Name: Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj metodę komplementacji rozszczepionej lucyferazy do badania interakcji białek błonowych typu III w komórkach ssaczych. Technika umożliwia wykrywanie związków przy niskich poziomach ekspresji bez szkodliwego wpływu na komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem nr 2016/23/D/NZ3/01314 z Narodowego Centrum Nauki (NCN), Kraków, Polska.

1. Generowanie plazmidów ekspresyjnych
<ol>
	<li>Zbadaj topologię błony białek będących przedmiotem zainteresowania za pomocą narzędzia do przewidywania topologii.</li>
	<li>Zaprojektuj strategię klonowania tak, aby większe i mniejsze fragmenty były zwrócone w stronę cytoplazmy po wprowadzeniu białek fuzyjnych do błon Golgiego. Jeśli, tak jak w przedstawionym tutaj przypadku, zarówno N-, jak i C-końce interesujących białek są zorientowane cytoplazmatycznie, oznacz białka na osiem możliwych sposobów (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Jeśli N- lub C-koniec jednego lub obu białek będących przedmiotem zainteresowania jest zorientowany świetliście, należy wykluczyć go z tagowania.</li>
	<li>Subklonować interesujące nas geny do odpowiednich wektorów ekspresyjnych (patrz Spis materiałów), postępując zgodnie ze standardowymi protokołami klonowania. 
	UWAGA: Zaleca się przetestowanie wszystkich możliwych orientacji, ponieważ niektóre opcje oznaczania mogą nie działać z powodu niewystarczającej bliskości, nieoptymalnej orientacji lub ograniczeń przestrzennych.</li>
</ol>
2. Przejściowa transfekcja plazmidów ekspresyjnych do komórek
<ol>
	<li>Zbierz przylegający HEK293T hodowli komórkowej przez trypsynizację i ponownie zawieś komórki w dedykowanej kompletnej pożywce wzrostowej. Umieść komórki (2 x 104/100 μl/dołek) na przezroczystej, białej płytce 96-dołkowej. Dostosuj całkowitą liczbę studzienek, aby pomieścić wszystkie badane kombinacje i kontrole, w tym kontrpróby. 
	UWAGA: Staraj się używać tylko wewnętrznych 60 dołków płyty, aby zminimalizować przesunięcia termiczne i uniknąć parowania przez noc. Zdecydowanie zaleca się stosowanie płytek pokrytych poli-D-lizyną, takich jak te wskazane w Tabeli Materiałów, w przeciwnym razie komórki mogą się oderwać podczas kolejnych etapów mycia.</li>
	<li>Hodować komórki przez noc w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Następnego dnia należy przetoczyć transfekcję komórek pożądanymi kombinacjami plazmidów ekspresyjnych otrzymanych w punkcie 1.1.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć plazmidy ekspresyjne w podłożu bez surowicy (patrz tabela materiałów) do 6,25 ng / μl dla każdego konstruktu.</li>
		<li>Dodać odczynnik do transfekcji na bazie lipidów w odpowiednim stosunku lipidów do DNA i inkubować zgodnie z instrukcją producenta.</li>
		<li>Dodać 8 μl mieszaniny lipid:DNA do wyznaczonych studzienek. Wymieszaj zawartość talerza, delikatnie obracając. Powoduje to transfekcję obu konstruktów ekspresji przy 50 ng/dołku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodować komórki przez 20-24 godziny w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2 ). 
	UWAGA: Hodowla komórek przez dłuższy czas może skutkować wyższymi poziomami ekspresji białka fuzyjnego, co może sprzyjać niespecyficznemu skojarzeniu między fragmentami.</li>
</ol>
3. Średnia wymiana
<ol>
	<li>Następnego dnia zastąp kondycjonowaną pożywkę 100 μl pożywki wolnej od surowicy w każdym dołku. Upewnij się, że ogniwa nie odczepiły się po wymianie nośnika. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać 2-3 godziny przed dodaniem roztworu roboczego furimazyny. Odstawienie surowicy minimalizuje tło spowodowane autoluminescencją furimazyny.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworu roboczego furimazyny
<ol>
	<li>Tuż przed pomiarem zmieszać 1 objętość furimazyny z 19 objętościami buforu rozcieńczającego (rozcieńczenie 20-krotne). 
	UWAGA: Całkowita objętość roztworu roboczego furimazyny, który ma być przygotowany, zależy od liczby pojedynczych studzienek, które mają być analizowane (roztwór roboczy furimazyny dodaje się do pożywki do hodowli komórkowych w stosunku 1:5, dlatego do każdej studzienki uprzednio wypełnionej 100 μl pożywki bez surowicy należy dodać 25 μl roztworu roboczego furimazyny).</li>
	<li>Dodać roztwór roboczy furimazyny do wyznaczonych studzienek (25 μl/studzienkę). Delikatnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej (np. 15 s przy 300-500 obr./min).</li>
</ol>
5. Pomiar luminescencji
<ol>
	<li>Włóż płytkę do czytnika mikropłytek luminescencyjnych.
	<ol>
		<li>W przypadku doświadczeń, które mają być przeprowadzone w temperaturze 37 °C, należy zrównoważyć płytkę przez 10-15 minut we wskazanej temperaturze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz studnie, które mają zostać przeanalizowane.</li>
	<li>Odczyt luminescencji z czasem integracji 0,3 s. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie luminescencji przez maksymalnie 2 godziny.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczyć wartości średnie i odchylenia standardowe dla wszystkich badanych i kontrolnych kombinacji.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA z wieloma porównaniami.</li>
	<li>Obliczyć wartości zmiany krotności, dzieląc średnią luminescencję uzyskaną dla interesujących kombinacji przez średnią luminescencję uzyskaną dla odpowiednich kontroli ujemnych. Oceń wyniki. 
	UWAGA: Proponowane tu podejście do analizy danych zakłada, że oddziaływanie można stwierdzić, jeśli luminescencja uzyskana dla badanej kombinacji jest statystycznie istotnie wyższa od luminescencji uzyskanej dla odpowiedniej kombinacji kontrolnej i jednocześnie stosunek tych dwóch wartości przekracza 10.</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li>
<li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li>
<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
<li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li>
<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół umożliwiający wykazanie heterologicznych kompleksów utworzonych między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego, takimi jak NST, przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Proponowane podejście do analizy i interpretacji danych polega na powiązaniu luminescencji uzyskanej dla interesującej nas kombinacji białek z luminescencją uzyskaną dla odpowiedniej kombinacji kontrolnej, która składa się z jednego z białek będących przedmiotem zainteresowani...

