Ilościowe wykrywanie kwasu moczowego metodą SERS poprzez tworzenie precyzyjnych nanopołączeń plazmonicznych w agregatach nanocząstek złota i dyniowatego

Protokół ten oferuje wszechstronną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania kwasu moczowego z wysoką czułością. W związku z tym jest to protokół do zastosowań diagnostycznych i klinicznych. Protokół ten może szybko określić ilościowo biomarkery w złożonej matrycy, takiej jak płyny ustrojowe.

Technika ta może być potencjalnie rozszerzona o diagnozowanie chorób, które wykorzystują kwas moczowy jako biomarker, takich jak dna moczanowa, nadciśnienie i choroby sercowo-naczyniowe. Może być również stosowany do wykrywania i ilościowego określania innych substancji niebezpiecznych do monitorowania środowiska. Próbując zastosować protokół po raz pierwszy, naukowcy mogą mieć trudności z utworzeniem stabilnych agregatów nanocząstek CB7 i złota.

Zaleca się mieszanie nanocząstek złota w roztworach CB7 za pomocą sonikacji, ponieważ inne techniki mogą wpływać na kinetykę agregacji. Film przedstawiający kluczowe etapy dodawania mieszania CB7 może zwiększyć szansę na sukces i powtarzalność dla badaczy, którzy dopiero zaczynają korzystać z systemu. Aby uzyskać syntezę nasion złota, rozpuść 98,5 miligrama aury w 10 mililitrach dejonizowanej wody w szklanej fiolce, aby uzyskać 25 milimolowy roztwór chlorku aury i 64,5 miligrama cytrynianu sodu w proszku w 500 mikrolitrach wody dejonizowanej w szklanej fiolce.

Następnie rozcieńczyć jeden mililitr roztworu chlorku aury 99 mililitrami wody w 250-mililitrowej butelce z niebieską nakrętką, aby uzyskać 0,25 milimolowy roztwór chlorku aury i dodać 99,5 mililitra 0,25 milimolowego roztworu chlorku aury do 250-mililitrowej kolby okrągłodennej z trzema szyjkami wyposażonej w skraplacz. Następnie podgrzej roztwór w temperaturze 90 stopni Celsjusza pod energicznym mieszaniem przez 15 minut przed wstrzyknięciem 500 mikrolitrów roztworu cytrynianu sodu do kolby, kontynuując mieszanie, aż roztwór zmieni kolor na rubinowoczerwony. Aby zainicjować zasiewany wzrost nanocząstek złota, przenieś 25 mililitrów roztworu nasion złota do 50-mililitrowej probówki i schłodź roztwór do 70 stopni w ThermoMixerze.

Podczas gdy roztwór stygnie, napełnij trzymililitrową jednorazową strzykawkę Luer lock 2,5 mililitra 25-milimolowego roztworu chlorku aury i napełnij kolejną trzymilimetrową jednorazową strzykawkę Luer lock 2,5 mililitra 60-milimolowego roztworu cytrynianu sodu. Umieścić strzykawki w pompkach strzykawkowych i użyć adapterów Luer-to-MicroTight, aby podłączyć rurkę PEEK o średnicy wewnętrznej 150 mikromolów do strzykawek. Włóż rurkę do probówki wirówkowej zawierającej schłodzony roztwór nasion złota w ThermoMixerze i ustaw obie pompy strzykawkowe na dozowanie 167,5 mikrolitra roztworu w ciągu 20 minut.

Ustaw prędkość obrotową mieszalnika ThermoMixer na 600 obrotów na minutę i naciśnij przycisk Start na pompie strzykawkowej zawierającej 25-milimolowy roztwór chlorku aury. Po dwóch minutach nacisnąć przycisk Start na pompie strzykawkowej zawierającej 60-milimolowy roztwór cytrynianu sodu. Po 30 minutach usunąć podwielokrotność roztworu nanocząstek złota do analizy.

Aby przygotować 0,4 milimolowy roztwór CB7, dodaj 4,65 miligrama CB7 do 15 mililitrowej szklanej fiolki i 10 mililitrów wody do fiolki. Po szczelnym zamknięciu, poddać fiolkę sonikacji w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia ciała stałego CB7. Aby przygotować 0,4 milimolowy roztwór kwasu moczowego, dodaj 2,69 miligrama kwasu moczowego do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj 40 mililitrów wody do probówki.

