Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy
1 maja 2021
Prezentowany tutaj jest protokół izolacji i amplifikacji tlenowych i fakultatywnych beztlenowych mysich bakterii komensalnych spojówek przy użyciu unikalnego wymazu z oka i etapu wzbogacania opartego na hodowli z późniejszą identyfikacją za pomocą metod mikrobiologicznych i spektrometrii mas MALDI-TOF.
Metoda ta identyfikuje żywe mikroorganizmy spojówek oka, co jest wyzwaniem ze względu na nieprzyjazne środowisko oczu. Może pomóc odpowiedzieć na pytanie, czy istnieje mikrobiom oka i jak zmienia się obecność bakterii w chorobach oczu. W przeciwieństwie do sekwencjonowania DNA, które identyfikuje zarówno żywotne, jak i nieżywotne mikroorganizmy, ta metoda identyfikuje tylko żywotne mikroorganizmy, co pozwala lepiej zrozumieć społeczność komensalną oka.
Badania sugerują, że trudne do zdiagnozowania choroby oczu, takie jak nieautoimmunologiczny i autoimmunologiczny suchy oko, mają unikalną obecność bakterii ocznych. Metoda ta może być stosowana do diagnozowania chorób oczu z charakterystycznymi sygnaturami mikrobiologicznymi. Zacznij od autoklawowania odpowiedniej ilości waty bawełnianej i wykałaczek dla liczby myszy, które mają zostać pobrane, a następnie ściśnij 1/2 centymetrowego kawałka bawełny i wysusz go, ciągnąc za krawędzie, aby utworzyć płaską, pojedynczą porowatą warstwę, zatrzymując się tuż przed rozpadnięciem się mrugnięcia.
Zakręć mrugnięciem wokół jednego z ostrych końców wykałaczki, lekko przytrzymując rozciągnięty kawałek na końcówce wykałaczki, gdy jest skręcony. Gotowy wacik do oczu będzie miał bardzo cienką warstwę bawełny rozciągniętą na końcówce, rozciągającą się około 1/2 do jednego centymetra od końcówki. Włóż waciki do małej zlewki wacikiem do dołu, a następnie przykryj je i zautoklawuj.
Oczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym, aby zminimalizować zanieczyszczenie i wlej 0,5 mililitra sterylnego naparu do serca mózgu lub pożywki BHI do oznakowanych 1,5 mililitrowych sterylnych mikroprobówek wirówkowych. Zakryj probówki w stojaku i połóż stojak na lodzie. Ustaw przepływ pracy od lewej do prawej, zaczynając od stacji znieczulającej myszy, która zawiera klatkę z eksperymentalnymi myszami, pustą sterylną klatkę, znieczulenie w temperaturze pokojowej, igłę o rozmiarze 25 i strzykawkę o pojemności jednego mililitra.
Następnie przygotuj stację do pobierania wymazów z oczu, która zawiera porcjowane BHI na lodzie, wysterylizowane wymazy z oczu, smarujące krople do oczu, pojemnik na zagrożenie biologiczne, czyste ręczniki papierowe i spray 70% izopropanolu. Na koniec ustaw stację galwaniczną z płytkami agarowymi do krwi o temperaturze pokojowej, pipetą o pojemności 10 mikrolitrów, sterylnymi jednorazowymi końcówkami o pojemności 10 mikrolitrów i pojemnikiem na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając podkładkę pod tylną stopę.
Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma ruchu. Przypisz jedną rękę do obsługi znieczulonych myszy, a drugą do obsługi wymazu z oka i hodowli. Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na powierzchni roboczej umieszczonej na boku z odsłoniętym lewym okiem.
Spryskaj dłonie w rękawiczkach izopropanolem i osusz je ręcznikiem papierowym. Odkręć oznaczoną mikroprobówkę wirówkową BHI za pomocą dedykowanej ręki do obsługi pożywek i umieść obie z powrotem w stojaku. Zanurz pokrytą bawełną końcówkę wacika do oczu w BHI, a następnie wyjmij wacik z tubki, dwukrotnie obracając końcówką o rurkę wewnętrzną, aby usunąć nadmiar płynu i usunąć go.
Ręką trzymającą mysz delikatnie chwyć mysz za kark. Drugą ręką przyłóż końcówkę wacika do oka na przyśrodkowym obszarze spojówki lewego oka. Lekko wciśnij gałkę oczną i przesuń wacik ruchem mycia okien między dolną powieką a okiem 10 razy, utrzymując stały nacisk.
Nie dotykając sierści, delikatnie zdejmij końcówkę wacika prostopadle do miejsca, w którym została włożona. Umieść wacik bawełnianą stroną do dołu, bezpośrednio w oznakowanej mikroprobówce wirówkowej z pożywką BHI. Nałóż kroplę do oczu na pobrane oczko.