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół sprawdzający obecność heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego w przejściowo transfekowanych komórkach ludzkich przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Procedura została najszerzej przetestowana pod kątem nukleotydowych transporterów cukrów (NST), ale udało nam się również uzyskać pozytywne wyniki dla innych białek błonowych typu III rezydujących w Golgiego, których N- i/lub C-końce są skierowane w stronę cytoplazmy.
Nasza grupa badawcza bada rolę NST w glikozylacji makromolekuł. NST to białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego i/lub ER z końcami N i C skierowanymi w stronę cytoplazmatyczną błony organellarnej1. Uważa się, że NST przenoszą cukry aktywowane nukleotydami przez błony organelli, aby dostarczać glikozylotransferazy wraz z ich substratami. NST tworzą dimery i/lub wyższe oligomery2,3,4,5,6,7,8,9,10. Co więcej, odnotowano również heterologiczne interakcje między różnymi NST6,11. Wykazano również, że NST tworzą kompleksy z funkcjonalnie powiązanymi enzymami glikozylacji12,13,14. Szukaliśmy alternatywy dla obecnie stosowanej techniki, podejścia FRET opartego na obrazowaniu czasu życia fluorescencji (FLIM), do badania interakcji NST i funkcjonalnie powiązanych białek rezydentnych Golgiego, więc zdecydowaliśmy się przetestować test komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Pozwoliło nam to zidentyfikować nową interakcję między NST a funkcjonalnie powiązanym enzymem glikozylacji9.
Najnowsza modyfikacja testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy, NanoBiT, jest używana w protokole przedstawionym tutaj15. Polega ona na odtworzeniu enzymu lucyferazy (np. NanoLuc) z dwóch fragmentów - dużego, określanego jako duży BiT lub LgBiT, białko o masie 17,6 kDa, i mały, złożony tylko z 11 aminokwasów, określany jako mały BiT lub SmBiT. Dwa interesujące białka są łączone z komplementarnymi fragmentami i ulegają przejściowej ekspresji w ludzkiej linii komórkowej. Jeśli te dwa białka fuzyjne oddziałują na siebie, luminescencja jest wytwarzana in situ po dodaniu substratu przepuszczalnego dla komórek. Te dwa fragmenty zostały zoptymalizowane tak, aby kojarzyły się z minimalnym powinowactwem, chyba że zostaną połączone przez interakcję między białkami będącymi przedmiotem zainteresowania, z którymi są połączone.
Ogólnie rzecz biorąc, metody oparte na bioluminescencji mają pewne zalety w porównaniu z tymi opartymi na fluorescencji. Sygnały bioluminescencyjne mają wyższy stosunek sygnału do szumu, ponieważ luminescencja tła jest znikoma w porównaniu z sygnałem pochodzącym z lucyferazy16. W przeciwieństwie do tego, podejścia oparte na fluorescencji zwykle cierpią ze względu na stosunkowo wysokie tło spowodowane zjawiskiem autofluorescencji. Poza tym bioluminescencja jest mniej szkodliwa dla analizowanych komórek niż fluorescencja, ponieważ w pierwszym przypadku nie ma potrzeby wzbudzania próbki. Z tych powodów bioluminescencyjne podejścia do badania IPP in vivo konkurują z powszechnie stosowanymi metodami fluorescencyjnymi, takimi jak Förster Resonance Energy Transfer (FRET) lub Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Nasz protokół opiera się na odnoszeniu luminescencji uzyskanej dla interesującej nas kombinacji białek do luminescencji uzyskanej dla kombinacji kontrolnej. Do tych ostatnich zalicza się jedno z badanych białek, które jest połączone z większym fragmentem oraz białko kontrolne (np. HaloTag), połączone z mniejszym fragmentem. To ostatnie jest białkiem pochodzenia bakteryjnego, od którego nie oczekuje się, że będzie wchodzić w interakcje z żadnym z białek ssaków. Użycie tego białka jako kontroli stwarza ograniczenia dla topologii par białek rezydujących w Golgiego, które mają być analizowane. Ponieważ w komórkach ssaków białko to jest syntetyzowane w cytoplazmie, oba interesujące białka powinny mieć co najmniej jeden ogon cytoplazmatyczny.
To podejście może być szczególnie przydatne do wstępnego badania IPP. Może stać się metodą z wyboru, gdy białka fuzyjne będące przedmiotem zainteresowania ulegają ekspresji na poziomach, które są po prostu niewystarczające do zastosowania innych podejść. Podobnie, test komplementacji rozszczepionej lucyferazy może być najlepszą opcją, jeśli interesujące białka ulegają ekspresji na wysokich poziomach, ale wpływa to niekorzystnie na ich lokalizację subkomórkową lub jest znane z wymuszania interakcji niespecyficznych. Ponieważ mniejszy fragment ma tylko 11 aminokwasów, test komplementacji rozszczepionej lucyferazy może być zastosowany, gdy użycie większych znaczników jest niemożliwe. Wreszcie, można go wykorzystać do dalszego potwierdzania danych uzyskanych za pomocą innych technik, jak w przedstawionym tu przypadku.

