Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH
20 września 2020
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.
SM FISH dokładnie określa ilościowo poziomy i lokalizację określonej RNazy. Metoda ta jest szczególnie przydatna do analizy komórek i alleli według zmienności alleli w RNA. Transkrypcja genów jest niezbędnym procesem w biologii komórki, SM FISH pozwala na badanie zawartości RNA w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne na poziomie pojedynczej komórki i dostarczanie informacji przestrzennej.
Po leczeniu agonistą receptora estrogenowego przemyj komórki zimnym sterylnym PBS z wapniem i magnezem i utrwal komórki 500 mikrolitrami buforu utrwalającego przez 30 minut na lodzie. Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwa razy zimnym sterylnym PBS z wapniem i magnezem przez trzy minuty przed dodaniem 500 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki. Następnie uszczelnij 24-dołkową płytkę folią parafinową z tworzywa sztucznego i umieść płytkę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej cztery i do 16 godzin.
W przypadku hybrydyzacji RNA FISH, pod koniec inkubacji przemyć komórki jednorazowo 500 mikrolitrami buforu 2X SSC uzupełnionego 10% formamidem przez pięć minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. Podczas inkubacji umieścić kawałek folii z tworzywa sztucznego parfiny, nienaświetloną stroną do góry, na szklanej szalce Petriego oczyszczonej powierzchnią RNA, odkazić i umieścić na sterylnych, nasączonych wodą ręcznikach papierowych wzdłuż krawędzi naczynia. Pod koniec inkubacji umieść równomiernie rozmieszczone 30 mikrolitrowe kropelki świeżo przygotowanego do intronu GREB1 i buforu sondy eksonowej GREB1 po czystej stronie folii z tworzywa parafinowego i użyj sterylnych kleszczyków, aby delikatnie umieścić jedną warstwę zakrywającą komórek stroną do dołu na każdej kropelce bez pęcherzyków.
Po uszczelnieniu naczynia folią parafinową przykryj płytkę folią i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza na płaskiej, nieobrotowej powierzchni. Następnego ranka użyj kleszczyków, aby umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem na 24-dołkowej komorze płytki do góry na dwa 15-minutowe płukania w 500 mikrolitrach świeżego buforu 2X SSC uzupełnionego 10% formamidem na pranie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na podgrzewanym rotatorze. Po drugim myciu przeciwbarwić DNA jednym mikrogramem na mililitr DAPI w buforze 2X SSC przez 10 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze, a następnie przemyć pięciominutowe w buforze 2X SSC w temperaturze pokojowej.
Użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar buforu 2X SSC i spłucz próbki w wodzie wolnej od nukleaz, aby wyeliminować nadmiar soli. Następnie za pomocą nietwardniejącego medium montażowego zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i uszczelnij szkiełka nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci. W przypadku obrazowania próbki załaduj szkiełko o najwyższej oczekiwanej intensywności na stolik mikroskopu epifluorescencyjnego o szerokim polu widzenia, wyposażony w obiektyw o średnicy 60 lub 100 razy większej niż olej w kamerze sCOMS i umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie.
W celu akwizycji Zstack skup się na próbce w kanale DAPI i wybierz górną i dolną część Zstack w odległościach, w których jądra barwione DAPI stają się nieostre. Użyj slajdu, aby zoptymalizować ilość oświetlenia ze źródła światła i czasy ekspozycji dla każdego kanału oraz uzyskać obrazy ze wszystkich slajdów w warunkach, które pozwalają uniknąć wybielania zdjęć i/lub nasycenia pikseli aparatu. Po akwizycji użyj 10 cykli agresywnego algorytmu odtwarzającego, aby zdekonwolować obrazy i zapisać wszystkie obrazy projekcyjne zgodnie z głębią bitową użytej kamery.
W celu analizy obrazu najpierw pobierz Jupiter Notebook z GitHub i zainstaluj Python Anaconda Distribution w wersji 3.6 lub nowszej. Otwórz wiersz polecenia Anaconda i wprowadź polecenie instalacji, aby zainstalować SimpleITK dla Anacondy. Otwórz Anaconda Navigator i uruchom Jupiter Notebook.
Otworzy się przeglądarka internetowa pokazująca katalogi i pliki. Przeglądaj struktury katalogów, aby uzyskać dostęp do katalogu zawierającego pobrany Jupiter Notebook z GitHub. Następnie otwórz notes i naciśnij Shift i Enter, aby uruchomić każdą komórkę.
W tym reprezentatywnym eksperymencie przylegające komórki raka piersi były leczone agonistą receptora estrogenowego lub nośnikiem przez 24 godziny. Spektralnie oddzielone zestawy sond w stosunku do sekwencji intronowych i egzonicznych GREB1 pozwoliły na jednoczesną wizualizację i kwantyfikację powstającego i dojrzałego mRNA. Co ważne, można oznaczyć liczbę aktywnych transkrypcyjnie alleli w każdej komórce, które, jak wykazano, są częścią przebiegu czasu odpowiedzi estrogenowej.
Licząc nakładające się plamki intronów i eksonów, stwierdzono, że komórki traktowane E2 mają czterokrotnie zwiększoną frakcję komórek, które wykazują dwa lub więcej aktywnych alleli GREB1 w porównaniu z komórkami traktowanymi nośnikiem. Ponieważ introny są wyciskane z powstającego mRNA w celu wytworzenia dojrzałego mRNA, które składa się tylko z sekwencji eksonów, liczbę dojrzałych mRNA na komórkę można policzyć, określając ilościowo liczbę zielonych plam. Wykreślenie tych danych pozwala następnie na zaobserwowanie przesunięcia w dystrybucji dojrzałej komórki mRNA GREB1 i zagregowanej zmiany fałdowania w populacji komórek po traktowaniu E2.
