Name: Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę indukcji pluripotencji w dojrzałych komórkach ssaków bez wektorów wirusowych, łączącą chemiczne usuwanie epigenetyczne ze wskazówkami biomechanicznymi. Technika ta wykorzystuje mikrobioreaktory typu liquid marble i umożliwia długoterminową kulturę komórek o wysokiej plastyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Carraresi i MiND FoodS Hub ID: 1176436. Wszyscy autorzy są członkami COST Action CA16119 In vitro 3-D Total Cell guidance and Fitness (CellFit).

Wszystkie badania zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komisję Etyczną Uniwersytetu w Mediolanie. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, opublikowanymi przez Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) w USA. Izolacja ludzkich komórek od zdrowych dorosłych osób została zatwierdzona przez Komisję Etyczną Ospedale Maggiore Policlinico w Mediolanie. Wszystkie metody zastosowane w naszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
1. Izolacja fibroblastów skóry
UWAGA: Wszystkie opisane poniżej procedury można zastosować do fibroblastów wyizolowanych z różnych gatunków ssaków, w tym myszy, świni i ludzi. Komórki mysie wyizolowano od 7-tygodniowych samców myszy, a tkankę skóry świńskiej pobrano w lokalnej rzeźni. Komórki ludzkie wyizolowano od pacjentów dorosłych po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody.
<ol>
	<li>Przygotować 0,1% roztwór żelatyny wieprzowej.
	<ol>
		<li>Odważyć 0,1 g żelatyny wieprzowej i rozpuścić ją w 100 mL wody. Przed użyciem roztwór żelatyny wysterylizować w autoklawie.</li>
		<li>Szalkę Petriego o średnicy 35 mm pokryć 0,1% żelatyną wieprzową, dodając 1,5 mL przygotowanego roztworu. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciąć biopsje skóry ssaków (mysiej, wieprzowej i ludzkiej) o długości około 2-5 cm i umieścić je w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (PBS) zawierającym 2% roztwór antybiotyku i antymykotyku. Przechowywać w temperaturze + 4 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Pobieranie biopsji musi być przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i po uzyskaniu zgody Komisji Etycznej.</li>
	<li>Zebrane biopsje dokładnie przemyć trzykrotnie w świeżym, sterylnym PBS zawierającym 2% roztwór antybiotyku i antymykotyku.</li>
	<li>Biopsje z ostatniego płukania zebrać i umieścić w sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Za pomocą sterylnego skalpela pociąć je na fragmenty o wielkości około 2 mm3.</li>
	<li>Po 2 h inkubacji usunąć nadmiar roztworu żelatyny z szalki Petriego o średnicy 35 mm (opisanej w kroku 1.1.2) i za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej natychmiast umieścić 5-6 fragmentów skóry w każdej uprzednio pokrytej szalce hodowlanej.</li>
	<li>Nawilżyć fragmenty, dodając po 100 µL kropli pożywki do izolacji fibroblastów (Tabela 1) na każdy z nich. Hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2. 
	UWAGA: Aby zapobiec odparowaniu pożywki, szalkę Petriego o średnicy 35 mm umieścić w szalce Petriego o średnicy 100 mm lub większej, zawierającej sterylną wodę. Należy pamiętać o zamknięciu obu szalek.</li>
	<li>Po 24 h hodowli sprawdzić ilość pożywki w hodowlanej szalce Petriego o średnicy 35 mm. W razie potrzeby dodać 500 µL pożywki do izolacji fibroblastów, aby utrzymać nawilżenie fragmentów.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę i odświeżać ją za pomocą pipety co najmniej co 2 dni hodowli.</li>
	<li>Gdy fibroblasty zaczną wyrastać z fragmentów skóry umieszczonych w szalce Petriego o średnicy 35 mm (opisanej w kroku 1.5.) i zaczną tworzyć monowarstwę komórkową (zwykle po 6 dniach), usunąć fragmenty skóry za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej i hodować w 2 mL pożywki do izolacji fibroblastów.</li>
	<li>Kontynuować hodowlę monowarstwy komórkowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 aż do osiągnięcia 80% konfluencji, odświeżając pożywkę co drugi dzień.</li>
</ol>
2. Hodowla pierwotnej linii komórkowej fibroblastów
<ol>
	<li>Gdy fibroblasty osiągną 80% konfluencji, ostrożnie usunąć pożywkę do izolacji fibroblastów i przemyć komórki trzykrotnie 3 mL PBS zawierającego 1% roztwór antybiotyków i przeciwgrzybików.</li>
	<li>W celu odklejenia komórek dodać do naczynia hodowlanego 600 µL 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.</li>
	<li>Gdy komórki zaczną odklejać się od naczynia hodowlanego, dodać 5,4 mL pożywki do hodowli fibroblastów, aby zneutralizować trypsynę (Tabela 1).</li>
	<li>Odczepić komórki poprzez wielokrotne i delikatne pipetowanie. Przesiać komórki do nowych naczyń hodowlanych (bez żelatyny), zachowując stosunek pasażowania od 1:2 do 1:4 (w zależności od szybkości wzrostu). 