W razie potrzeby zaopatrz się w wymazy ze skóry lub futra do próbek kontrolnych, odpowiednio sterylizując rękawiczki między każdym wacikiem. Po zakończeniu umieść mysz z powrotem w klatce. Pozostaw wacik na 10 do 15 minut na lodzie, a następnie wysterylizuj ręce w rękawiczkach i wyjmij wacik, mieszając końcówkę z podłożem przez 10 obrotów.
Wyjmij wacik, obracając końcówką o wewnętrzną ściankę probówki przez pięć obrotów i wyrzuć go do pojemnika stanowiącego zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces dla każdej myszy. Wzbogać próbkę poprzez statyczną inkubację probówki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Podczas inkubacji oznacz jedną płytkę TSA o temperaturze pokojowej na wymaz z oka myszy lub wacik kontrolny i podziel go na pół. Wyjąć wzbogacone próbki z inkubatora i umieścić je na lodzie. Krótko zawirować próbki, aby je wymieszać, a następnie nanieść 10 mikrolitrów próbki na płytkę TSA i przechylić płytkę, aby utworzyć pasek.
Powtórz to dwa razy. Po drugiej stronie linii podziału płytek utwórz 10 kropek po 10 mikrolitrów próbki każda. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin, dwa dni i cztery dni w czystej komorze, która zapobiega wysychaniu płytek agarowych.
Policz kolonie w paskach. Zwróć uwagę na morfologię i oblicz jednostki tworzące kolonie na wymaz dla morfologicznie podobnych izolatów. Spójrz na kropki, w których unikalne organizmy nie są uchwycone w paskach.
Aby ułatwić wizualizację, gęsto rozsialiśmy bakterie na środkowej i prawej płytce. Zazwyczaj zaobserwowaliśmy znacznie mniej bakterii w płytkach wymazowych z oczu. Należy pamiętać, że czasami wymazy z oczu mogą nie dawać bakterii, które można odzyskać.
Reprezentatywna płytka wymazowa z oka z morfologicznie zróżnicowanymi izolatami od czarnej myszy sześciokątnej C57 jest pokazana tutaj. Dla każdego odrębnego izolatu kolonie zostały policzone w pasie, a względna liczebność została obliczona i wykreślona. W celu charakterystyki mikrobiologicznej bakterie zostały wybrane z indywidualnych płytek wymazowych z oczu myszy, aby wytworzyć główną płytkę TSA.
Kiedy pojawił się wzrost, przeprowadzono dodatkowe testy w celu scharakteryzowania lub zidentyfikowania drobnoustrojów. Płytka wzorcowa została użyta, aby zapewnić wystarczającą ilość inokulum do rozprężenia odpowiednich izolatów. Aby zidentyfikować izolaty, płytkę TSA przesiąknięto i inkubowano przez noc, a następnie przeprowadzono MALDI-TOF MS.
Przykłady pokazanych tutaj izolatów zostały zidentyfikowane jako Streptococcus acidominimus i Aerococcus viridans. Znacząco różne poziomy organizmów komensalnych zostały odzyskane od samców i samic czarnych sześciu myszy C57. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans koaguluje ujemne Staphylococci i E. coli zostały wyizolowane z czarnych sześciu N myszy C57.
Wypróbowując ten protokół, należy pamiętać, że najlepszy wynik zostanie osiągnięty poprzez cienkie pokrycie wacika i poświęcenie czasu na etapie pobierania wymazu z oka. Jeżeli dostęp do MALDI-TOF MS jest ograniczony, izolaty można zidentyfikować za pomocą badań mikrobiologicznych i biochemicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji i namnażania tlenowych oraz względnie beztlenowych bakterii komensalnych z spojówki myszy. Metoda ta wykorzystuje specjalistyczny wymaz z oka oraz etap wzbogacania w hodowli, a następnie identyfikację z zastosowaniem metod mikrobiologicznych i spektrometrii mas MALDI-TOF.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Okulistyka
- Bakterie komensalne
Wstęp
- Identyfikacja żywych mikroorganizmów spojówki oka jest trudna ze względu na nieprzyjazne środowisko oka.
- Niniejsza metoda koncentruje się na mikroorganizmach żywych, zapewniając lepsze zrozumienie wspólnoty komensali ocznych.
- Unikalne sygnatury bakteryjne mogą być powiązane z trudnymi do zdiagnozowania chorobami oczu.
- Metoda ta różni się od sekwencjonowania DNA, które wykrywa zarówno mikroorganizmy żywe, jak i nieżywe.
Cel badania
- Ustalenie istnienia mikrobiomu oka.
- Zbadanie zmian w obecności bakterii w przebiegu chorób oczu.
