Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy
10 września 2020
Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie występowania heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego z cytoplazmatycznie eksponowanymi N- i/lub C-końcami w żywych komórkach ssaków przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy.
Nasz protokół pozwala na identyfikację i analizę interakcji między wielobłonowymi białkami retikulum endoplazmatycznego i kompleksu Golgiego w żywych komórkach przy niskich poziomach ekspresji. Główną zaletą tej techniki jest jej specjalna wrażliwość, która pozwala uniknąć wysokich poziomów nadmiernej ekspresji, które często są szkodliwe dla zdrowia komórek i mogą zaburzać lokalizację subkomórkową białek. Zbierz przylegającą hodowlę komórek T HEK293 przez trypsynizację i ponownie zawiesić komórki w dedykowanej kompletnej pożywce wzrostowej.
Umieść komórki na przezroczystej, białej, 96-dołkowej płytce po białej stronie. Dostosuj całkowitą liczbę studzienek, aby pomieścić wszystkie badane kombinacje i kontrole, w tym kontrpróby. Następnie hoduj komórki przez noc w standardowych warunkach.
Następnego dnia należy przetransfekować komórki pożądanymi kombinacjami plazmidów ekspresyjnych. Rozcieńczyć plazmidy w podłożu bez surowicy do 6,25 nanograma na mikrolitr dla każdego konstruktu i dodać odczynnik do transfekcji na bazie lipidów. Dodaj odpowiedni stosunek lipidów do DNA.
Inkubuj plazmidy zgodnie z instrukcją producenta. Następnie dodaj osiem mikrolitrów mieszaniny lipidowego DNA do wyznaczonych studzienek. Wymieszaj zawartość płytki z delikatnym obracaniem i hoduj komórki przez 20 do 24 godzin w standardowych warunkach.
Następnego dnia zastąp kondycjonowaną pożywkę w każdej studzience 100 mikrolitrami pożywki bez surowicy, upewniając się, że komórki nie odczepiają się po wymianie pożywki. Tuż przed pomiarem luminescencji należy zmieszać jedną objętość furimazyny z 19 objętościami buforu rozcieńczającego. Dodaj 25 mikrolitrów roztworu roboczego furimazyny do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
Włóż płytkę do czytnika mikropłytek luminescencyjnych i równoważ płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Wybierz studzienki do analizy i odczytaj luminescencję z czasem całkowania 0,3 sekundy. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie luminescencji przez maksymalnie dwie godziny.
Protokół ten został przetestowany na dwóch nukleotydowych transporterach cukru, SLC35A2 i SLC35A3, które są białkami błonowymi typu trzeciego rezydującymi w Golgiego z końcami N i C skierowanymi w stronę cytoplazmy. Istniało osiem możliwych opcji znakowania, a powstałe białka fuzyjne można było zestawić ze sobą na osiem możliwych sposobów. Poniżej przedstawiono średnie względne jednostki luminescencji lub wartości RLU odpowiadające wszystkim badanym kombinacjom i kombinacjom kontrolnym.
Wartości RLU uzyskane dla trzech kombinacji były znacznie wyższe niż te uzyskane dla odpowiedniej kombinacji kontrolnej. Aby uzyskać wartości współczynników dla interesujących nas kombinacji, wartości RLU podzielono przez wartości RLU uzyskane dla odpowiednich kontrol. Współczynniki od 10 do 1000 w dużym stopniu wskazują na określone interakcje.
Istniały dwie takie kombinacje wspierające ideę, że SLC35A2 i SLC35A3 oddziałują na siebie. Aby potwierdzić te dane, SLC35A2 lub SLC35A3 oznaczone HA uległy jednoczesnej ekspresji z kombinacją, która skutkowała najwyższą luminescencją względną. Do kotransfekcji użyto różnych ilości plazmidów i kodujących wariantów NST znakowanych HA, co spowodowało statystycznie istotny spadek wartości RLU zależny od dawki.
Najważniejszą rzeczą jest zajęcie się własnym zainteresowaniem białkiem na wszystkie możliwe sposoby i przetestowanie wszystkich możliwych kombinacji, ponieważ pewna orientacja tagowania może dać fałszywie ujemne wyniki. Po wybraniu najbardziej efektywnej kombinacji można monitorować dynamikę odpowiedniej interakcji, na przykład w celu zidentyfikowania czynników lub warunków, które z czasem zakłócają działanie kompleksu zainteresowań.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje występowanie heterologicznych oddziaływań między białkami błonowymi typu III zlokalizowanymi w aparacie Golgiego o końcach wystających do cytoplazmy w żywych komórkach ssaków, przy użyciu czułego testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Metoda ta pozwala na identyfikację oddziaływań przy niskich poziomach ekspresji, co minimalizuje zaburzenia stanu zdrowia komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Interakcje białkowe
- Biologia błon
Wstęp
- Skupienie się na oddziaływaniach między białkami wieloprzeponowymi.