	UWAGA: Wirowanie nie jest konieczne.</li>
	<li>Utrzymywać komórki w kulturze i wymieniać pożywkę co 2 dni, aż osiągną 80% konfluencji, a następnie przeprowadzić pasaż. 
	UWAGA: Pasażować fibroblasty dwa razy w tygodniu, aby utrzymać intensywny wzrost.</li>
</ol>
3. Ekspozycja fibroblastów na 5-aza-CR
<ol>
	<li>Przygotuj świeży roztwór zapasowy 5-aza-CR o stężeniu 1 mM.
	<ol>
		<li>Odważ 2,44 mg 5-aza-CR i rozpuść w 10 ml DMEM z wysoką zawartością glukozy. Resuspenduj proszek za pomocą wstrząsarki vortex. Sterylizuj roztwór za pomocą 0.22 µm filtr 
		UWAGA: Roztwór zapasowy 5-aza-CR należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy 5-aza-CR poprzez rozcieńczenie 1 µL roztworu zapasu 5-aza-CR (3.1.1.) w 1 ml pożywki do hodowli fibroblastów. 
		UWAGA: Stężenie roztworu roboczego 5-aza-CR wynosi 1 μM1,2,3,8,9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddać komórki trypsynizacji zgodnie z wcześniejszym opisem (2.1.–2.3.) i odseparować je poprzez wielokrotne, delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórkową i przenieść ją do probówki stożkowej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory licznej pod mikroskopem optycznym w temperaturze pokojowej. Oblicz objętość pożywki niezbędną do ponownego zawieszenia komórek w celu uzyskania stężenia 4 x 104 komórki w 30 μL pożywki do hodowli fibroblastów uzupełnionej o 1 μM 5-aza-CR (patrz krok 3.1.2.). 
	UWAGA: Wzór, którego należy użyć, zależy od konkretnego rodzaju komory. 
	<img alt="Wzór na liczenie komórek: Komórki/µL = średnia liczba komórek na siatce × współczynnik komory × rozcieńczenie; metoda obliczeń." src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Wirować zawiesinę komórkową przy 150 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i resuspendować osad w pożywce do hodowli fibroblastów uzupełnionej o 1 μM 5-aza-CR (patrz krok 3.1.2.). Objętość pożywki do hodowli fibroblastów, której należy użyć, podano w kroku 3.4. 
	UWAGA: Jako kontrolę negatywną należy resuspendować komórki w tym samym stężeniu w pożywce do hodowli fibroblastów bez dodatku 5-aza-CR, a następnie przystąpić do enkapsulacji komórek w proszku PTFE (kroki 4.1.–4.13.).</li>
</ol>
4. Enkapsulacja fibroblastów w mikrobioreaktorach PTFE
<ol>
	<li>Wypełnij 35 mm szalkę Petri proszkiem politetrafluoroetylenowym (PTFE), aby utworzyć złoże (Rysunek 1A). 
