Name: Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywych bakterii komensalnych z spojówek myszy przy użyciu wymazu i spektrometrii MALDI-TOF. Technika ta umożliwia identyfikację mikroorganizmów i może wspierać diagnostykę chorób oczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie od P30 DK034854 wspierane VY, LB i badania w Massachusetts Host-Microbiome Center oraz finansowanie z NIH/NEI R01 EY022054 obsługiwany MG.

Wszystkie procedury z udziałem myszy są zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych. Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa w laboratorium (zgodnie z zaleceniami instytucjonalnego działu zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego) podczas pracy z mikroorganizmami i potencjalnie skażonymi materiałami. Należy stosować odpowiednie pojemniki na odpady i procedury odkażania przed usunięciem materiałów potencjalnie skażonych zagrożeniem biologicznym.
1. Przygotowanie wymazu z oka, przygotowanie pola roboczego, pobieranie wymazu z oka myszy i wzbogacanie próbki
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne wymazy z oczu 
	UWAGA: Sterylne waciki do oczu to cienko powlekane drewniane wykałaczki z cienką warstwą włókna bawełnianego i wykonane we własnym zakresie.
	<ol>
		<li>W autoklawie należy użyć odpowiedniej ilości waty bawełnianej i wykałaczek dla liczby myszy do pobrania wymazu.</li>
		<li>Ściśnij półcentymetrowy kawałek bawełnianej pałki kciukiem i palcem wskazującym. Wyciągnij mrugnięcie, ciągnąc za krawędzie kciukami i palcami wskazującymi, aby utworzyć płaską, pojedynczą porowatą warstwę, zatrzymując się tuż przed rozpadnięciem się mrugnięcia (dopuszczalne są małe kawałki bawełny rozproszone po rozciągniętym mrugnięciu).</li>
		<li>Zakręć mrugnięciem wokół jednego z ostrych końców wykałaczki, lekko przytrzymując rozciągnięty kawałek na końcówce wykałaczki, gdy jest skręcony, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1. "Gotowy" wacik do oczu będzie miał bardzo cienką warstwę bawełny rozciągniętą na końcówce, rozciągającą się około pół do jednego centymetra od końcówki.</li>
		<li>Włóż "gotowe" waciki do małej zlewki, wacikiem do dołu i przykryj. Autoklaw.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfigurowanie obszaru roboczego
	<ol>
		<li>Przygotować znieczulenie zawierające 2 ml ketaminy (100 mg/ml), 400 μl ksylazyny (100 mg/ml) i 27,6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl wdH2O) w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Filtr, sterylizować i podawać znieczulenie do natychmiastowego użycia (może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc; przed użyciem zawsze pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej).</li>
		<li>Oczyść i wyczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
		<li>Porcję 0,5 ml sterylnego podłoża do infuzji mózgu i serca (BHI) rozłożyć na oznakowanych 1,5 ml sterylnych probówek do mikrowirówek (1 probówka na mysz i grupa kontrolna); umieścić na stojaku do mikrowirówek. Ustaw ruszt na lodzie.</li>
		<li>Ustaw przepływ pracy w następujący sposób (od lewej do prawej): stacja anestezjologiczna dla myszy (klatka zawierająca myszy eksperymentalne, pusta sterylna klatka, znieczulenie w temperaturze pokojowej, igła 25 G i strzykawka 1 ml), stacja wymazowa do oczu (podawane BHI na lodzie, sterylizowane wymazy z oczu, czyste ręczniki papierowe, spray 70% izopropanolu) i stacja galwaniczna (płytki agarowe z krwią o temperaturze pokojowej, pipeta 10 μL, 10 μL sterylne jednorazowe końcówki, pojemnik na odpady biologiczne).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymaz z oczu
	<ol>
		<li>Każdej dorosłej myszy podać 10 μl znieczulenia na 1 g masy ciała myszy dawkę ketaminy i ksylazyny odpowiednio dootrzewnowo każdej dorosłej myszy i umieścić w autoklawowanej klatce. Przetestuj znieczulenie, ściskając poduszkę tylnej części stopy; Brak ruchu wskazuje na odpowiednie znieczulenie.</li>
		<li>Przypisz jedną rękę do obsługi tylko znieczulonych myszy, a drugą do obsługi tylko wymazu z oka i hodowli. W celu pobrania wymazu wyjmij w pełni znieczuloną mysz z klatki; Umieść na czystej powierzchni roboczej umieszczonej na boku z odsłoniętym lewym okiem. Spryskaj dłonie w rękawiczkach izopropanolem, osusz czystym ręcznikiem papierowym.</li>
		<li>Odkręć specjalnie oznakowaną probówkę wirówki mikrowirówki BHI za pomocą dedykowanej ręki do obsługi mediów. Umieść probówkę z powrotem w stojaku na mikrowirówkę na lodzie. Zanurz pokrytą bawełną końcówkę wacika do oczu w BHI, wyjmij wacik z probówki, obracając końcówkę 2 razy względem rurki wewnętrznej, aby usunąć nadmiar płynu. </li>
		<li>Ręką trzymającą mysz delikatnie chwyć mysz za kark. Drugą ręką przyłóż końcówkę wacika do oka przyśrodkowej okolicy spojówki lewego oka, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A. Lekko wciśnij gałkę oczną i przesuń wacik ruchem mycia okien (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) w przód iw tył, między dolną powieką a okiem, 10 razy. Utrzymuj stałe ciśnienie.</li>
		<li>Nie dotykając sierści, delikatnie zdejmij końcówkę wacika, prostopadle do miejsca, w którym została włożona, i umieść wacik bawełnianą stroną do dołu bezpośrednio w oznakowanej probówce mikrowirówkowej zawierającej pożywkę BHI. Nałóż nawilżającą kroplę do oczu na pobrane oko.</li>
		<li>Umieść mysz z powrotem w klatce.</li>
		<li>Pozostaw wacik na 10 do 15 minut na lodzie i usuń wymazówkę z oczu wysterylizowaną ręką w rękawiczce, mieszając końcówkę z podłożem przez 10 obrotów. Wyjmij wacik, obracając końcówkę o wewnętrzną ściankę probówki mikrowirówki przez 5 obrotów. Wyrzuć wacik do pojemnika na zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Powtórzyć kroki od 1.3.2 do 1.3.7 dla każdej myszy i dla próbek kontrolnych (wymaz ze skóry lub futra). Odpowiednio sterylizuj rękawiczki między każdym wacikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wzbogacenie
