Test kiełkowania naczyniówki ex vivo w angiogenezie mikronaczyniowej oka
6 sierpnia 2020
Ten protokół przedstawia test kiełkowania naczyniówki, model ex vivo proliferacji mikronaczyniowej. Test ten może być stosowany do oceny szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniówek i oceny leczenia farmakologicznego przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.
Ten test naczyniówki jest wysoce powtarzalny i istotny dla badań nad angiogenezą naczyniówkową i zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem, AMD Może uzupełniać badania in vivo zachowania mikrokrążenia. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych związków jako potencjalnych metod leczenia neowaskularnego AMD lub do oceny szlaków zaangażowanych w neowaskularyzację naczyniówkową przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy. Na początek dodaj pięć mililitrów penicyliny, streptomycyny i 10 i 5 mililitrów dostępnych na rynku suplementów do 500 mililitrów kompletnej klasycznej pożywki z surowicą, a następnie podwielokrotność 50 mililitrów pożywki rozmrozić podstawowy ekstrakt błonowy lub BME przez noc w lodówce w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.
Umieść porcję kompletnego klasycznego podłoża na lodzie. Wyczyść mikroskop preparacyjny, kleszcze i nożyczki 70% etanolem. Przygotuj szalki do hodowli komórkowych i umieść jedną na mikroskopie preparacyjnym, a drugą na lodzie.
Następnie dodaj 10 mililitrów kompletnego klasycznego podłoża do każdego dania. Trzymaj oczy w kompletnym klasycznym podłożu na lodzie przed preparacją. Usuń tkankę łączną i nerw wzrokowy, a następnie użyj mikronożyczek, aby przeciąć obwód 0,5 milimetra za Limbusem rogówki.
Usuń rogówkę Tęczówka złożona, szklista i do soczewki. Wykonaj jednomilimetrowe nacięcie prostopadłe do krawędzi cięcia w kierunku nerwu wzrokowego i przeciąć obwodowy pas o szerokości jednego milimetra, a następnie oddziel środkowe i obwodowe obszary kompleksu. Użyj kleszczy, aby oderwać siatkówkę od kompleksu twardówki naczyniówki RPE.
Utrzymuj obwodową opaskę naczyniówki w kompletnym klasycznym podłożu na lodzie. Odizoluj drugie oko i powtórz proces, aby przeciąć drugi pasek. Pokrój okrągłą opaskę na pięć do sześciu mniej więcej równych kwadratowych kawałków.
Dodaj 30 mikrolitrów rozmrożonego BME do środka każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że kropla BME tworzy wypukłą kopułę na dnie płytki, nie dotykając krawędzi. Umieść tkankę na środku BME.
Nie spłaszczaj rośliny naczyniówki X. Pozwól tkance rozszerzyć się w obrębie BME. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby żel zastygł, a następnie dodaj 500 mikrolitrów kompletnej klasycznej pożywki do każdej studzienki.
Zmieniaj klasyczne podłoże co drugi dzień. Kiełkowanie naczyniówki można zaobserwować po trzech dniach pod mikroskopem. Otwórz obraz kiełkowania naczyniówki z obrazem J i sprawdź obraz, typ i osiem bitów ze skalą szarości.
Następnie zoptymalizuj kontrast, wybierając obraz, dostosuj, kontrast jasności i dostosowując go. Użyj funkcji magicznej różdżki, aby obrysować i usunąć tkankę naczyniówki, która znajduje się w środku kiełków. Usuń tło obrazu za pomocą bezpłatnych narzędzi do zaznaczania.
Następnie przejdź do obrazu, dostosuj próg i użyj funkcji progu, aby zdefiniować kiełki mikronaczyniowe na tle na obrzeżach. Kliknij F2, a pojawi się podsumowanie. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać obraz zaznaczonego obszaru w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny obraz, do wykorzystania w przyszłości.
Po zmierzeniu grupy próbek skopiuj zarejestrowane dane do analizy. Protokół ten został wykorzystany do zbadania i ilościowego określenia kiełkowania naczyniówki u C 57, czarnych sześciu myszy J od trzeciego do szóstego dnia. W reprezentatywnym przypadku obszar kiełkowania naczyniówki wynosił 0,38, 1,47, 5,62 i 10,09 milimetra do kwadratu odpowiednio w trzecim, czwartym, piątym i szóstym dniu.
Wpływ utraty FFAR4 na kiełkowanie naczyń krwionośnych oceniano za pomocą testu kiełkowania naczyniówki u myszy FFAR4 z czterema nokautami i FFAR4 typu dzikiego. Obszar kiełkowania u myszy z nokautem FFAR4 zwiększył wzrost naczyniówki w porównaniu z dzikim typem FFAR4 w szóstym dniu. Ponadto leczenie jednym mikromolowym agonistą FFAR4 zmniejszyło obszar kiełkowania naczyniówki w porównaniu z nieleczonymi myszami w szóstym dniu.
