CR 3D, jak i 2D potwierdzono za pomocą testu ELISA. Poziomy metylacji DNA były znacznie niższe w komórkach 3D post-5-aza-CR w porównaniu z komórkami hodowanymi w warunkach 2D.

Co więcej, komórki 3D post-5-aza-CR zachowały nabytą sferyczną strukturę 3D, wysoki poziom ekspresji genów związanych z pluripotencją i niski poziom metylacji DNA przez 28 dni, w którym to momencie hodowla została zatrzymana. Mikrobioreaktory mogą być również wykorzystywane do utrzymywania optymalnych warunków dla hodowli komórek progenitorowych, a także do zwiększania wydajności różnicowania końcowego.