C-FISH pozwala na sekwencyjne badanie wielu gatunków RNA, MERFISH to technika kodowania kreskowego w celu znacznego zwiększenia multipleksowania, a iFISH służy do jednoczesnego badania RNA i białek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek RNA (smFISH) jest potężną techniką służącą do ilościowego określania poziomów oraz lokalizacji RNA na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta umożliwia analizę zmienności RNA między komórkami oraz między allelami, dostarczając informacji na temat transkrypcji genów i odpowiedzi RNA na bodźce zewnętrzne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Wstęp
- metoda smFISH umożliwia badanie zawartości RNA w poszczególnych komórkach.
- Dostarcza ona informacji przestrzennych na temat rozmieszczenia RNA.
- Metoda ta jest kluczowa dla zrozumienia dynamiki ekspresji genów.
- Może ona ujawnić zmienność poziomów RNA wynikającą z czynników zewnętrznych.
Cel badania
- W celu walidacji protokołów laboratoryjnych dla smFISH.
- W celu umożliwienia dokładnej kwantyfikacji specyficznych RNA.
- W celu ułatwienia obrazowania i analizy RNA na poziomie pojedynczej komórki.
Zastosowane metody
- Komórki poddaje się działaniu agonisty receptora estrogenowego.
- Komórki utrwala się przy użyciu buforu do fiksacji.
- Etapy przemywania wykonuje się w zimnym, sterylnym PBS.
- Komórki inkubuje się w 70% etanolu w celu konserwacji.
Główne wyniki
- smFISH pozwala na dokładną kwantyfikację poziomów RNA.
- Umożliwia on określenie lokalizacji przestrzennej specyficznych cząsteczek RNA.
- Zmienność zawartości RNA może być skutecznie analizowana.
- Wyniki dostarczają informacji na temat odpowiedzi komórkowych na bodźce.
Wnioski
- smFISH jest zwalidowaną metodą analizy RNA w pojedynczych komórkach.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie procesów transkrypcji genów.
- Technika ta jest cenna w badaniu dynamiki RNA w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda smFISH (single molecule FISH) umożliwia precyzyjną kwantyfikację transkrypcyjnie aktywnych alleli oraz lokalizację RNA na poziomie pojedynczej komórki, rozwiązując problem heterogeniczności komórkowej w analizie ekspresji genów. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania i walidacji celów terapeutycznych poprzez ujawnienie odpowiedzi transkrypcyjnych na bodźce w ujęciu komórka-do-komórki oraz specyficznym dla danego allela. Integracja smFISH z procesami badawczymi wspiera podejmowanie decyzji w oparciu o ocenę ryzyka oraz priorytetyzację portfolio dzięki dostarczaniu wysokorozdzielczych, ilościowych danych na temat dynamiki regulacji genów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację nowo powstałego oraz dojrzałego RNA na poziomie pojedynczej komórki i allelu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie aktywności transkrypcyjnej w odpowiedzi na konkretne zabiegi.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i modulacji szlaków.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów genowych poprzez przestrzenną i ilościową analizę RNA.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe odczyty dla standaryzacji i powtarzalności testu.
- Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie (high-content screening) odpowiedzi transkrypcyjnych w zróżnicowanych populacjach komórek.
- Wspiera opracowywanie skalowalnych potoków obrazowania i analizy dla dalszych etapów procesowych.
- Dostarcza wiarygodnych danych do oceny związków na podstawie modulacji transkrypcyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie danych transkrypcyjnych z pojedynczych komórek do modeli istotnych dla danej choroby w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od wczesnych etapów odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie zmian w ekspresji genów.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w modelach przedklinicznych poprzez rozstrzygnięcie zmienności międzykomórkowej.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając ilościowych, rozdzielonych przestrzennie danych RNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika smFISH integruje się z continuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, stanowiąc wielokrotnie wykorzystywalną platformę do ilościowej analizy pojedynczych komórek.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację aktywności transkrypcyjnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i alleli.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i screeningu związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary przestrzenne i ilościowe nowo powstałego oraz dojrzałego RNA w celu rzetelnego porównywania danych.
- Badania translacyjne: Łączy dane o ekspresji genów w pojedynczych komórkach z modelami chorób i strategiami biomarkerowymi.
- Wykorzystanie przedsiębiorstw: Ustanawia zestandaryzowany, skalowalny przepływ pracy dla bieżących zastosowań B+R w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację i obrazowanie RNA pojedynczych komórek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową dzięki dostarczaniu danych o wysokiej rozdzielczości na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów badawczych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obrazowania pojedynczych komórek, projektowania sond oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymagane są zaawansowane platformy mikroskopowe oraz infrastruktura obliczeniowa do przetwarzania danych.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i analizy między zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody do różnych typów komórek lub modeli tkankowych.
- Wysoka jakość akwizycji obrazu oraz optymalizacja stosunku sygnału do szumu są kluczowe dla dokładnej kwantyfikacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Fixation
1:14
RNA FISH Hybridization
2:16
Imaging Preparation
3:08
High Resolution Microscopy and Image Processing
4:05
Image Analysis
4:45
Results: Representative Image Segmentation and E2-Induced GREB1 Quantification
5:56
Conclusion