Po szczelnym zamknięciu mieszaj mieszaninę w ThermoMixerze ustawionym na 70 stopni Celsjusza i 800 obrotów na minutę przez dwie godziny. Gdy roztwór ostygnie do temperatury pokojowej, rozcieńczyć jeden mililitr 0,4 milimolowego roztworu kwasu moczowego dziewięcioma mililitrami wody w szklanej fiolce o pojemności 15 mililitrów, aby uzyskać 0,04 milimolowy roztwór kwasu moczowego. Po szczelnym zamknięciu, poddać fiolkę sonikacji przez 30 sekund.

Aby przygotować kompleksy CB7-kwas moczowy, dodaj 750 mikrolitrów 0,4 milimolowego roztworu CB7 i 750 mikrolitrów 0,4 milimolowego roztworu kwasu moczowego do 1,5 mililitrowej probówki i poddaj mieszaninę sonikacji przez 30 sekund. Następnie trzymaj rurkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zapewnić utworzenie kompleksów gospodarz-gość. Kliknij ikonę kreatora aplikacji do spektroskopii w oprogramowaniu systemowym Ramana i wybierz opcję Raman.

Rozpocznij nową akwizycję i ustaw czas integracji na 30 sekund, skany na średnią na pięć, a wagon na zero. Następnie zapisz widmo tła i wprowadź długość fali lasera. W celu utworzenia substratu SERS dodaj 900 mikrolitrów 40-nanometrowego roztworu nanocząstek złota i 100 mikrolitrów wstępnie uformowanego roztworu kompleksu CB7-kwasu moczowego do 1,5 mililitrowej probówki i sonikuj, aż roztwór zmieni kolor z rubinowoczerwonego na fioletowy.

Przenieść roztwór próbki do półmikrokuwety i umieścić kuwetę w uchwycie na próbkę Ramana. Zamknij pokrywę i rozpocznij pomiar. Następnie ustaw automatyczne zapisywanie, aby rejestrować pięć kolejnych widm SERS.

Widma ultrafioletowe w zakresie widzialnym dla zsyntetyzowanych nanocząstek złota pokazują przesunięcie zlokalizowanych pików rezonansu plazmonów powierzchniowych z 521 do 529 nanometrów po 10 krokach wzrostu, podczas gdy dane dotyczące dynamicznego rozpraszania światła pokazują wąski rozkład rozmiarów, gdy rozmiar nanocząstek wzrasta z 25,9 do 42,8 nanometrów. Średnie rozmiary G0, G5 i G10 mierzone na podstawie transmisyjnych obrazów elektronów wynoszą odpowiednio około 20, 33 i 40 nanometrów. W tych reprezentatywnych analizach utworzono kompleksy gospodarz-gość CB7 i kwasu moczowego z pustym CB7 pośredniczącym w tworzeniu precyzyjnych nanopołączeń plazmonicznych w nanogatunkach złota CB7, wspieranych przez charakterystyczne sygnały kwasu moczowego w widmie SERS.

I odwrotnie, przy braku CB7 nie można zaobserwować żadnych sygnałów SERS kwasu moczowego, co ilustruje kluczową rolę CB7 w wyzwalaniu agregacji nanocząstek złota. Wysoka czułość schematu detekcji przedstawionego w tym protokole jest wykazana przez obserwację wyraźnych sygnałów SERS od pików kwasu moczowego na 640 i 1130 odwrotnych centymetrach aż do granicy wykrywalności 0,2 mikromola. Ponadto uzyskano bardzo silne korelacje między intensywnością SERS a logarytmicznymi stężeniami kwasu moczowego za pomocą prawa potęgowego dla obu pików z regionami liniowymi znajdującymi się w zakresie od 0,2 do 2 mikromolowych.

Kwas moczowy ma niską rozpuszczalność w wodzie, dlatego przed następnym krokiem należy upewnić się, że kwas moczowy w proszku jest miękki. Można przeprowadzić zaawansowaną analizę danych, co umożliwia ilościowe określenie wielu biomarkerów obecnych w matrycy.