	UWAGA: Należy używać 35 mm szalek Petri do bakteriologii, aby uniknąć przylegania ciekłych kulek (liquid marbles). W celu uzyskania cienkiej, hydrofobowej i porowatej otoczki należy zastosować proszek PTFE o średnicy cząstek 1 μm, wytworzony przy maksymalnym stopniu rozdrobnienia 2,0 NPIRI. Pozwala to na stworzenie przepuszczalnych dla gazów ciekłych kulek. Ponadto półprzezroczysta powłoka ułatwia obserwację procesów agregacji komórek w czasie rzeczywistym. Większa średnica cząstek prowadzi do wysokiej polidyspersyjności, co może powodować zwiększone parowanie, deformację i utratę kształtu sferycznego oraz przedwczesny rozpad mikrobioreaktorów.</li>
	<li>Nanieś pojedynczą kroplę o objętości 30 μL zawierającą 4 x 104 komórek (patrz kroki 3.4.- 3.5.) na złoże proszku (Rysunek 1B).</li>
	<li>Delikatnie obracaj 35 mm szalkę Petri ruchem okrężnym, aby upewnić się, że proszek PTFE całkowicie pokrył powierzchnię kropli cieczy, tworząc mikrobioreaktor w formie ciekłej kulki (Rysunek 1C).</li>
	<li>Pobierz mikrobioreaktor w formie ciekłej kulki za pomocą końcówki pipety 1 000 μL, ściętej na krawędzi, aby dopasować ją do średnicy kulki (Rysunek 1D,E). Umieść mikrobioreaktor na czystej szalce Petri do bakteriologii w celu jego stabilizacji (Rysunek 1F). 
	UWAGA: Aby stworzyć tarcie umożliwiające uchwycenie kulki wewnątrz końcówki, należy przyciąć końcówki pipety tak, aby ich średnica była nieco mniejsza niż średnica ciekłej kulki.</li>
	<li>Przenieś mikrobioreaktor w formie ciekłej kulki z szalki Petri do płytki 96-dołkowej (jedna kulka na dołek) (Rysunek 1G).</li>
	<li>Powoli dodaj 100 μL pożywki przy krawędzi dołka. Mikrobioreaktor zacznie pływać na powierzchni pożywki (Rysunek 1H). 
	UWAGA: Mikrobioreaktor rozpada się przy bezpośrednim kontakcie z cieczą ze względu na zaburzenie hydrofobowości PTFE. Jako alternatywną metodę można umieścić mikrobioreaktory w formie ciekłych kulek pojedynczo w 35 mm szalce do hodowli bakteriologicznych. W takim przypadku, aby zapobiec parowaniu ciekłych kulek, 35 mm szalkę Petri zawierającą mikrobioreaktor należy włożyć do 100 mm szalki Petri, do której wcześniej nalano sterylną wodę.</li>
	<li>Inkubuj mikrobioreaktory w formie ciekłych kulek przez 18 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO21,2,3,8,9. 
	UWAGA: Rozmiar cząstek PTFE wynoszący 1 μm zapewnia optymalną wymianę gazową między cieczą wewnątrz a otoczeniem.</li>
	<li>Po 18 h inkubacji z 5-aza-CR pobierz mikrobioreaktory w formie ciekłych kulek za pomocą końcówki pipety 1 000 μL ściętej na krawędzi (patrz krok 4.5).</li>
	<li>Umieść mikrobioreaktory w nowej 35 mm szalce Petri do bakteriologii (Rysunek 1D-F).</li>
	<li>Użyj igły, aby przebić i rozbić ciekłą kulkę.</li>
	<li>Odzyskaj powstałe sferoidy za pomocą końcówki pipety 200 μL ściętej na krawędzi, pracując pod stereomikroskopem (Rysunek 1I,J). 