	<ol>
		<li>Wzbogacić próbkę przez statyczną inkubację probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C</li>
		<li>Podczas inkubacji oznacz jedną tryptykazę sojową o temperaturze pokojowej z 5% płytką agarową z krwią owczą (płytka TSA) na mysz i podziel na pół.</li>
		<li>Po inkubacji wymazu z oka należy wyjąć wzbogacone próbki z inkubatora i umieścić na lodzie.</li>
		<li>Krótko zwiruj próbki, aby wymieszać je i płytkować zgodnie ze schematem w <silna klasa="xfig">Rysunek 3A. Porcję 10 μl próbki nanieść na płytkę TSA i przechylić płytkę w celu utworzenia paska, powtórzyć 2 razy.</li>
		<li>Po drugiej stronie linii podziału płytki nanieś 10 μl próbki na agar, powtórz 9 razy.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 18 godzin, 2 dni i 4 dni (w czystej komorze, która zapobiega wysychaniu płytek agarowych). Policz kolonie w paskach, zanotuj morfologię i oblicz jednostki tworzące kolonie (CFU) na wymaz dla morfologicznie podobnych izolatów. Spójrz na kropki, aby znaleźć unikalne organizmy, które nie zostały uchwycone w paskach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Płytka główna, charakterystyka i identyfikacja mikroorganizmów oka
<ol>
	<li>Płyta główna
	<ol>
		<li>Narysuj siatki na odwrocie tabliczki TSA (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Wybierz kolonię sterylną wykałaczką z każdej płytki wacika z oka myszy i rozłóż kwadrat na płytce głównej (siatki), oznacz siatkę z numerem kolonii i informacjami o myszy. Wybierz i ułóż na talerzu trzy różne kolonie dla każdej morfologicznie odrębnej kolonii.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Kontynuować inkubację przez 96 godzin, sprawdzając codziennie, czy nie pojawiły się nowe izolaty. 
		UWAGA: Populacja komensalna będzie się różnić w zależności od wieku myszy, odżywiania, stanu choroby i praktyk umieszczania w klatkach. Charakterystyka izolatu opiera się na dominujących bakteriach tlenowych i fakultatywnych bakteriach beztlenowych znalezionych w naszym laboratorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka
	<ol>
		<li>Duplicate13 mikrobów na płytkach Mannitol Salt Agar (MSA) i MacConkey (MAC), inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Zwróć uwagę na wzrost dla każdego izolatu i obecność woskowych kolonii lub żółtych kolonii z halo na MSA.</li>
		<li>W przypadku ziarniaków Gram-dodatnich przetestuj za pomocą testu katalazy13,14. Umieść kroplę 3% nadtlenku wodoru na czystym szkiełku szkiełkowym. Za pomocą sterylnej wykałaczki wybierz odpowiedni drobnoustrój z płytki wymazowej z oka. Brak tworzenia się pęcherzyków wskazuje na Streptococcus spp., niewielkie tworzenie się pęcherzyków wskazuje na Corynebacterium spp. i być może Aerococcus spp., a szybkie tworzenie się pęcherzyków wskazuje na Staphylococcus spp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja: MALDI-TOF MS ANALYSIS 
	UWAGA: Identyfikacja bakterii odbywa się przy użyciu MALDI-TOF i bazy danych oprogramowania. System ten wykorzystuje spektrometrię mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą i jonizacją czasu lotu (MALDI-TOF MS) do opracowywania profili widm, które są porównywane ze znanymi widmami bakterii w celu identyfikacji. E.coli, ATCC 8739, jest używany do kalibracji systemu.
	<ol>
		<li>Bakterie płytkowe izoluje się na płytkach TSA zawierających 5% krwi owczej i inkubuje przez noc z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Za pomocą pętli o pojemności 1 μl nałóż cienką warstwę czystych bakterii na szkiełko docelowe MALDI-TOF; 1 μl roztworu matrycy MALDI-TOF MS CHCA (kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy) nakłada się na nie i pozostawia do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przed załadowaniem szkiełka do urządzenia MALDI-TOF.</li>
		<li>Każdy izolat jest wykrywany w dwóch egzemplarzach.</li>
		<li>Raporty zawierające wyniki prawdopodobieństwa większe niż 80%, które wskazują na wysoką wartość dyskryminacji, są akceptowane jako wiarygodne wyniki, a identyfikacja bakterii akceptowana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation.</a> Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).</li>
<li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).</li>
<li>Nagpal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-origin+probiotic+cocktail+increases+short+chain+fatty+acid+production+via+modulation+of+mice+and+human+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).</li>
<li>Graham, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+pathogen+or+commensal%3A+a+PCR+based+study+of+surface+bacterial+flora+in+normal+and+dry+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sj%C3%B6gren-Like+Lacrimal+Keratoconjunctivitis+in+Germ-Free+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).</li>
<li>Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+diversity+of+ocular+microbial+communities+in+diabetic+patients+compared+with+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects.</a> Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).</li>
<li>Doan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paucibacterial+microbiome+and+resident+DNA+virome+of+the+healthy+conjunctiva%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).</li>
<li>Kugadas, A., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+microbiome+on+ocular+health%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Impact of microbiome on ocular health.</a> Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).</li>
<li>Dong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+bacteria+at+healthy+human+conjunctiva%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).</li>
