Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Obecny protokół szczegółowo pokazuje podsiatkówkowe dostarczanie całych organoidów siatkówki w dużym modelu zwierzęcym, mając na celu opracowanie metod terapii komórkowej w przypadku zwyrodnienia siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na dostarczanie organoidów bezpośrednio do tkanki docelowej, czyli siatkówki. Technika ta ma na celu leczenie zaawansowanych, oślepiających stanów zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki lub wrodzona ślepota Lebera.

Procedurę zademonstruje dr Peterson Jones. W celu implantacji organoidów podsiatkówkowych użyj nożyczek do tenotomii Stevensa, aby wykonać kantotomię boczną o długości od 0,5 do 1 centymetra u czteromiesięcznego kota znieczulonego na czczo na noc i umieść wziernik powieki Barraquer o odpowiedniej wielkości w nacięciu, aby powieki były otwarte z asystentem chirurgicznym regularnie irygującym rogówkę za pomocą BSS przez cały zabieg. Użyj kleszczy do wiązania rogówki Castroviejo o grubości 0,5 cala i małego hemostatu komara, aby delikatnie chwycić spojówkę opuszkową obok rąbka.

Umieść dwa jedwabne szwy 6-0 w spojówce bezpośrednio przylegającej do rąbka w pozycjach godziny 4 i 8, aby utrzymać oko w pierwotnym spojrzeniu i cofnąć trzecią powiekę. Zacisnąć końce szwów małymi hemostatami komarów, aby ułatwić ich manipulację, i umieścić kolejny szew w pozycji godziny 12 na rąbku częściowo przez grubość rąbka, uważając, aby nie przebić oka. Luźno zawiąż szew, odcinając koniec na krótko, i umieść szew podtrzymujący w spojówce bezpośrednio przylegającej do rąbka w pozycji godziny 4, aby utrzymać oko i pierwotne spojrzenie.

Odbij spojówkę opuszkową między godziną 10 a 2 i użyj nożyczek do tenotomii, aby naciąć spojówkę dwa do trzech milimetrów od rąbka. Podważ spojówkę i oczyść torebkę Tenon, aby odsłonić twardówkę w miejscach portu witrektomii na godzinie drugiej i 10 w odległości od trzech do pięciu milimetrów od rąbka. Użyj suwmiarki, aby zidentyfikować miejsca sklerotomii, unikając głównych naczyń twardówkowych, które mogą być widoczne u kota.

Planując trzymilimetrowy obszar w porcie instrumentu na godzinie 10 dla praworęcznego chirurga, należy wstępnie umieścić szwy krzyżowe poliglaktyny 6-0 lub 7-0 bez wiązania w miejscach proponowanych sklerotomii. Po założeniu szwów poproś asystenta, aby chwycił szwy rozwleczone na godzinie 12, aby pomóc utrzymać gałkę ziemską na miejscu, i użyj 0,12-milimetrowych kleszczy Castroviejo, aby przytrzymać tkankę obok miejsca sklerotomii. Używa trokara do wprowadzenia portu witrektomii o rozmiarze 23 przez twardówkę zarówno w pozycji godziny 2, jak i 10 pod kątem w kierunku nerwu wzrokowego, aby uniknąć kontaktu z soczewką, i używa kleszczy do wiązania, aby delikatnie popchnąć port irygacyjny, aby określić, czy końcówki można uwidocznić w ciele szklistym.

Poproś asystenta, aby umieścił powiększającą soczewkę witrektomijną irygacyjną Machemer na rogówce, aby umożliwić wizualizację tylnego odcinka oka, oraz frez do sondy witrektomicznej o rozmiarze 23 przez port instrumentu, aby wykonać częściową witrektomię rdzenia. Następnie wprowadzić igłę jednomililitrowej strzykawki zawierającej jeden mililitr roztworu triamcynolonu do portu instrumentu i wstrzyknąć od 250 do 500 mikrolitrów zawiesiny krystalicznej. Po dostarczeniu roztworu przesuń sondę witrektomii przez port instrumentu, aby zbliżyć się do głowy nerwu wzrokowego, tak aby port był skierowany w stronę przeciwną do powierzchni siatkówki.