	UWAGA: Komórki z usuniętymi epigenetycznie znacznikami zamknięte w PTFE tworzą sferyczną strukturę 3D (jeden agregat w każdej ciekłej kulce).</li>
	<li>Aby ocenić nabycie stanu pluripotencji w odpowiedzi na 5-aza-CR, sprawdź początek ekspresji genów związanych z pluripotencją: OCT4, NANOG, REX1 oraz SOX2 za pomocą jakościowej PCR (Tabela 2).</li>
	<li>Przejdź do drugiego etapu protokołu zgodnie z poniższym opisem.</li>
</ol>
5. Hodowla komórek z usuniętymi znacznikami epigenetycznymi w mikro-bioreaktorach z PTFE
<ol>
	<li>Przygotować świeżą pożywkę do hodowli ESC (Tabela 1).</li>
	<li>Przenieść organoidy do szalki Petriego zawierającej pożywkę ESC w celu wypłukania pozostałości 5-aza-CR (patrz kroki 5.1.-5.2.).</li>
	<li>Przygotować nową 35-milimetrową bakteriologiczną szalkę Petriego zawierającą łoże z proszku PTFE (patrz również krok 4.1.).</li>
	<li>Nanieść pojedynczy organoid w kropli 30 μL pożywki do hodowli ESC na łoże proszkowe, używając końcówki pipety 200 μL ściętej na krawędzi (patrz kroki 4.9.; 5.3.).</li>
	<li>Delikatnie obracać 35-milimetrową szalkę Petriego kolistym ruchem, aby uformować nowy mikrobioreaktor w postaci ciekłej kulki (liquid marble), pobrać go końcówką pipety 1,000 μL ściętą na krawędzi i umieścić nowo powstały mikrobioreaktor w studzience płytki 96-dołkowej (jedna kulka na studzienkę) (patrz kroki 4.3.-4.6.).</li>
	<li>Aby mikrobioreaktory unosiły się na powierzchni, dodać 100 μL pożywki przy krawędzi studzienki, aby powoli obmyć kulkę (patrz uwaga 4.7.).</li>
	<li>Hodować mikrobioreaktory w postaci ciekłych kulek w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez wymagany czas. Wymieniać pożywkę co drugi dzień, postępując zgodnie z procedurą opisaną w punktach 5.3.-5.7. 
	UWAGA: W niniejszej pracy przedstawiono wyniki uzyskane przy hodowli organoidów przez 28 dni. Jeśli jednak jest to konieczne, można zastosować dłuższy okres hodowli.</li>
</ol>

<ol><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333(2015).</li>
<li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li>
<li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li>
<li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017(2016).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+reviews+and+reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li>
<li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine%2C+DNA+methylation%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li>
<li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-azacytidine+and+its+2%27-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li>
<li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2%27-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).</li>
<li>Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+influences+of+mechanical+forces+on+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple influences of mechanical forces on cell competition.</a> Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).</li>
<li>Yim, E. K., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-dependent+cell+signaling+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).</li>
<li>Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+extracellular+forces+that+determine+cell+fate+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance.</a> Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).</li>
<li>Streuli, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+mediates+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia.</a> The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).</li>
<li>Christman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Azacytidine+and+5-aza-2%5Bprime%5D-deoxycytidine+as+inhibitors+of+DNA+methylation%3A+mechanistic+studies+and+their+implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy.</a> Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).</li>
<li>Stresemann, C., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+action+of+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+azacytidine+and+decitabine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine.</a> International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).</li>
<li>Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+in+vitro+maturation+of+sheep+oocytes+in+a+liquid+marble+microbioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).</li>
<li>Vadivelu, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+multiple+spheroid+model+of+olfactory+ensheathing+cells+using+floating+liquid+marbles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles.</a> Scientific Reports. 5, 15083(2015).</li>
<li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).</li>
<li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).</li>
<li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+signaling-directed+YAP%2FTAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci kilka badań koncentrowało się na opracowaniu strategii przywracania terminalnie zróżnicowanej komórki w kierunku mniej zaangażowanego i bardziej permisywnego stanu. Opisany tutaj protokół pozwala na wytwarzanie i długoterminowe utrzymywanie komórek pluripotencjalnych, począwszy od dojrzałych, terminalnie zróżnicowanych komórek dorosłych. Metoda łączy w sobie dwa niezależne etapy, które polegają na indukcji stanu wysokiego permisywnego, który osiąga się poprzez chemiczne wymazywanie epigen...

W ciągu ostatnich dziesięcioleci powszechnie akceptowana koncepcja jednokierunkowego postępu w kierunku zaangażowania i różnicowania komórek została całkowicie zmieniona. Wykazano, że specyfikacja komórki może zostać odwrócona, a kończalnie zróżnicowana komórka może zostać popchnięta w kierunku mniej zaangażowanego i bardziej permisywnego stanu, przy użyciu różnych metod.