- Opracowanie metody diagnostycznej chorób oczu opartej na sygnaturach mikrobiologicznych.
Zastosowane metody
- Autoklawowanie waty bawełnianej i wykałaczek do wymazów z organizmów myszy.
- Pobieranie wymazów z obszaru spojówek myszy przy użyciu przygotowanej waty bawełnianej.
- Wzbogacanie wyizolowanych bakterii metodą hodowlaną.
- Identyfikacja bakterii przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF.
Główne wyniki
- Pomyślnie zidentyfikowano żywe mikroorganizmy w próbkach z spojówki myszy.
- Metoda ta pozwoliła na uzyskanie informacji na temat wspólnoty komensali ocznych.
- Sugerowano potencjalne powiązania między obecnością bakterii a chorobami ocznymi.
- Podejście to może usprawnić diagnostykę chorób oczu o charakterystycznych sygnaturach mikrobiologicznych.
Wnioski
- Protokół ten skutecznie izoluje i identyfikuje żywe mikroorganizmy oka.
- Zapewnia on wyraźniejsze zrozumienie mikrobiomu oka w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Metoda ta może mieć kluczowe znaczenie w diagnostyce chorób oczu w oparciu o profile mikrobiologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja żywych bakterii komensalnych oka umożliwia walidację celu w przedklinicznych modelach chorób oczu, zapewniając system istotny dla przebiegu choroby do monitorowania zmian mikrobiologicznych. Metoda ta wspomaga redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie mikroorganizmów żywych od martwych, co zwiększa pewność prognostyczną w odkrywaniu biomarkerów. Pozycjonuje ona profilowanie mikrobiologiczne jako narzędzie translacyjne służące do redukcji ryzyka hipotez terapeutycznych w procesach rozwoju leków w okulistyce.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację żywotnych mikroorganizmów spojówki w różnych stanach chorobowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia metodę opartą na hodowli w celu określenia różnorodności komensali u myszy, co wspomaga biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów okulistycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie sygnatur mikrobiologicznych ze stanami chorobowymi, zwiększając pewność co do wybranego celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez namnażanie rodzajów tlenowych i fakultatywnie beztlenowych z próbek okulistycznych.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje problemy standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zastosowaniu techniki wymazowej z kontrolowanymi etapami namnażania i wysiewu na podłoża.
- Skalowalność: Wskazuje na potencjał ponownego wykorzystania platformy do monitorowania zmian mikrobiologicznych w grupach eksperymentalnych i modelach chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia istotność w kontekście chorób, łącząc obecność specyficznych bakterii z trudnymi do zdiagnozowania chorobami oczu, takimi jak autoimmunologiczne i nieautoimmunologiczne zespół suchego oka.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość procesu od odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie podłużnego monitorowania mikrobioty oka.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji w oparciu o sygnatury mikrobiologiczne, zgodnie ze strategiami dostosowania biomarkerów translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywczego, od testowania hipotez we wczesnej fazie odkrywania po walidację przedkliniczną, wspierając identyfikację związków wiodących poprzez profilowanie mikrobiologiczne.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez poprzez izolację żywotnych drobnoustrojów w celu wyjaśnienia zaangażowania szlaków w odporność powierzchni oka.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez wzbogacanie oparte na hodowli oraz wyniki ilościowe, takie jak jednostki tworzące kolonie na wymaz.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, takie jak morfologia, względna liczebność i identyfikacja MALDI-TOF MS, które pomagają zespołom porównywać warunki w różnych grupach.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając monitorowanie zmian mikrobiologicznych w modelach chorób, co wspiera dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnie wykorzystywalną funkcjonalność do profilowania mikrobiologicznego w różnych modelach chorób oczu, a nie jako technikę jednorazową.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna, walidacja celów, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach mikrobiomu oka.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność izolacji żywych bakterii z próbek oka o niskiej liczebności drobnoustrojów.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach programów okulistycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o sygnatury mikrobiologiczne powiązane z fenotypami chorób.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu technik mikrobiologicznych, prowadzenia hodowli beztlenowych oraz obsługi spektrometrii MALDI-TOF MS.
- Potrzeby w zakresie instrumentacji i infrastruktury analitycznej obejmują autoklaw, inkubator, sprzęt do wysiewu oraz spektrometrię masową w celu identyfikacji.
- Wymogi dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania wymazów, czasu namnażania oraz spójności wysiewu u różnych użytkowników.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym potencjalne korekty dla różnych gatunków lub dostępności powierzchni gałki ocznej.
- Praktyczne ograniczenia potwierdzone materiałami źródłowymi: niska odzyskiwalność bakterii, sporadyczny brak uzyskania izolatów oraz zależność od prawidłowej techniki pobierania wymazów.