Użyj wysokiej próżni, aby odłączyć powierzchnię ciała szklistego od siatkówki, włóż wstrzykiwacz przez port instrumentu w kierunku powierzchni siatkówki i wyciśnij końcówkę kaniuli. Delikatnie nacisnąć końcówkę powierzchni siatkówki i poprosić asystenta, aby lekko szybko nacisnął tłok strzykawki, aby rozpocząć odwarstwienie siatkówki, zmniejszając ciśnienie wstrzyknięcia, aby umożliwić powolne zwiększanie odwarstwienia siatkówki, aż do osiągnięcia pożądanego rozmiaru. Użyj kaniuli wstrzykiwacza o rozmiarze 41, aby nieznacznie powiększyć odwarstwienie, aż będzie można wprowadzić nożyczki siatkówki i usuń port twardówki na godzinie 10.

Następnie użyj prostego noża do cięcia o średnicy 2.850 milimetra skierowanego w stronę nerwu wzrokowego, aby uniknąć dotykania soczewki, aby powiększyć sklerotomię w tym miejscu. Wykonaj retinotomię na pęcherzyku z dala od nerwu wzrokowego, aby uniknąć uszkodzenia włókien nerwowych siatkówki pochodzących z przeszczepionego obszaru i uniknąć przecinania głównych naczyń siatkówki, aby zmniejszyć ryzyko krwotoku. Aby wszczepić organoidy, wprowadź szklaną kapilarnę wypełnioną organoidami przez powiększoną sklerotomię w kierunku miejsca retinotomii i użyj końcówki naczynia włosowatego, aby lekko otworzyć retinotomię, aby umożliwić dostęp do ujścia pęcherzyka podsiatkówkowego.

Poproś asystenta, aby ponownie powoli nacisnął tłok wstrzykiwacza, aby wstrzyknąć organoidy do pęcherzyka podsiatkówkowego. BSS powinien przejść do organoidów, narządów i przepłukać retinotomię. Po dostarczeniu wszystkich organoidów pozostaw szklaną kapilarnę na miejscu na kilka sekund, a następnie powoli usuń naczynia włosowate z oka, uważając, aby uniknąć nagłego uwolnienia płynu.

Po usunięciu naczynia włosowatego zamknij sklerotomię za pomocą wstępnie założonego szwu w kształcie krzyża. Poproś asystenta, aby usunął port infuzyjny i szybko zawiązał szew sklerotomijny i zamknął peritomię szwami poliglaktynowymi w prosty, ciągły wzór. Zamknij kantotomię boczną za pomocą szwu poliglaktynowego 6-0 i szwów skórnych z figury ósemkowej, aby wykonać boczny kant i użyj prostych przerywanych szwów skórnych, aby zamknąć resztę rany.

Następnie należy podać odpowiedni pooperacyjny koktajl sterydowy i antybiotykowy. Obciążenie ludzkimi pluripotencjalnymi organoidami siatkówki pochodzącymi z komórek macierzystych można potwierdzić w szklanej kaniuli urządzenia do wstrzykiwania oraz podczas operacji poprzez bezpośrednią wizualizację. Obecność organoidów w przestrzeni podsiatkówkowej można potwierdzić pooperacyjnie za pomocą badania okulistycznego i obrazowania dna oka.

Przed eutanazją można również wykonać konfokalną skaningową oftalmoskopię laserową i obrazowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej w celu oceny położenia organoidów. Techniki te można wykorzystać do wykazania trwałości organoidów siatkówki w przestrzeni podsiatkówkowej między siatkówką nerwową a nabłonkiem barwnikowym siatkówki oka biorcy. Analizy histologiczne i immunohistochemiczne można wykorzystać do zilustrowania przeżycia wykresów ksenogenicznych w przestrzeni podsiatkówkowej dużego oka u zwierzęcia z obniżoną odpornością.

Tylko osoby wykwalifikowane w chirurgii witreoretinalnej, takie jak przeszkoleni okuliści weterynaryjni lub chirurdzy witreoretinalni zaznajomieni z różnicami gatunkowymi w kocim oku w porównaniu z ludzkim okiem, powinni podejmować się tej procedury. Technika przedstawiona w tym filmie powinna mieć zastosowanie do innych dużych modeli zwierzęcych, które są używane do tłumaczenia technik chirurgicznych witreoretinalnych na potrzeby klinik.