Wśród kilku proponowanych metod, jedna z najbardziej obiecujących metod polega na użyciu związków chemicznych do indukowania komórek w tak zwanej chemicznie indukowanej pluripotencji. Małe cząsteczki stosowane w tym podejściu są w stanie oddziaływać i modyfikować sygnaturę epigenetyczną dorosłej dojrzałej komórki, unikając potrzeby stosowania jakiegokolwiek wektora transgenicznego i/lub wirusowego1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Liczne badania wykazały ostatnio, że możliwe jest przełączanie komórek z jednego fenotypu na drugi poprzez dostarczanie określonych bodźców biochemicznych i biologicznych, które indukują reaktywację hipermetylowanych genów11,12,13,14,15. Te zdarzenia demetylacji pozwalają na przekształcenie kończnie zróżnicowanych komórek w prymitywnego przodka, komórkę multipotencjalną lub o wysokiej plastyczności/pluripotencjalną1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Równolegle, wiele badań skupia się ostatnio na zrozumieniu sygnałów związanych z mechanosensoringiem, a dokładniej na możliwości wykorzystania sił mechanicznych do bezpośredniego wpływania na plastyczność i/lub różnicowanie komórek16,17,18,19. Rzeczywiście, wyraźnie wykazano, że macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w kontroli losu komórki. W szczególności sygnały biomechaniczne i biofizyczne wytwarzane przez ECM bezpośrednio regulują mechanizmy molekularne i szlaki sygnałowe, wpływając na zachowanie i funkcje komórek20,21. Najnowsze dane utorowały drogę do opracowania nowatorskich systemów hodowli 3D, które lepiej naśladują mikrośrodowisko komórkowe in vivo, replikując bodźce mechaniczne i fizyczne wpływające na zachowanie komórek.
Opisujemy tutaj dwuetapowy protokół, który łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoringiem, w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków. W pierwszym etapie komórki są inkubowane z cząsteczką demetylującą 5-aza-cytydynę (5-aza-CR). Czynnik ten jest w stanie wywołać znaczącą globalną demetylację DNA poprzez połączony efekt bezpośredniego działania za pośrednictwem translokacji 10-jedenaście 2 (TET2)8,10 oraz pośrednie hamowanie metylotransferaz DNA (DNMT)22,23. Ten krok indukuje usunięcie blokad epigenetycznych, a następnie reaktywację ekspresji genów związanych z pluripotencją, a tym samym generowanie komórek o wysokiej plastyczności1,2,3,8,10, zwane dalej "komórkami wymazanymi epigenetycznie". W drugim etapie komórki są zamykane w systemie hodowli 3D. W tym celu jako mikrobioreaktor zastosowano niereaktywny hydrofobowy związek syntetyczny politetrafluoroetylen (PTFE; o wielkości cząstek 1 μm), który pozwala na stworzenie mikrośrodowiska komórkowego nieosiągalnego przy użyciu tradycyjnych systemów hodowli 2D10. Cząsteczki proszku PTFE przylegają do powierzchni kropli cieczy, w której komórki są ponownie zawieszane i izolują ciekły rdzeń od powierzchni nośnej, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową między wewnętrzną cieczą a otaczającym środowiskiem24. Uzyskany w ten sposób "mikrobioreaktor PTFE", znany również jako "płynny marmur", zachęca komórki do swobodnej interakcji ze sobą, promując rearanżację komórek 3D25,26,27, oraz rozszerza i stabilnie utrzymuje nabyty stan wysokiej plastyczności dzięki sygnałom związanym z biomechanosensoringiem10.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Składnik pożywki ESC</td></tr><tr><td>5-Azacytydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, do epigenetycznego usuwania fibroblastów</td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC</td></tr><tr><td>Antybiotyk Roztwór przeciwgrzybiczy (100& razy;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Składnik pożywki fibroblastów i ESC</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>NA</td><td>Termocykler do ilościowego PCR</td></tr><tr><td>Cytydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4654</td><td>Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, pirogronian</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Do izolacji fibroblastów i pożywki</td></tr> <tr><td>hodowlanejDMEM, niska glukoza, pirogronian</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31885023</td><td>Dla ESC medium</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>PBS; do biopsji i przemywania komórek oraz do przygotowania roztworu</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61021</td><td>Estraction mRNA</td></tr><tr><td>ESGRO Rekombinowane mysie białko LIF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ESG1106</td><td>Składnik pożywki ESC</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Składnik pożywki dla fibroblastów i ESC</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA10-155) Rekombinowane białko ludzkie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>Składnik pożywki ESC</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Do