<li>Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+understanding+the+ocular+surface+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Opthalmology%22%5BJournal%5D)">Considerations in understanding the ocular surface microbiome.</a> American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).</li>
<li>Fleiszig, S. M., Efron, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+flora+in+eyes+of+current+and+former+contact+lens+wearers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers.</a> Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+L-Plastin+Controls+Ocular+Paucibacteriality+and+Susceptibility+to+Keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 547(2020).</li>
<li>Johnson, T. R., Case, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+TR+%22Laboratory+Experiments+in+Microbiology%22">Laboratory Experiments in Microbiology</a>. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).</li>
<li>Reiner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalase+Test+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+for+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Catalase Test Protocol.</a> American Society for Microbiology. , (2010).</li>
<li>UK SMI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Standards+for+Microbiology+Investigation.+UK+SMI%22">Standards for Microbiology Investigation. UK SMI</a>. , Gov.UK. (2014).</li>
<li>Sharp, S. E., Searcy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mannitol+salt+agar+and+blood+agar+plates+for+identification+and+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus+in+specimens+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).</li>
<li>Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milleri+group+streptococcus--a+stepchild+in+the+viridans+family%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family.</a> European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).</li>
<li>Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerococcus+Viridans%3A+A+Rare+Pathogen+Causing+Urinary+Tract+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Diagnostic+Research%22%5BJournal%5D)">Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).</li>
<li>Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+is+a+sensitive+and+specific+method+for+identification+of+aerococci%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).</li>
<li>Wan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1R+and+MyD88+contribute+to+the+absence+of+a+bacterial+microbiome+on+the+healthy+murine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1117(2018).</li>
<li>Ozkan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Stability+and+Composition+of+the+Ocular+Surface+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9880(2017).</li>
<li>Oliver, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viable+but+non-culturable+state+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The viable but non-culturable state in bacteria.</a> Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).</li>
<li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenomenon+of+microbial+uncultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).</li>
<li>Whelan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-enriched+metagenomic+sequencing+enables+in-depth+profiling+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota.</a> Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).</li>
<li>Raymond, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-enriched+human+gut+microbiomes+reveal+core+and+accessory+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes.</a> Microbiome. 7, 56(2019).</li>
<li>Peto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+culture+enrichment+and+sequencing+of+feces+to+enhance+detection+of+antimicrobial+resistance+genes+in+third-generation+cephalosporin+resistant+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae.</a> PLoS One. 14 (11), 0222831(2019).</li>
<li>Lauer, B. A., Masters, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effect+of+calcium+alginate+swabs+on+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).</li>
<li>Dubois, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performances+of+the+Vitek+MS+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+system+for+rapid+identification+of+bacteria+in+routine+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).</li>
<li>Kawakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-blind+study+of+the+safety+and+Efficacy+of+1%25D-3-Hydroxybutyrate+eye+drops+for+Dry+Eye+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease.</a> Scientific Reports. 6, 20855(2016).</li>
<li>Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+toll-like+receptor+4+contributes+to+corneal+inflammation+in+experimental+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).</li>
<li>Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+response+to+lipopolysaccharide+on+the+ocular+surface+in+a+murine+dry+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).</li>
<li>Miller, D., Ioviano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microbial+flora+on+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of microbial flora on the ocular surface.</a> Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).</li>
<li>Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+epigenetic+changes+caused+by+commensal+microbiota+contribute+to+development+of+ocular+disease%3F+A+review+of+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence.</a> Human Genomics. 14 (1), 11(2020).</li>
<li>Stevenson, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+disease%3A+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).</li>
</ol>