Test ten pozwala na powtarzalną ocenę potencjału antyangiogennego związków farmakologicznych oraz zmienności roli określonych szlaków w neowaskularyzacji naczyniówkowej z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia test kiełkowania błony naczyniowej jako model ex vivo do badania proliferacji mikronaczyniowej, w szczególności w odniesieniu do angiogenezy naczyniówkowej oraz związanej z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej (AMD) o charakterze naczyniowym. Test ten umożliwia ocenę szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniową naczyniówki oraz analizę działania leków z wykorzystaniem tkanek mysich typu dzikiego oraz modyfikowanych genetycznie.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Angiogeneza naczyniówki
- Związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej (AMD)
- Zachowanie mikro naczyniowe
Wstęp
- Znaczenie angiogenezy naczyniówkowej w chorobach oczu
- Modele ex vivo uzupełniające badania in vivo
- Genetycznie zmodyfikowane modele mysie dla pogłębienia wiedzy
Zastosowane metody
- Test kiełkowania naczyniówki (choroid sprouting assay)
- Wykorzystanie tkanek mysich z linii typu dzikiego i modyfikowanych genetycznie
- Mikroskopia do obserwacji kiełkowania naczyniówki
Główne wyniki
- Test umożliwia powtarzalne pomiary kiełkowania naczyniowego błony naczyniowej siatkówki w ciągu wielu dni
- Utrata FFAR4 u myszy z knockoutem zwiększyła wzrost naczyń błony naczyniowej siatkówki w porównaniu z typem dzikim
- Leczenie agonistą FFAR4 zmniejszyło obszar kiełkowania naczyniowego błony naczyniowej siatkówki u myszy z knockoutem
Wnioski
- Badanie wykazuje skuteczność testu w ocenie potencjału antyangiogennego związków farmakologicznych
- Podkreśla ono rolę konkretnych szlaków sygnalizacyjnych w naczyniówkowej neowaskularyzacji błony naczyniowej
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Test kiełkowania naczyniowego błony naczyniówkowej ex vivo stanowi powtarzalny model oceny proliferacji mikro naczyniowej błony naczyniówkowej, co ma bezpośrednie znaczenie dla poszukiwania leków na neowaskularną postać zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem (AMD). Umożliwia on mechanistyczną weryfikację i ograniczanie ryzyka w odniesieniu do szlaków angiogennych z wykorzystaniem tkanek mysich typu dzikiego oraz modyfikowanych genetycznie, wspierając walidację celów terapeutycznych i identyfikację związków wiodących w projektach okulistycznych. Test ten łączy biologię odkrywczą z oceną przedkliniczną poprzez ilościowe określanie dynamiki kiełkowania w systemie eksplantu tkankowego o istotnym znaczeniu fizjologicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar rozrastania się naczyń naczyniówkowych w odpowiedzi na genetyczną lub farmakologiczną modulację szlaków angiogennych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów, takich jak FFAR4, w wielokomórkowym kontekście tkankowym obejmującym śródbłonek, makrofagi, perycyty oraz RPE.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez ilościowe określanie zależnych od dawki efektów działania związków na rozrastanie się mikroznaczynia w czasie.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników obrazowania powierzchni kiełkowania, które odzwierciedlają tworzenie sieci mikro naczyniowej w kontrolowanych warunkach.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standaryzowane wysiewanie eksplantów w BME o obniżonej zawartości czynników wzrostu z określonym harmonogramem wymiany pożywki, co zapewnia powtarzalność między eksperymentami.
- Skalowalność: Metoda jest kompatybilna z formatem płytek 24-dołkowych oraz półautomatyczną analizą w programie ImageJ, co umożliwia screening związków o średniej i wysokiej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje natywną architekturę błony naczyniowej-nabłonka pigmentowego siatkówki-twardówki, utrzymując interakcje międzykomórkowe kluczowe dla modelowania patofizjologicznej angiogenezy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia bezpośrednie porównanie tkanek typu dzikiego i z nokautem (np. FFAR4) w celu wyizolowania wkładu genetycznego w fenotypy kiełkowania.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na ocenę wpływu agonistów/antagonistów na kiełkowanie, dostarczając dowodów przedklinicznych dla modulacji danej ścieżki.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w proces odkrywania leków w okulistyce, obejmujący etapy od walidacji celu, przez optymalizację lidera, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w przypadku strategii antyangiogennych w AMD.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulatorów angiogenezy poprzez ilościowe określanie zmian w kiełkowaniu naczyń w odpowiedzi na inhibicję lub aktywację szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych parametrów kiełkowania, które umożliwiają szeregowanie efektów działania związków w formacie opartym na tkankach.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na powierzchni w czasie (np. od 3. do 6. dnia), co wspiera analizę kinetyczną odpowiedzi mikro naczyniowych.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje istotne dla choroby eksplanty do modelowania nowotworowej neowaskularyzacji błony naczyniowej, co ułatwia ekstrapolację do modeli AMD in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę do oceny wielu związków lub modeli genetycznych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi efektami kiełkowania w kontekście tkanki natywnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom izolacji tkanek, wysiewu na BME, wymiany pożywki oraz obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych dowodów na aktywność antyangiogenną w modelu tkankowym przed testami in vivo.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź oraz walidację genetyczną.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w sekcji tkanek mysich oraz izolacji eksplantów w warunkach sterylnych.
- Metoda jest zależna od dostępu do ekstraktu błony podstawnej (BME) o zredukowanej zawartości czynników wzrostu oraz mikroskopu kontrastowego.
- Niezbędne są standaryzowane schematy analizy obrazu (np. makro ImageJ) w celu zapewnienia spójnej kwantyfikacji kiełkowania.
- Przy interpretacji wskaźników kiełkowania należy uwzględnić zmienność wielkości eksplantów oraz żywotność tkanek.
- Metoda jest ograniczona do tkanek mysich; różnice międzygatunkowe mogą wpływać na możliwość przeniesienia wyników na biologię naczyniówki u ludzi.