powlekania naczyń</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td>NA</td><td>Termocykler do jakościowego PCR</td></tr><tr><td>Globalna metylacja DNA ELISA Zestaw</td><td>CELL BIOLABS</td><td>STA-380</td><td>Badanie metylacji</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polimeraza</td><td>Promega</td><td>M7801</td><td>Jakościowy PCR</td></tr><tr><td>Guanozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6264</td><td>Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC</td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza Ham's F-10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td>Do podłoża ESC</td></tr><tr><td>Zamiennik serum do nokautowania</td><td>Thermo Fisher Naukowe</td><td>10828028</td><td>Składnik podłoża ESC</td></tr><tr><td>KOVA Glasstic Slide 10 z siatkami</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Leica MZ APO</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Do obserwacji organoidów</td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Składnik pożywek fibroblastów i ESC</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Składnik podłoża ESC</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &micro; m filtry porowe</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Do sterylizacji roztworem</td></tr><tr><td>M-MLV Odwrotna transkryptaza, RNaza H Minus, Point Mutant</td><td>Promega</td><td>M3681</td><td>Odwrotna transkrypcja mRNA Multiskan</td></tr><tr><td>FC Microplate Fotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51119000</td><td>Do odczytu płytki ELISA</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 Mikroskop kontrastowy z odwróconą fazą</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Do komórki obserwacja</td></tr><tr><td>Perkin Elmer Thermal Cycler 480</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Termocykler do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>Poli(tetrafluoroetylen) 1 &mu; m Wielkość cząstek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>430935</td><td>Do generowania mikrobioreaktora</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K182001</td><td>Ekstrakcja genomicznego DNA</td></tr><tr><td>Zestaw TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1728</td><td>Ilościowy PCR</td></tr><tr><td>Tymidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Składnik mieszanki nukleozydów do pożywki ESC</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100X20 mm, standardowe</td><td>833902 Sarstedt</td><td></td><td>Do izolacji fibroblastów</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 35X10 mm, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>833900</td><td>Do izolacji fibroblastów</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 35X10 mm, zawiesina</td><td>Sarstedt</td><td>833900500</td><td>Bakteriologia szalka Petriego do hodowli płynnego marmuru</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkanek 96 Well, Standard, F</td><td>Sarstedt</td><td>833924005</td><td>Do hodowli płynnego marmuru</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>Do dysocjacji fibroblastów</td></tr><tr><td>Probówka 15ml, 120x17mm, PS</td><td>Sarstedt</td><td>62553041</td><td>Do wirowania zawiesiny komórkowej</td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td>Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC</td></tr></tbody></table>

dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Fenotyp komórki może być odwrócony lub zmodyfikowany różnymi metodami, z zaletami i ograniczeniami, które są specyficzne dla każdej techniki. W tym artykule opisujemy nową strategię, która łączy wykorzystanie chemicznego wymazywania epigenetycznego ze wskazówkami związanymi z mechanosensoryzacją, w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków. Wymagane są dwa główne kroki. W pierwszym etapie dorosłe dojrzałe (nieuleczalnie zróżnicowane) komórki są poddawane działaniu epigenetycznej gumki 5-aza-cytydyny, aby wprowadzić je w stan pluripotencjalny. Ta część protokołu została opracowana w oparciu o rosnące zrozumienie mechanizmów epigenetycznych kontrolujących los i różnicowanie komórek, i obejmuje wykorzystanie modyfikatora epigenetycznego do usunięcia stanu różnicowania komórek, a następnie przejścia w przejściowe okno wysokiej plastyczności.
W drugim kroku, wymazane komórki są zamykane w mikro-bioreaktorach z politetrafluoroetylenu (PTFE), znanych również jako Płynne Kulki, aby promować przegrupowanie komórek 3D w celu rozszerzenia i stabilnego utrzymania uzyskanej wysokiej plastyczności. PTFE jest niereaktywnym hydrofobowym związkiem syntetycznym, a jego zastosowanie pozwala na stworzenie mikrośrodowiska komórkowego, czego nie można osiągnąć w tradycyjnych systemach hodowli 2D. System ten zachęca i wzmacnia utrzymanie pluripotencji poprzez sygnały związane z biomechanosensoryzacją.
Procedury techniczne opisane tutaj to proste strategie pozwalające na indukcję i utrzymanie stanu wysokiej plastyczności w dorosłych komórkach somatycznych. Protokół pozwolił na wyprowadzenie komórek o wysokiej plastyczności u wszystkich badanych gatunków ssaków. Ponieważ nie wiąże się z wykorzystaniem transfekcji genów i jest wolna od wektorów wirusowych, może stanowić znaczący postęp technologiczny w zastosowaniach medycyny translacyjnej. Co więcej, system mikrobioreaktorów stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych dzięki odtworzeniu in vitro specyficznego mikrośrodowiska, które pozwala na długoterminową hodowlę komórek o wysokiej plastyczności, a mianowicie jako ESC, iPSC, komórek wymazanych epigenetycznie i MSC.

Niniejszy protokół opisuje wszystkie kroki niezbędne do wygenerowania i stabilnego utrzymania pluripotencjalnych komórek ssaków z dorosłych komórek somatycznych. Metoda ta okazała się skuteczna w przypadku fibroblastów izolowanych od różnych gatunków ssaków, mianowicie myszy, świni i człowieka. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki uzyskano dla wszystkich linii komórkowych, niezależnie od gatunku pochodzenia.
Analizy morfologiczne wykazały, że po 18 h inkubacji z czynnikiem demetylującym ...

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Protokół pokazany w tym filmie po raz pierwszy łączy wykorzystanie chemicznego wymazywania epigenetycznego ze wskazówkami biomechanicznymi w celu wywołania i utrzymania pluripotencji w dorosłych terminalnie zróżnicowanych komórkach. Główną zaletą tego protokołu jest to, że nie wymaga wektorów transgenicznych ani wirusowych. Ponadto jest wytrzymały, wysoce powtarzalny i elastyczny.Technika ta nie wymaga stosowania transfekcji genów, a zatem stanowi znaczący postęp technologiczny w medycynie translacyjnej i terapii komórkowej, wspierając jednocześnie długoterminową hodowlę komórek o wysokiej plastyczności. Procedurę zademonstrują Georgia Pennarossa, adiunkt i Teresina De Iorio, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od przygotowania świeżego jednomilimolowego roztworu podstawowego 5-aza-CR.Zważ 2,44 miligrama 5-aza-CR i rozpuść go w 10 mililitrach DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Ponownie zawiesić proszek przez wirowanie i wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,22 mikrometra. Przygotować roztwór roboczy 5-aza-CR, rozcieńczając jeden mikrolitr roztworu podstawowego w jednym mililitrze pożywki hodowlanej fibroblastów.Trypsynizować komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie i usuwać je delikatnym pipetowaniem. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i przenieść ją do stożkowej probówki. Policz komórki za pomocą komory liczącej pod mikroskopem optycznym.Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 150 razy G przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, aby uzyskać 40 000 komórek w 30 mikrolitrach pożywki hodowlanej fibroblastów uzupełnionej jednomikromolowym 5-aza-CR. Napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego proszkiem PTFE, aby wytworzyć złoże i dozować 30 mikrolitrów komórek na złoże proszkowe.Delikatnie obracaj szalkę Petriego ruchem okrężnym, aby upewnić się, że proszek PTFE całkowicie pokrywa powierzchnię kropli cieczy, tworząc mikrobioreaktor z ciekłego marmuru. Podnieś mikrobioreaktor z płynnego marmuru za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, która została przycięta tak, aby dopasować się do średnicy marmuru. Umieść mikrobioreaktor na czystej bakteriologicznej szalce Petriego, aby go ustabilizować.Następnie przenieś mikrobioreaktor z szalki Petriego na 96-dołkową płytkę. Powoli dodawaj 100 mikrolitrów pożywki z brzegu studni. Mikrobioreaktor powinien unosić się na wierzchu pożywki.Inkubuj mikrobioreaktor z płynnego marmuru przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji zbierz mikrobioreaktor z płynnego marmuru za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i umieść go na nowej 35-milimetrowej bakteriologicznej szalce