<table><tbody><tr><td>0,25% roztwór</td><td></td><td></td><td></td>trypsyny-EDTA</tr><tr><td>Przylegająca linia</td><td></td><td></td><td></td>komórkowa ssaków</tr><tr><td>BioCoat Poli-D-Lizyna 96-dołkowa biała/przezroczysta płaska płytka z płaskim dnem Mikropłytka poddana działaniu TC, z pokrywką</td><td>Corning</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>do hodowli komórkowych</tr><tr><td>Suplementy do hodowli komórkowych (inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, L-glutamina, penicylina, streptamycyna)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td>CO2</tr><tr><td>Plazmidy ekspresyjne kodujące interesujące białka nieoznaczone fragmentami NanoBiT Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do transfekcji FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Microplate Reader (lub inny czytnik mikropłytek luminescencyjnych)</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa dedykowana do zastosowanej</td><td></td><td></td><td></td>linii komórkowej</tr><tr><td>Materiały i odczynniki do standardowego klonowania molekularnego (bakterie, polimeraza termostabilna, enzymy restrykcyjne, ligaza DNA, materiały i odczynniki do oczyszczania kwasów nukleinowych)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System startowy NanoBiT MCS</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>Zestaw ten zawiera wektory umożliwiające znakowanie badanych białek fragmentami NanoBiT w różnych orientacjach, a także plazmid kontrolny kodujący białko HaloTag połączone z SmBiT i parą plazmidów kontroli pozytywnej.</td></tr><tr><td>Nano-Glo Live Cell Assay System</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>Zestaw zawiera furimazynę, która jest substratem umożliwiającym detekcję aktywności NanoLuc w żywych komórkach oraz dedykowany bufor do rozcieńczania.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Oribital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych (np. GraphPad Prism)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu iii rezydujące w golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

