Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

Metoda ta identyfikuje żywe mikroorganizmy spojówek oka, co jest wyzwaniem ze względu na nieprzyjazne środowisko oczu. Może pomóc odpowiedzieć na pytanie, czy istnieje mikrobiom oka i jak zmienia się obecność bakterii w chorobach oczu. W przeciwieństwie do sekwencjonowania DNA, które identyfikuje zarówno żywotne, jak i nieżywotne mikroorganizmy, ta metoda identyfikuje tylko żywotne mikroorganizmy, co pozwala lepiej zrozumieć społeczność komensalną oka.

Badania sugerują, że trudne do zdiagnozowania choroby oczu, takie jak nieautoimmunologiczny i autoimmunologiczny suchy oko, mają unikalną obecność bakterii ocznych. Metoda ta może być stosowana do diagnozowania chorób oczu z charakterystycznymi sygnaturami mikrobiologicznymi. Zacznij od autoklawowania odpowiedniej ilości waty bawełnianej i wykałaczek dla liczby myszy, które mają zostać pobrane, a następnie ściśnij 1/2 centymetrowego kawałka bawełny i wysusz go, ciągnąc za krawędzie, aby utworzyć płaską, pojedynczą porowatą warstwę, zatrzymując się tuż przed rozpadnięciem się mrugnięcia.

Zakręć mrugnięciem wokół jednego z ostrych końców wykałaczki, lekko przytrzymując rozciągnięty kawałek na końcówce wykałaczki, gdy jest skręcony. Gotowy wacik do oczu będzie miał bardzo cienką warstwę bawełny rozciągniętą na końcówce, rozciągającą się około 1/2 do jednego centymetra od końcówki. Włóż waciki do małej zlewki wacikiem do dołu, a następnie przykryj je i zautoklawuj.

Oczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym, aby zminimalizować zanieczyszczenie i wlej 0,5 mililitra sterylnego naparu do serca mózgu lub pożywki BHI do oznakowanych 1,5 mililitrowych sterylnych mikroprobówek wirówkowych. Zakryj probówki w stojaku i połóż stojak na lodzie. Ustaw przepływ pracy od lewej do prawej, zaczynając od stacji znieczulającej myszy, która zawiera klatkę z eksperymentalnymi myszami, pustą sterylną klatkę, znieczulenie w temperaturze pokojowej, igłę o rozmiarze 25 i strzykawkę o pojemności jednego mililitra.

Następnie przygotuj stację do pobierania wymazów z oczu, która zawiera porcjowane BHI na lodzie, wysterylizowane wymazy z oczu, smarujące krople do oczu, pojemnik na zagrożenie biologiczne, czyste ręczniki papierowe i spray 70% izopropanolu. Na koniec ustaw stację galwaniczną z płytkami agarowymi do krwi o temperaturze pokojowej, pipetą o pojemności 10 mikrolitrów, sterylnymi jednorazowymi końcówkami o pojemności 10 mikrolitrów i pojemnikiem na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając podkładkę pod tylną stopę.

Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma ruchu. Przypisz jedną rękę do obsługi znieczulonych myszy, a drugą do obsługi wymazu z oka i hodowli. Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na powierzchni roboczej umieszczonej na boku z odsłoniętym lewym okiem.

Spryskaj dłonie w rękawiczkach izopropanolem i osusz je ręcznikiem papierowym. Odkręć oznaczoną mikroprobówkę wirówkową BHI za pomocą dedykowanej ręki do obsługi pożywek i umieść obie z powrotem w stojaku. Zanurz pokrytą bawełną końcówkę wacika do oczu w BHI, a następnie wyjmij wacik z tubki, dwukrotnie obracając końcówką o rurkę wewnętrzną, aby usunąć nadmiar płynu i usunąć go.

Ręką trzymającą mysz delikatnie chwyć mysz za kark. Drugą ręką przyłóż końcówkę wacika do oka na przyśrodkowym obszarze spojówki lewego oka. Lekko wciśnij gałkę oczną i przesuń wacik ruchem mycia okien między dolną powieką a okiem 10 razy, utrzymując stały nacisk.