- Dążenie do oceny oddziaływań białkowych bez szkodliwych efektów wynikających z nadekspresji.
- Wykorzystanie kompleksu Golgiego i retikulum endoplazmatycznego jako systemów biologicznych.
Zastosowane metody
- Test komplementacji rozdzielonej lucyferazy
- Kultura ludzkich komórek HEK293 T
- Transfekcja plazmidów ekspresyjnych
Główne wyniki
- Identyfikacja istotnych oddziaływań między SLC35A2 a SLC35A3.
- Wartości RLU wskazały na specyficzne oddziaływania, przy czym stosunki od 10 do 1000 sugerowały silne interakcje.
- Potwierdzenie oddziaływań poprzez koekspresję z tagiem HA oraz analizy zależne od dawki.
Wnioski
- Badanie w sposób skuteczny wyjaśnia oddziaływania białek błonowych w żywych komórkach.
- Stanowi ono wartościową metodę badania relacji między białkami w biologii komórki.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wykazanie obecności kompleksów heterologicznych wśród białek błonowych typu III zlokalizowanych w aparacie Golgiego pozwala rozwiązać kluczowy problem walidacji celów w badaniach nad oddziaływaniami białek błonowych. Test komplementacji rozdzielonej lucyferazy umożliwia czułą detekcję przy niskich poziomach ekspresji, co ogranicza powstawanie artefaktów wynikających z nadekspresji i zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkryć. Możliwość ta usprawnia de-risking mechanistyczny i dostarcza informacji niezbędnych do selekcji celów w portfolio białek błonowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę oddziaływań białko-białko w żywych komórkach przy fizjologicznych poziomach ekspresji.
- Wspiera walidację funkcjonalną kompleksów białek błonowych zaangażowanych w szlaki glikozylacji.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną poprzez odróżnienie specyficznych oddziaływań heteromerycznych od szumu tła.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy wyborze białek błonowych jako celów do dalszego rozwoju.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ilościowy, powtarzalny odczyt (RLU) siły oddziaływania między parami białek.
- Umożliwia systematyczną ocenę orientacji znaczników w celu zminimalizowania wyników fałszywie ujemnych podczas opracowywania testu.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testu w celu przesiewania modulatorów oddziaływań białkowych.
- Umożliwia wiarygodne określanie punktów odniesienia dla wydajności testu przy użyciu kombinacji kontrolnych i eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie oddziaływań w komórkach ssaków.
- Umożliwia monitorowanie złożonej dynamiki w różnych warunkach, wspierając poszukiwanie translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu mapowania oddziaływań w fazie odkrycia po przedkliniczną walidację funkcji białek błonowych.
- Wspiera podejmowanie decyzji o rozwoju programów celowanych w białka błonowe w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy test komplementacji rozszczepionej lucyferazy wpisuje się w kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając solidną walidację celu oraz opracowanie testów dla kompleksów białek błonowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących tworzenia się kompleksów białkowych oraz mapowania szlaków w żywych komórkach.
- Screening: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki luminescencji do porównywania siły oddziaływań w różnych warunkach.
- Analityka: Umożliwia analizę statystyczną stosunków RLU w celu odróżnienia specyficznych oddziaływań od kontroli.
- Badania translacyjne: Ułatwia monitorowanie dynamiki oddziaływań w odpowiedzi na zaburzenia, co dostarcza informacji dla strategii poszukiwania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do badania różnorodnych oddziaływań białek błonowych w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji białek błonowych jako celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność analiz w celu wdrożenia przez wiele zespołów.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez minimalizację wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w postaci białek błonowych do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy z zakresu biologii białek błonowych oraz projektowania testów na żywych komórkach.
- Wymagany jest dostęp do czytników płytek luminescencyjnych oraz infrastruktury do hodowli komórkowej.
- Wymagane jest rygorystyczne zaprojektowanie kontroli oraz systematyczna ocena orientacji znaczników.
- Może być konieczna adaptacja metody dla różnych linii komórkowych lub klas białek błonowych.
- Fałszywie ujemne wyniki mogą wystąpić, jeśli oznakowanie zaburzy funkcję lub lokalizację białka.