Celem tego protokołu jest zbadanie możliwości zastosowania najnowszego wariantu komplementacji rozszczepionej lucyferazy do zademonstrowania heterologicznych kompleksów tworzonych przez nukleotydowe transportery cukru (NST). Te wielobłonowe białka rezydujące w ER i Golgiego przenoszą cytoplazmatycznie syntetyzowane cukry nukleotydowe przez błony organelli, aby dostarczyć enzymy, które pośredniczą w glikozylacji z ich substratami. NST występują jako dimery i/lub wyższe oligomery. Zgłaszano również heterologiczne interakcje między różnymi NST. Aby sprawdzić, czy technika ta nadaje się do badania zjawiska heteromeryzacji NST, przetestowaliśmy ją w porównaniu z kombinacją dwóch NST rezydentnych przez Golgiego, które, jak wykazano wcześniej, łączą się na kilka innych sposobów. Test komplementacji lucyferazy wydaje się być szczególnie odpowiedni do badania interakcji między białkami błonowymi rezydującymi w Golgiego, ponieważ nie wymaga wysokich poziomów ekspresji, które często powodują błędną lokalizację białek i zwiększają ryzyko wyników fałszywie dodatnich.

Aby uzyskać najbardziej wiarygodne dane w tym podejściu, należy przetestować wszystkie możliwe kombinacje (patrz Rycina 1). Równolegle należy uwzględnić kontrole pozytywne i negatywne. Kontrola pozytywna powinna składać się z dwóch białek, o których wiadomo, że oddziałują ze sobą, z czego jedno jest połączone z większym fragmentem, a drugie z mniejszym fragmentem. Kontrola negatywna w idealnym przypadku powinna składać się z dwóch nieoddziałujących ze sobą białek błonowych typu III, oznaczon...

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie występowania heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego z cytoplazmatycznie eksponowanymi N- i/lub C-końcami w żywych komórkach ssaków przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy.

Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Nasz protokół pozwala na identyfikację i analizę interakcji między wielobłonowymi białkami retikulum endoplazmatycznego i kompleksu Golgiego w żywych komórkach przy niskich poziomach ekspresji. Główną zaletą tej techniki jest jej specjalna wrażliwość, która pozwala uniknąć wysokich poziomów nadmiernej ekspresji, które często są szkodliwe dla zdrowia komórek i mogą zaburzać lokalizację subkomórkową białek. Zbierz przylegającą hodowlę komórek T HEK293 przez trypsynizację i ponownie zawiesić komórki w dedykowanej kompletnej pożywce wzrostowej.Umieść komórki na przezroczystej, białej, 96-dołkowej płytce po białej stronie. Dostosuj całkowitą liczbę studzienek, aby pomieścić wszystkie badane kombinacje i kontrole, w tym kontrpróby. Następnie hoduj komórki przez noc w standardowych warunkach.Następnego dnia należy przetransfekować komórki pożądanymi kombinacjami plazmidów ekspresyjnych. Rozcieńczyć plazmidy w podłożu bez surowicy do 6,25 nanograma na mikrolitr dla każdego konstruktu i dodać odczynnik do transfekcji na bazie lipidów. Dodaj odpowiedni stosunek lipidów do DNA.Inkubuj plazmidy zgodnie z instrukcją producenta. Następnie dodaj osiem mikrolitrów mieszaniny lipidowego DNA do wyznaczonych studzienek. Wymieszaj zawartość płytki z delikatnym obracaniem i hoduj komórki przez 20 do 24 godzin w standardowych warunkach.Następnego dnia zastąp kondycjonowaną pożywkę w każdej studzience 100 mikrolitrami pożywki bez surowicy, upewniając się, że komórki nie odczepiają się po wymianie pożywki. Tuż przed pomiarem luminescencji należy zmieszać jedną objętość furimazyny z 19 objętościami buforu rozcieńczającego. Dodaj 25 mikrolitrów roztworu roboczego furimazyny do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej.Włóż płytkę do czytnika mikropłytek luminescencyjnych i równoważ płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Wybierz studzienki do analizy i odczytaj luminescencję z czasem całkowania 0,3 sekundy. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie luminescencji przez maksymalnie dwie godziny.Protokół ten został przetestowany na dwóch nukleotydowych transporterach cukru, SLC35A2 i SLC35A3, które są białkami błonowymi typu trzeciego rezydującymi w Golgiego z końcami N i C skierowanymi w stronę cytoplazmy. Istniało osiem możliwych opcji znakowania, a powstałe białka fuzyjne można było zestawić ze sobą na osiem możliwych sposobów. Poniżej przedstawiono średnie względne jednostki luminescencji lub wartości RLU odpowiadające wszystkim badanym kombinacjom i kombinacjom kontrolnym.Wartości RLU uzyskane dla trzech kombinacji były znacznie wyższe niż te uzyskane dla odpowiedniej kombinacji kontrolnej. Aby uzyskać wartości współczynników dla interesujących nas kombinacji, wartości RLU podzielono przez wartości RLU uzyskane dla odpowiednich kontrol. Współczynniki od 10 do 1000 w dużym stopniu wskazują na określone interakcje.Istniały dwie takie kombinacje wspierające ideę, że SLC35A2 i SLC35A3 oddziałują na siebie. Aby potwierdzić te dane, SLC35A2 lub SLC35A3 oznaczone HA uległy jednoczesnej ekspresji z kombinacją, która skutkowała najwyższą luminescencją względną. Do kotransfekcji użyto różnych ilości plazmidów i kodujących wariantów NST znakowanych HA, co spowodowało statystycznie istotny spadek wartości RLU zależny od dawki.Najważniejszą rzeczą jest zajęcie się własnym zainteresowaniem białkiem na wszystkie możliwe sposoby i przetestowanie wszystkich możliwych kombinacji, ponieważ pewna orientacja tagowania może dać fałszywie ujemne wyniki. Po wybraniu najbardziej efektywnej kombinacji można monitorować dynamikę odpowiedniej interakcji, na przykład w celu zidentyfikowania czynników lub warunków, które z czasem zakłócają działanie kompleksu zainteresowań.

demonstration-heterologous-complexes-formed-golgi-resident-type-iii

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Opisano wydajną procedurę oceny tendencji do oligomeryzacji pojedynczych domen transbłonowych (TMD). Białka chimeryczne, składające się z TMD połączonej z ToxR, są eksprymowane w szczepie reporterowym E. coli. Indukowana przez TMD oligomeryzacja powoduje dimeryzację ToxR, aktywację transkrypcji i produkcję białka reporterowego, -galaktozydazy.

Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Ten film demonstruje test komplementacji rozszczepionej lucyferazy w celu wykrycia interakcji białko-białko. W tym teście interesujące białka są oznaczane do małych i dużych fragmentów enzymu lucyferazy. Kiedy białka wchodzą w interakcję, duże i małe fragmenty łączą się, tworząc aktywny kompleks enzymatyczny, który w obecności określonego substratu uwalnia jasną luminescencję, którą można zmierzyć.

Test dzielonej komplementacji lucyferazy w celu identyfikacji specyficznych interakcji białko-białko

Precyzyjna lokalizacja mieszkańców Golgi jest kluczowa dla zrozumienia funkcji komórkowych Golgiego. Jednak konwencjonalna mikroskopia optyczna nie jest w stanie rozstrzygnąć struktury sub-Golgiego. Tutaj opisujemy protokół dla konwencjonalnej metody superrozdzielczości opartej na mikroskopii, mającej na celu ilościowe określenie sub-Golgiego lokalizacji białka.

Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tutaj prezentujemy biosensor oparty na lucyferazie, który pozwala określić ilościowo aktywność kinazy dużego supresora nowotworów (LATS) - centralnej kinazy w szlaku sygnałowym Hippo. Ten bioczujnik ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych mających na celu zbadanie regulatorów szlaku hipopotama in vitro i in vivo.

Monitorowanie aktywności szlaku sygnałowego hipopotama za pomocą biosensora LATS (Large Tumor Suppressor) opartego na lucyferazie

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Poznaj metodę komplementacji rozszczepionej lucyferazy do badania interakcji białek błonowych typu III w komórkach ssaczych. Technika umożliwia wykrywanie związków przy niskich poziomach ekspresji bez szkodliwego wpływu na komórki.

Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal

Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów