Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA
14 stycznia 2021
Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.
Ta nowa, skuteczna metoda izolowania subpopulacji spermatocytów i spermatydów od dorosłych myszy może być wykorzystana do zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw mejozy i spermatogenezy. Metoda ta wykorzystuje barwnik wiążący DNA o niskiej cytotoksyczności i szerokim spektrum wzbudzenia, który można zastosować do większości obecnie stosowanych rzędów FACS. Ta metoda jest bardzo prosta.
Najtrudniejszym aspektem jest bramkowanie metodą cytometrii przepływowej, ale szczegółowa strategia bramkowania powinna pomóc w dostosowaniu protokołu do innych sorterów komórek. Procedurę zademonstruje Yu-Han Yeh, asystent naukowy z Laboratorium Satoshi Namekawa. Po zebraniu obu jąder od ośmiotygodniowego samca myszy, umieść tkanki na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej dwa mililitry lodowatego PBS i usuń osłonkę białawą.
Delikatnie oddziel jądra kleszczami, aby lekko rozproszyć kanaliki nasienne. I przenieś kanaliki do kropli świeżego, lodowatego PBS na 100-milimetrowej szalce Petriego. Użyj kleszczyków, aby delikatnie rozplątać kanaliki i umyj kanaliki w trzech dodatkowych kropelkach PBS, jak właśnie pokazano.
Po ostatnim przepłukaniu umieść rozplątane kanaliki nasienne w 15-mililitrowej probówce, zawierającej dwa mililitry buforu dysocjacyjnego na 20-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby delikatnie odpipetować kanaliki 20 razy, a następnie włóż probówkę z powrotem do inkubatora na dodatkowe sześć minut. Pod koniec inkubacji należy odpipetować tkanki dodatkowo 20 razy, a następnie włożyć probówkę z powrotem do inkubatora.
Po trzech minutach delikatnie odpipetuj kanaliki 10 razy lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne widoczne kawałki tkanki, zanim zatrzymasz dysocjację za pomocą 10 mililitrów buforu FACS. Następnie odwirować do zawiesiny tkankowej dwa razy, używając dodatkowych 10 mililitrów w celu uzyskania świeżego buforu FACS do drugiego płukania w celu usunięcia plemników i jak największej ilości zanieczyszczeń. Aby zabarwić komórki do analizy cytometrii przepływowej, ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach buforu FACS.
I przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonowe sitko o grubości 70 mikronów do 50-mililitrowej probówki. Po zliczeniu przenieś 10% komórek do nowej probówki na lodzie jako niebarwioną kontrolę ujemną. I dokładnie wymieszaj sześć mikrolitrów barwnika DCV z pozostałą zawiesiną komórkową.
Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności z delikatnym wstrząsaniem co 10 minut, dodaj do komórek pięć mikrolitrów DNazy I. I przefiltruj komórki przez sitko z nylonowej siatki o grubości 35 mikronów do pięciomililitrowej rurki FACS na lodzie. W przypadku analizy cytometrycznej przepływu komórek utwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu do analizy przepływu, a następnie w menu narzędzi arkusza kliknij pozycję Nowa gęstość, aby utworzyć wykres gęstości obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia wstecznego w skali liniowej.
Kliknij nowy histogram, aby utworzyć wykres niebieskiego histogramu DCV w skali logarytmicznej. I kliknij start i nagraj, aby rozpocząć przetwarzanie niezabarwionej próbki. Podczas działania próbki kliknij ustawienia detektora i progu, aby dostosować napięcia PMT rozproszenia do przodu i z boku, aby umieścić niezabarwione komórki na skali wykresu punktowego do przodu i do tyłu.
Dostosuj napięcie PMT dla kanału jappy, aby zlokalizować pozycję ujemnej populacji DCV w pierwszej dekadzie wykresu logarytmicznego niebieskiego histogramu DCV. Następnie kliknij przycisk Stop, aby rozładować niebarwioną próbkę. Po krótkim wirowaniu i załadowaniu barwionej próbki kliknij następną probówkę, aby utworzyć nowy arkusz roboczy dla próbki.
Ustaw cytometr tak, aby rejestrował co najmniej raz razy 10 do sześciu zdarzeń, a następnie kliknij start i nagrywaj. Następnie kliknij nową gęstość, aby utworzyć wysokość rozproszenia do przodu w stosunku do szerokości rozproszenia do przodu. A wykresy gęstości niebieskiego i czerwonego DCV DCV na skali liniowej.