Brak konfliktu interesów do ujawnienia.

Ze względu na paucibakteryjny stan powierzchni oka, wiele laboratoriów miało trudności z wyizolowaniem komensalów ocznych 7,20, co skutkowało niską liczbą próbek o wzroście, niską liczebnością i niską różnorodnością8. Metoda ta znacznie poprawia standardowe praktyki hodowlane 4,21 poprzez dodanie etapu wzbogacania, a także przeprojektowanego wymazu z oka i identyfikacji za pomocą M...

Celem tego protokołu jest zwiększenie specyficznej izolacji żywotnych i rzadkich drobnoustrojów tlenowych i fakultatywnych beztlenowych z spojówki oka, aby scharakteryzować mikrobiom oka. Szeroko zakrojone badania sprofilowały zbiorowiska błony śluzowej komensalnej na skórze, jelitach, drogach oddechowych i płciowych i pokazują, że społeczności te wpływają na rozwój układu odpornościowego i odpowiedź1,2,3. Wykazano, że społeczności komensalne oka zmieniają się podczas niektórych patologii chorobowych, takich jak zespół suchego oka4, zespół Sjögrena5 i cukrzyca6. Jednak możliwość zdefiniowania typowej społeczności komensalnej powierzchni oka jest utrudniona ze względu na ich stosunkowo niską liczebność w porównaniu z innymi miejscami błony śluzowej6,7,8. Wywołuje to kontrowersje dotyczące tego, czy istnieje rezydentny mikrobiom oka, a jeśli tak, to czy różni się od mikrobiomu skóry, a co za tym idzie, jego miejscowy wpływ na rozwój i odpowiedź wrodzonego układu odpornościowego. Ten protokół może pomóc w rozwiązaniu tego problemu.
Generalnie, podejścia do definiowania niszy komensalnej oka opierają się na sekwencjonowaniu i technikach opartych na hodowli4,7,9. 16 Sekwencjonowanie S rDNA i analiza BRISK7 wykazują większą różnorodność niż techniki oparte na kulturach, ale nie są w stanie odróżnić żywych i martwych mikrobów. Ponieważ powierzchnia oka jest nieprzyjazna dla wielu drobnoustrojów ze względu na właściwości przeciwdrobnoustrojowe filmu łzowego4 generując dużą liczbę fragmentów DNA, podejścia oparte na DNA wykryją te artefakty, które mogą zniekształcić dane w kierunku identyfikacji martwych bakterii jako rezydentów komensalnych, a nie zanieczyszczeń. Skutkuje to nieprawidłową identyfikacją komensalną i charakterystyką przestrzeni ocznej jako bardziej obfitej i różnorodnej pod względem liczebności i różnorodności drobnoustrojów10. Utrudnia to zdefiniowanie rezydentnego mikrobiomu oka za pomocą metod opartych na DNA. Natomiast standardowe techniki oparte na kulturach nie są w stanie wykryć komensali, ponieważ obciążenie jest zbyt niskie11. Nasza metoda ulepsza standardowe praktyki poprzez użycie cienkiego wacika, który może celować w spojówkę, unikając w ten sposób zanieczyszczenia sąsiedniej skóry, a także koncepcji, że żywe organizmy można wzbogacić przez krótką hodowlę w pożywkach o dużej gęstości odżywczej w celu reanimacji żywotnych, ale nienadających się do hodowli, a także wzbogacenia o rzadkie żywotne drobnoustroje.
Wyniki, względna obfitość komensali oka na wymaz z oka, charakteryzują mikrobiom rezydenta spojówki i są ważne dla celów porównawczych. Z naszych danych wynika, że istnieje różnica między mikrobiotą skóry i spojówek, a także większa różnorodność wraz z wiekiem i różnicą w liczebności w zależności od płci. Co więcej, podejście to w powtarzalny sposób wykazało różnice komensalne u myszy z nokautem12. Protokół ten można zastosować do opisania mikrobiomu oka, który może się różnić w zależności od praktyk umieszczania w klatkach, geografii lub stanu choroby, a także lokalnego wpływu metabolitów i produktów komensalnych na rozwój i odpowiedź układu odpornościowego.

<table><tbody><tr><td>0,1 do 10 &mikro; l końcówka do pipety</td><td>USA Scientific</td><td>1110-300</td><td>autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>0,5 do 10 i mikro; l Pipeta Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-026</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD309623</td><td>1 strzykawka na każdą grupę wymazów z oczu</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>1000 &mikro; ml końcówka do pipety</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2021</td><td>autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>200 do 1000 mikro; l Pipetman Gilsona (P1000)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>1 igła na grupę wymazów do oczu</td></tr><tr><td>3 % Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25359</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Inkubator</td><td>Wyposażenie</td><td></td><td></td>laboratoryjne</tr><tr><td>70 % izopropanolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>PX1840-4</td><td></td></tr><tr><td>Ana-Sed Injection (ksylazyna 100 mg / ml)</td> <td>Santa Cruz Animal Health</td><td>SC-362949Rx</td><td></td></tr><tr><td>BD BBL Gram Zestaw do barwienia</td><td>Fisher Scientific</td><td>B12539</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Sprzęt laboratoryjny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czyste ręczniki papierowe</td><td>Lab sprzęt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bawełniane Batting/Sterylne zwijane bawełniane</td><td>CVS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>do testów barwienia metodą Grama i katalazy</td></tr><tr><td>E.coli</td><td>ATTC</td><td>ATCC 8739</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>podstawowe Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>do testów barwienia metodą Grama i katalazy</td></tr><tr><td>Ketamina ( 100 mg / ml)</td> <td>Henry Schein</td><td>9950001</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey Agar Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>4321270</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & C do momentu użycia</td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>784641</td><td>Przygotuj talerze zgodnie z instrukcjami mfr, przechowuj w temperaturze 4 & stopni; C przez 1 tydzień</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Jackson Labs</td><td>C57/BL6J</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>do płytek agarowych z solą mannitolu</td></tr><tr><td>RPI Brain Heart Infusion Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-488525</td><td>przygotować zgodnie z instrukcją i autoklawować</td></tr><tr><td>SteriFlip (0,22 i mikro; m rozmiar porów sulfonu poliestrowego)</td> <td>EMD / Millipore, Fisher Scientifc</td><td>SCGP00525</td><td>do sterylizacji znieczulenia</td></tr><tr><td>Sterylna probówka wirówki</td><td>Corning Fisher Scientific</td><td>430829</td><td>przygotowanie anestezjologiczne</td></tr><tr><td>Sterylna klatka dla myszy</td><td>Sprzęt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoryjny Wykałaczki (okrągłe bambusowe)</td><td>Autoklaw Kitchen Essentials</td><td></td><td>przed użyciem i przygotowanie</td></tr> <tr><td>wymazówkiTryptyka Agar sojowy II z 5% płytkami krwi owczej</td><td>Fisher Scientific</td><td>4321261</td><td>sklep w temperaturze 4 stopni; C do momentu, gdy</td></tr><tr><td>szkiełko docelowe Vitek</td> jest gotowe do użycia <td>BioMerieux Inc. Durham, NC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitek-MS</td><td>BioMerieux Inc. Durham, NC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitek-MS CHCA roztwór matrycowy</td><td>BioMerieux Inc. Durham, NC</td><td>411071</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe krople do oczu</td><td>CVS Pharmacy</td><td></td><td>Bausch and Lomb Soothe Lubrykant Krople do oczu, 28 fiolek po 0,02 uncji każda</td></tr></tbody></table>

izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

Powierzchnia oka była kiedyś uważana za uprzywilejowaną immunologicznie i abiotyczną, ale ostatnio okazało się, że występuje tam niewielka, ale stała obecność komensalna. Identyfikacja i monitorowanie gatunków bakterii w błonie śluzowej oka było wyzwaniem ze względu na ich niską liczebność i ograniczoną dostępność odpowiedniej metodologii wzrostu i identyfikacji komensalnej. Istnieją dwa standardowe podejścia: metody oparte na hodowli lub metody sekwencjonowania DNA. Pierwsza metoda jest problematyczna ze względu na ograniczoną liczbę bakterii możliwych do odzyskania, a druga metoda identyfikuje zarówno żywe, jak i martwe bakterie, co prowadzi do nieprawidłowej reprezentacji przestrzeni oka. Opracowaliśmy solidną i czułą metodę izolacji bakterii, opierając się na standardowych technikach hodowli mikrobiologicznej. Jest to technika oparta na wymazówce, wykorzystująca cienki wacik wykonany "w laboratorium", który jest ukierunkowany na dolną spojówkę, a następnie następuje etap amplifikacji dla tlenowych i fakultatywnych rodzajów beztlenowych. Protokół ten pozwolił nam wyizolować i zidentyfikować gatunki spojówek, takie jak Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. itp. Podejście to jest odpowiednie do zdefiniowania różnorodności komensalnej u myszy w różnych stanach chorobowych.

Reprezentatywne wyniki dla szalki z wymazem z oka, demonstrujące różne metody wysiewu, przedstawiono na Rysunku 3A, ukazującym morfologicznie zróżnicowane izolaty z myszy C57BL/6. Dla każdego odrębnego izolatu policzono kolonie w pasie, a następnie, w celu porównania, obliczono i wykreślono względną liczebność oraz unikalne jednostki tworzące kolonie (CFUs) na wymaz z jednego oka. Do charakterystyki mikrobiologicznej bakterie pobrano z poszczególnych szalek z wymazami z oczu myszy w celu prz...

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji i amplifikacji tlenowych i fakultatywnych beztlenowych mysich bakterii komensalnych spojówek przy użyciu unikalnego wymazu z oka i etapu wzbogacania opartego na hodowli z późniejszą identyfikacją za pomocą metod mikrobiologicznych i spektrometrii mas MALDI-TOF.

Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Metoda ta identyfikuje żywe mikroorganizmy spojówek oka, co jest wyzwaniem ze względu na nieprzyjazne środowisko oczu. Może pomóc odpowiedzieć na pytanie, czy istnieje mikrobiom oka i jak zmienia się obecność bakterii w chorobach oczu. W przeciwieństwie do sekwencjonowania DNA, które identyfikuje zarówno żywotne, jak i nieżywotne mikroorganizmy, ta metoda identyfikuje tylko żywotne mikroorganizmy, co pozwala lepiej zrozumieć społeczność komensalną oka.Badania sugerują, że trudne do zdiagnozowania choroby oczu, takie jak nieautoimmunologiczny i autoimmunologiczny suchy oko, mają unikalną obecność bakterii ocznych. Metoda ta może być stosowana do diagnozowania chorób oczu z charakterystycznymi sygnaturami mikrobiologicznymi. Zacznij od autoklawowania odpowiedniej ilości waty bawełnianej i wykałaczek dla liczby myszy, które mają zostać pobrane, a następnie ściśnij 1/2 centymetrowego kawałka bawełny i wysusz go, ciągnąc za krawędzie, aby utworzyć płaską, pojedynczą porowatą warstwę, zatrzymując się tuż przed rozpadnięciem się mrugnięcia.Zakręć mrugnięciem wokół jednego z ostrych końców wykałaczki, lekko przytrzymując rozciągnięty kawałek na końcówce wykałaczki, gdy jest skręcony. Gotowy wacik do oczu będzie miał bardzo cienką warstwę bawełny rozciągniętą na końcówce, rozciągającą się około 1/2 do jednego centymetra od końcówki. Włóż waciki do małej zlewki wacikiem do dołu, a następnie przykryj je i zautoklawuj.Oczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym, aby zminimalizować zanieczyszczenie i wlej 0,5 mililitra sterylnego naparu do serca mózgu lub pożywki BHI do oznakowanych 1,5 mililitrowych sterylnych mikroprobówek wirówkowych. Zakryj probówki w stojaku i połóż stojak na lodzie. Ustaw przepływ pracy od lewej do prawej, zaczynając od stacji znieczulającej myszy, która zawiera klatkę z eksperymentalnymi myszami, pustą sterylną klatkę, znieczulenie w temperaturze pokojowej, igłę o rozmiarze 25 i strzykawkę o pojemności jednego mililitra.Następnie przygotuj stację do pobierania wymazów z oczu, która zawiera porcjowane BHI na lodzie, wysterylizowane wymazy z oczu, smarujące krople do oczu, pojemnik na zagrożenie biologiczne, czyste ręczniki papierowe i spray 70% izopropanolu. Na koniec ustaw stację galwaniczną z płytkami agarowymi do krwi o temperaturze pokojowej, pipetą o pojemności 10 mikrolitrów, sterylnymi jednorazowymi końcówkami o pojemności 10 mikrolitrów i pojemnikiem na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając podkładkę pod tylną stopę.Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma ruchu. Przypisz jedną rękę do obsługi znieczulonych myszy, a drugą do obsługi wymazu z oka i hodowli. Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na powierzchni roboczej umieszczonej na boku z odsłoniętym lewym okiem.Spryskaj dłonie w rękawiczkach izopropanolem i osusz je ręcznikiem papierowym. Odkręć oznaczoną mikroprobówkę wirówkową BHI za pomocą dedykowanej ręki do obsługi pożywek i umieść obie z powrotem w stojaku. Zanurz pokrytą bawełną końcówkę wacika do oczu w BHI, a następnie wyjmij wacik z tubki, dwukrotnie obracając końcówką o rurkę wewnętrzną, aby usunąć nadmiar płynu i usunąć go.Ręką trzymającą mysz delikatnie chwyć mysz za kark. Drugą ręką przyłóż końcówkę wacika do oka na przyśrodkowym obszarze spojówki lewego oka. Lekko wciśnij gałkę oczną i przesuń wacik ruchem mycia okien