Posiewy tkankowe kory jajników bydła

Protokół ten pozwala na dogłębne badanie mikrośrodowiska jajników in vitro. Umożliwienie użytkownikom określenia wzrostu i rozwoju pęcherzyków, a także steroidogenezy i obfitości cząsteczek odpornościowych. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość bezpośredniej oceny zmian w mikrośrodowisku jajników i pojawiających się pęcherzykach jajnikowych oraz oceny unikalnej interakcji spowodowanej dodaniem określonych hormonów.

Technika ta może być stosowana do badania różnych zaburzeń rozrodczych powodujących zatrzymanie pęcherzyków włosowych. Na przykład zespół policystycznych jajników. Ponieważ możemy bezpośrednio ocenić mikrośrodowisko jajników in vitro, procedurę zademonstruje Brooke Bell, badaczka z mojego laboratorium.

Za pomocą kleszczy szczękowych zabezpiecz jajnik, przekrój na pół i zacznij usuwać zewnętrzne plastry. Upewnij się, że od jajnika nie odcięto więcej niż jeden do dwóch milimetrów głębokości powierzchni, aby nie zebrał się rdzeń. Wytnij skalpelem trzy do czterech cienkich pasków kory jajnika i umieść paski na trzeciej szalce Petriego wypełnionej PBS.

Pokrój paski na małe kwadratowe kawałki o wielkości od 0,5 do jednego milimetra sześciennego za pomocą ostrza skalpela. Użyj linijki pod szalkami Petriego, aby upewnić się, że kawałki mają podobny rozmiar i grubość, aby uzyskać spójne kawałki kory jajnika. Umyj kawałki kory jajnika we wszystkich trzech PBS i płytkach Petriego w polu antybiotykowym, używając kleszczyków z zakrzywionymi końcówkami, aby przesuwać kawałki między płukaniami.

Przenieś kawałki kory mózgowej przez serię płukań LB-15 i umieść je na końcowej szalce Petriego wypełnionej LB-15. Oznacz pokrywkę identyfikatorem zwierzęcia i stroną jajnika. Zbierz cztery kawałki kory jajnika na jajnik i przymocuj je do histologii dnia zerowego, a następnie zamroź dodatkowe fragmenty w celu oczyszczenia RNA.

Użyj pozostałych kawałków tkanki do hodowli. Przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego do końcowego mycia tkanek i przygotowania hodowli. Zdezynfekuj zapasy 70% etanolem przed umieszczeniem ich w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Przenieś wszystkie fragmenty kory jajnikowej przeznaczone do hodowli do komory bezpieczeństwa biologicznego i umyj je jeszcze raz na szalce Petriego wypełnionej LB-15. Odpipetować 350 mikrolitrów pożywki Waymouth na dołek do 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umieść niepowlekane wkładki do studzienek hodowlanych w każdym dołku za pomocą kleszczy, upewniając się, że pod podstawą wkładki nie tworzą się pęcherzyki.

Ostrożnie i delikatnie umieść cztery kawałki kory jajnika na siatce każdej wkładki, nie nakłuwając siatki. Inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmieniaj pożywkę hodowlaną kory jajników codziennie przez siedem dni, upewniając się, że używasz wstępnie podgrzanego podłoża Waymouth.

Podczas zmiany pożywki użyj kleszczyków, aby delikatnie wyjąć wkładkę ze studzienki i zebrać pożywkę Waymouth w probówkach o pojemności 0,5 mililitra. Umieść wkładkę z powrotem w studzience i dodaj 350 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej, dozując ją między bok wkładu a studzienkę. Pobraną pożywkę z kultury tkankowej należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po siedmiu dniach hodowli zobrazuj fragmenty kory jajnika za pomocą mikroskopu preparacyjnego z dołączoną kamerą i komputerowym oprogramowaniem do obrazowania. Utrwal dwa kawałki kory jajnika na studzienkę w roztworze Bouina do histologii i błyskawicznie zamroź fragmenty kory jajnika w ciekłym azocie, aby uzyskać RNA dla cDNA. Powtórz ten krok dla wszystkich studzienek z tkanką, a następnie zbierz podłoże z siódmego dnia i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni.

Pozostaw kawałki kory jajnika zanurzone w roztworze Bouina przez około 1,5 godziny, a następnie umyj je trzykrotnie 70% etanolem, utrzymuj tkankę w 70% etanolu i czyść ją codziennie, aż roztwór przestanie być żółty. Barwienie hematoksyliną i eozyną wykonano dla pęcherzyków pierwotnych, wczesnych pęcherzyków pierwotnych, pęcherzyków pierwotnych, pęcherzyków pierwotnych, pęcherzyków wtórnych i pęcherzyków antralnych. Ocenę stopnia zaawansowania pęcherzyków jajnikowych przeprowadzono na korze jajnika utrwalonej przed i po posiewie w celu oceny folikulogenezy.

Różnica w morfologii określona przez odkładanie się kolagenu może wskazywać na zwłóknienie kory jajnika u jałówek schodkowych lub kontrolnych. Przedstawiono porównanie średniej powierzchni czerwonego dodatniego zabarwienia pikrosiriusa na korę jajnika wypełnioną między jałówkami kontrolnymi i schodkami. Codzienny zbiór pożywki hodowlanej łączono w ciągu trzech dni w celu oceny zróżnicowanej produkcji hormonów steroidowych za pomocą testu radioimmunologicznego.

Metabolity steroidowe i produkcję cytokin mierzono również w pożywce hodowlanej kory jajnikowej z jednego dołka dla każdego zwierzęcia połączonego przez cztery dni hodowli. Im dłużej tkanka pozostaje, tym trudniej może być z nią pracować. Być może będziesz musiał poćwiczyć precyzyjne cięcia.

Technika ta jest stosowana do zrozumienia wpływu na szlaki transdukcji sygnału, w celu uratowania nadmiernej steroidogenezy, określenia wpływu nadmiaru steroidów na produkcję cytokin i chemokin oraz do określenia wpływu na progresję pęcherzyków lub zatrzymanie w tkance jajnika.