Na wykresie gęstości obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia wstecznego użyj narzędzia wielokąta, aby narysować bramkę zwaną komórkami, aby uwzględnić większość komórek i wykluczyć małe zanieczyszczenia. Zastosuj tę bramkę do wykresu wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do szerokości rozproszenia do przodu i użyj narzędzia prostokąt, aby narysować bramkę pojedynczej komórki, aby wykluczyć komórki inne niż pojedyncze. Zastosuj bramkę pojedynczej komórki do wykresu gęstości niebieskiego i czerwonego DCV DCV i dostosuj skalę, aby uchwycić rozszerzony profil.
Użyj narzędzia wielokąta, aby narysować bramkę DCV, aby wykluczyć niebarwione komórki i populację boczną, a następnie zastosuj bramkę do niebieskiego wykresu histogramu DCV w skali liniowej. Trzy główne piki odnoszą się do różnej zawartości DNA 1C, 2C i 4C. Utwórz drugi wykres gęstości niebieskiej i czerwonej DCV DCV na skali liniowej.
I tylną bramę DCV na działkę, aby zlokalizować populacje 1C i 4C. Utwórz kolejny wykres gęstości koloru niebieskiego i czerwonego DCV DCV na skali liniowej. I użyj narzędzia elipsa, aby narysować bramę na populacji 1C.
Użyj narzędzia wielokąta, aby przebramować populację 4C za pomocą krzywej ciągłej. I utwórz kolejny wykres gęstości niebieskiego i czerwonego DCV w skali liniowej. Użyj narzędzia wielokąta, aby utworzyć jedną bramkę 4C.
Na nowym wykresie punktowym do przodu użyj narzędzia elipsa, aby utworzyć bramki spermatocytów pachytenu, diplotenu i leptotenu, zygotenu. Po narysowaniu wszystkich bramek utwórz nowy wykres punktowy DCV w kolorze niebieskim i czerwonym DCV na skali liniowej, aby zastosować bramkę dla 4C, aby upewnić się, że trzy populacje są w ciągłej kolejności w bramce. Następnie utwórz nowy wykres gęstości obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia wstecznego w skali liniowej i wybierz ujednolicony rozmiar komórek jako czystą populację okrągłych spermatydów.
Po sortowaniu reprezentatywne czystości oddzielonych frakcji spermatocytów leptotenu, zygotenu, pachytenu i diplotenu wynoszą zwykle od 80% do 90%, co potwierdza barwienie immunologiczne SYCP3 i Gamma H2AX. Czystość frakcji okrągłych spermatyd można potwierdzić przez barwienie jądra za pomocą DCV w połączeniu z barwieniem Sp56 i H1t, a także zwykle wynosi około 90% Żywotność izolowanych populacji komórek wynosi zwykle ponad 95%, a średnia całkowita wydajność każdej frakcji z jednej dorosłej myszy jest zwykle wystarczająca do różnych dalszych analiz. Posortowane komórki mogą być wykorzystane do różnych analiz sekwencjonowania nowej generacji, aby lepiej zbadać ekspresję i regulację genów podczas spermatogenezy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono prostą metodę izolacji żywych komórek zarodkowych meiotycznych i postmeiotycznych z jąder dorosłych myszy. Dzięki zastosowaniu barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności oraz sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), badacze mogą uzyskać silnie wzbogacone populacje komórek spermatogennych do różnych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wstęp
- Izolacja komórek spermatogennych jest kluczowa dla badania mejozy i spermatogenezy.
- Obecne metody mogą wiązać się z wysoką cytotoksycznością, co ogranicza żywotność komórek.
- Celem niniejszej metody jest poprawa żywotności komórek podczas izolacji.
- Gating w cytometrii przepływowej jest krytycznym etapem tego procesu.
Cel badania
- Opracowanie wydajnego protokołu izolacji spermatocytów i spermatyd.
- Ułatwienie badania mechanizmów molekularnych mejozy.
- Przedstawienie szczegółowej strategii bramkowania w celu adaptacji protokołu do innych sorterów komórek.
Zastosowane metody
- Pobieranie jąder z dorosłych samców myszy.