między dolną powieką a okiem 10 razy, utrzymując stały nacisk.Nie dotykając sierści, delikatnie zdejmij końcówkę wacika prostopadle do miejsca, w którym została włożona. Umieść wacik bawełnianą stroną do dołu, bezpośrednio w oznakowanej mikroprobówce wirówkowej z pożywką BHI. Nałóż kroplę do oczu na pobrane oczko.W razie potrzeby zaopatrz się w wymazy ze skóry lub futra do próbek kontrolnych, odpowiednio sterylizując rękawiczki między każdym wacikiem. Po zakończeniu umieść mysz z powrotem w klatce. Pozostaw wacik na 10 do 15 minut na lodzie, a następnie wysterylizuj ręce w rękawiczkach i wyjmij wacik, mieszając końcówkę z podłożem przez 10 obrotów.Wyjmij wacik, obracając końcówką o wewnętrzną ściankę probówki przez pięć obrotów i wyrzuć go do pojemnika stanowiącego zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces dla każdej myszy. Wzbogać próbkę poprzez statyczną inkubację probówki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Podczas inkubacji oznacz jedną płytkę TSA o temperaturze pokojowej na wymaz z oka myszy lub wacik kontrolny i podziel go na pół. Wyjąć wzbogacone próbki z inkubatora i umieścić je na lodzie. Krótko zawirować próbki, aby je wymieszać, a następnie nanieść 10 mikrolitrów próbki na płytkę TSA i przechylić płytkę, aby utworzyć pasek.Powtórz to dwa razy. Po drugiej stronie linii podziału płytek utwórz 10 kropek po 10 mikrolitrów próbki każda. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin, dwa dni i cztery dni w czystej komorze, która zapobiega wysychaniu płytek agarowych.Policz kolonie w paskach. Zwróć uwagę na morfologię i oblicz jednostki tworzące kolonie na wymaz dla morfologicznie podobnych izolatów. Spójrz na kropki, w których unikalne organizmy nie są uchwycone w paskach.Aby ułatwić wizualizację, gęsto rozsialiśmy bakterie na środkowej i prawej płytce. Zazwyczaj zaobserwowaliśmy znacznie mniej bakterii w płytkach wymazowych z oczu. Należy pamiętać, że czasami wymazy z oczu mogą nie dawać bakterii, które można odzyskać.Reprezentatywna płytka wymazowa z oka z morfologicznie zróżnicowanymi izolatami od czarnej myszy sześciokątnej C57 jest pokazana tutaj. Dla każdego odrębnego izolatu kolonie zostały policzone w pasie, a względna liczebność została obliczona i wykreślona. W celu charakterystyki mikrobiologicznej bakterie zostały wybrane z indywidualnych płytek wymazowych z oczu myszy, aby wytworzyć główną płytkę TSA.Kiedy pojawił się wzrost, przeprowadzono dodatkowe testy w celu scharakteryzowania lub zidentyfikowania drobnoustrojów. Płytka wzorcowa została użyta, aby zapewnić wystarczającą ilość inokulum do rozprężenia odpowiednich izolatów. Aby zidentyfikować izolaty, płytkę TSA przesiąknięto i inkubowano przez noc, a następnie przeprowadzono MALDI-TOF MS.Przykłady pokazanych tutaj izolatów zostały zidentyfikowane jako Streptococcus acidominimus i Aerococcus viridans. Znacząco różne poziomy organizmów komensalnych zostały odzyskane od samców i samic czarnych sześciu myszy C57. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans koaguluje ujemne Staphylococci i E. coli zostały wyizolowane z czarnych sześciu N myszy C57.Wypróbowując ten protokół, należy pamiętać, że najlepszy wynik zostanie osiągnięty poprzez cienkie pokrycie wacika i poświęcenie czasu na etapie pobierania wymazu z oka. Jeżeli dostęp do MALDI-TOF MS jest ograniczony, izolaty można zidentyfikować za pomocą badań mikrobiologicznych i biochemicznych.