Nie dotykając sierści, delikatnie zdejmij końcówkę wacika prostopadle do miejsca, w którym została włożona. Umieść wacik bawełnianą stroną do dołu, bezpośrednio w oznakowanej mikroprobówce wirówkowej z pożywką BHI. Nałóż kroplę do oczu na pobrane oczko.

W razie potrzeby zaopatrz się w wymazy ze skóry lub futra do próbek kontrolnych, odpowiednio sterylizując rękawiczki między każdym wacikiem. Po zakończeniu umieść mysz z powrotem w klatce. Pozostaw wacik na 10 do 15 minut na lodzie, a następnie wysterylizuj ręce w rękawiczkach i wyjmij wacik, mieszając końcówkę z podłożem przez 10 obrotów.

Wyjmij wacik, obracając końcówką o wewnętrzną ściankę probówki przez pięć obrotów i wyrzuć go do pojemnika stanowiącego zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces dla każdej myszy. Wzbogać próbkę poprzez statyczną inkubację probówki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Podczas inkubacji oznacz jedną płytkę TSA o temperaturze pokojowej na wymaz z oka myszy lub wacik kontrolny i podziel go na pół. Wyjąć wzbogacone próbki z inkubatora i umieścić je na lodzie. Krótko zawirować próbki, aby je wymieszać, a następnie nanieść 10 mikrolitrów próbki na płytkę TSA i przechylić płytkę, aby utworzyć pasek.

Powtórz to dwa razy. Po drugiej stronie linii podziału płytek utwórz 10 kropek po 10 mikrolitrów próbki każda. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin, dwa dni i cztery dni w czystej komorze, która zapobiega wysychaniu płytek agarowych.

Policz kolonie w paskach. Zwróć uwagę na morfologię i oblicz jednostki tworzące kolonie na wymaz dla morfologicznie podobnych izolatów. Spójrz na kropki, w których unikalne organizmy nie są uchwycone w paskach.

Aby ułatwić wizualizację, gęsto rozsialiśmy bakterie na środkowej i prawej płytce. Zazwyczaj zaobserwowaliśmy znacznie mniej bakterii w płytkach wymazowych z oczu. Należy pamiętać, że czasami wymazy z oczu mogą nie dawać bakterii, które można odzyskać.

Reprezentatywna płytka wymazowa z oka z morfologicznie zróżnicowanymi izolatami od czarnej myszy sześciokątnej C57 jest pokazana tutaj. Dla każdego odrębnego izolatu kolonie zostały policzone w pasie, a względna liczebność została obliczona i wykreślona. W celu charakterystyki mikrobiologicznej bakterie zostały wybrane z indywidualnych płytek wymazowych z oczu myszy, aby wytworzyć główną płytkę TSA.

Kiedy pojawił się wzrost, przeprowadzono dodatkowe testy w celu scharakteryzowania lub zidentyfikowania drobnoustrojów. Płytka wzorcowa została użyta, aby zapewnić wystarczającą ilość inokulum do rozprężenia odpowiednich izolatów. Aby zidentyfikować izolaty, płytkę TSA przesiąknięto i inkubowano przez noc, a następnie przeprowadzono MALDI-TOF MS.

Przykłady pokazanych tutaj izolatów zostały zidentyfikowane jako Streptococcus acidominimus i Aerococcus viridans. Znacząco różne poziomy organizmów komensalnych zostały odzyskane od samców i samic czarnych sześciu myszy C57. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans koaguluje ujemne Staphylococci i E. coli zostały wyizolowane z czarnych sześciu N myszy C57.

Wypróbowując ten protokół, należy pamiętać, że najlepszy wynik zostanie osiągnięty poprzez cienkie pokrycie wacika i poświęcenie czasu na etapie pobierania wymazu z oka. Jeżeli dostęp do MALDI-TOF MS jest ograniczony, izolaty można zidentyfikować za pomocą badań mikrobiologicznych i biochemicznych.