- Zastosowanie barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzanego światłem fioletowym.
- Wykorzystanie fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).
- Wdrożenie szczegółowej strategii bramkowania w cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja żywych komórek zarodkowych meiotycznych i postmeiotycznych.
- Wysoki stopień wzbogacenia populacji komórek spermatogennych.
- Wykazanie możliwości zastosowania metody w różnych systemach FACS.
- Zapewnienie prostego protokołu dla badaczy.
Wnioski
- Metoda ta zwiększa żywotność wyizolowanych komórek zarodkowych.
- Stanowi ona cenne narzędzie do badania spermatogenezy.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie czynników genetycznych i epigenetycznych w mejozie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja żywych subpopulacji spermatogenicznych umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku celów w biologii rozrodu oraz w odkrywaniu terapii celowanych w linię zarodkową. Metoda ta zwiększa wiarygodność predykcyjną walidacji celu poprzez dostarczenie wysokiej czystości żywotnych komórek do późniejszych analiz omicznych i testów funkcjonalnych. Jej kompatybilność ze standardowymi platformami FACS z laserem fioletowym poprawia dostępność i skalowalność w ramach procesów badawczych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w obrębie szlaków mejozy i spermatogenezy z wykorzystaniem oczyszczonych frakcji spermatocytów w stadiach leptoten/zygoten, pachyten oraz diploten.
- Wartość operacyjna: Zapewnia niskocytotoksyczną metodę barwienia kompatybilną z powszechnie dostępnymi sorterami komórek z laserem fioletowym, co zmniejsza bariery sprzętowe.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację żywych komórek o żywotności >95% do dalszych analiz funkcjonalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów zawartości DNA (1C, 2C, 4C) poprzez barwienie DCV, co umożliwia standaryzowane bramkowanie oparte na ploidii w celu zapewnienia powtarzalności analizy.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z jąder myszy, co stanowi krytyczny etap wstępny dla potoków przesiewowych opartych na metodzie FACS.
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie wysoko oczyszczonych frakcji spermatyd i spermatocytów (czystość 80–90%), odpowiednich do spójnych zastosowań w dalszych etapach, takich jak RNA-seq.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia system istotny dla przebiegu choroby do badania genetycznych i epigenetycznych regulatorów mejozy, wspierając dopasowanie celu do postawionej hipotezy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczenie żywotnych komórek linii zarodkowej do badań mechanistycznych.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w walidacji celów w linii zarodkowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związku wiodącego, w szczególności w przypadku terapii modulujących linię zarodkową, gdzie kontekst komórkowy ma krytyczne znaczenie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolowanie określonych etapów mejozy w celu profilowania molekularnego.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki zestandaryzowanym protokołom dysocjacji i barwienia, które zapewniają powtarzalną jakość zawiesiny komórkowej.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów z rozdzielczością ploidalności za pomocą fluorescencji DCV, co pozwala na porównanie stanów komórkowych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi, dostarczając mysi model systemowy o znaczeniu translacyjnym dla ludzkiej spermatogenezy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku przepływ pracy kompatybilny z FACS do izolowania żywych komórek rozrodczych w wielu projektach i klasach celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność w walidacji celu dzięki wyjaśnieniu mechanizmów progresji mejozy.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki szczegółowej strategii bramkowania oraz zastosowaniu barwników o niskiej cytotoksyczności.
- Wartość strategiczna: Ulepszenie decyzji typu go/no-go poprzez ograniczenie biologicznego ryzyka na późnych etapach programów ukierunkowanych na cele reprodukcyjne.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji celów linii zarodkowej z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o walidację funkcjonalną w oczyszczonych subpopulacjach komórek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie bramkowania cytometrycznego oraz kompensacji fluorescencji dla wieloparametrowej analizy DCV.
- Zależne od dostępu do aparatury FACS z możliwością wzbudzania laserem fioletowym (405 nm).
- Wymaga standaryzacji dysocjacji tkanek oraz czasu barwienia pomiędzy operatorami i laboratoriami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji buforu do dysocjacji oraz warunków inkubacji.
- Ograniczenie praktyczne: Metoda została obecnie zwalidowana dla jąder dorosłych myszy; możliwość zastosowania w tkankach niedojrzałych lub ludzkich wymaga dalszych badań.