conjunctival-commensal-isolation-and-identification-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Ten film opisuje technikę opartą na wymazówce, aby izolować żywe bakterie komensalne ze spojówki oka. Technika ta może być wykorzystana do profilowania komensalnego mikrobiomu bakteryjnego spojówki, który odgrywa rolę obronną przed patogenami.

Izolacja bakterii komensalnych spojówek na podstawie wymazówki: technika izolacji bakterii komensalnych z spojówki modelu mysiego

Ten film opisuje technikę ilościowego oznaczania infekcji bakteryjnej na podstawie homogenatów oka uzyskanych z mysiego modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej wywołanego przez Bacillus cereus. Technika ta pomaga badać odpowiedź immunologiczną gospodarza i jej zależność od gospodarza oraz ekspresję genów bakteryjnych oka w modelach mysich.

Test ilościowy infekcji bakteryjnych: metoda ilościowego określania wewnątrzgałkowego obciążenia bakteryjnego w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Ten protokół opisuje metodę izolacji gałki ocznej myszy z powieką, powierzchnią oka, przednimi i tylnymi segmentami w względnie nienaruszonej pozycji.

Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).

Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.

In Vivo Mikroskopia konfokalna w diagnostyce i leczeniu suchego oka: Skupienie się na protokołach obrazowania i interpretacji

Poznaj metodę izolacji żywych bakterii komensalnych z spojówek myszy przy użyciu wymazu i spektrometrii MALDI-TOF. Technika ta umożliwia identyfikację mikroorganizmów i może wspierać diagnostykę chorób oczu.

Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

Przeglądaj więcej filmów