Petriego. Użyj igły, aby przebić płynny marmur i rozbić go.Odzyskaj uformowane sferoidy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów, która została przecięta na krawędzi pod mikroskopem stereoskopowym. Aby zmyć pozostałości 5-aza-CR, należy przenieść organoidy na szalkę Petriego zawierającą pożywkę ESC. Przygotować nową 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą łoże proszku PTFE i dozować pojedynczy organoid w 30-mikrolitrowej kropelce pożywki hodowlanej ESC na proszek za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Delikatnie obracaj naczynie ruchem okrężnym, aby utworzyć nowy mikrobioreaktor z płynnego marmuru i przenieś go do studzienki z 96-dołkową płytką. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki z brzegu studni, aby powoli kąpać marmur. Hoduj mikrobioreaktory z płynnego marmuru w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Z analiz morfologicznych wynika, że po 18-godzinnej inkubacji ze środkiem demetylującym 5-aza-CR fibroblasty trzech gatunków ssaków zamknięte w mikrobioreaktorach PTFE agregowały i tworzyły sferyczne struktury 3D o jednolitej geometrii wielkości. W warunkach 3D 86,31% otoczonych komórek znacznie zmodyfikowało swój fenotyp. W przeciwieństwie do tego, komórki post-5-aza-CR hodowane w standardowych warunkach 2D były znacznie mniejsze, z ziarnistymi jądrami i zachowywały rozkład jednowarstwowy.Zmianom morfologicznym towarzyszył początek ekspresji genów związanych z pluripotencją, zarówno w komórkach 3D, jak i 2D post-5-aza-CR. Transkrypcję zaobserwowano dla homeoboksu pierwszego klasy piątej POU, homeoboxu NANOG, białka palca cynkowego ZFP42 i regionu determinującego płeć Ybox2, które są nieobecne w nieleczonych fibroblastach. Znaczącą regulację w górę cząsteczki adhezji komórek nabłonkowych translokacji 10-11 translokacji 2 i genów kadheryny 1 zaobserwowano również w komórkach 3D post-5-aza-CR w porównaniu z komórkami hodowanymi w standardowych plastikowych naczyniach 2D.Równolegle wykryto regulację w dół specyficznego dla fibroblastów markera antygenu powierzchniowego komórek Thy1 zarówno w komórkach 3D, jak i 2D post-5-aza-CR. Znaczący spadek poziomu metylacji zarówno w komórkach post-5-aza-CR 3D, jak i 2D potwierdzono za pomocą testu ELISA. Poziomy metylacji DNA były znacznie niższe w komórkach 3D post-5-aza-CR w porównaniu z komórkami hodowanymi w warunkach 2D.Co więcej, komórki 3D post-5-aza-CR zachowały nabytą sferyczną strukturę 3D, wysoki poziom ekspresji genów związanych z pluripotencją i niski poziom metylacji DNA przez 28 dni, w którym to momencie hodowla została zatrzymana. Mikrobioreaktory mogą być również wykorzystywane do utrzymywania optymalnych warunków dla hodowli komórek progenitorowych, a także do zwiększania wydajności różnicowania końcowego.

a-two-step-strategy-that-combines-epigenetic-modification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Przedstawiono szczegółowe protokoły wprowadzania zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 (CiDER) do komórek ssaków w celu indukowania chemicznie indukowanego DNA hydroksymetylacji i epigenetycznej przebudowy.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

W momencie gdy komórki osiągają konfluencję, należy je poddać subkulturze lub pasażowaniu. Niniejszy film zaprezentuje procedurę subkultury komórek adherentnych oraz zawiesinowych.

Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania dynamicznych zmian w matrycy chromatyny, które regulują transkrypcję indukowaną przez szlak przekazywania sygnału.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

Poznaj metodę indukcji pluripotencji w dojrzałych komórkach ssaków bez wektorów wirusowych, łączącą chemiczne usuwanie epigenetyczne ze wskazówkami biomechanicznymi. Technika ta wykorzystuje mikrobioreaktory typu liquid marble i umożliwia długoterminową kulturę komórek o wysokiej plastyczności.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków (Wideo) | JoVE Journal

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Przeglądaj więcej filmów