Izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki
5 listopada 2020
Sok z trzustki jest cennym źródłem biomarkerów ludzkiego raka trzustki. Opisujemy tutaj metodę procedury pobrania śródoperacyjnego. Aby sprostać wyzwaniu polegającemu na zastosowaniu tej procedury w modelach mysich, sugerujemy alternatywną próbkę, płyn śródmiąższowy guza, i opisujemy tutaj dwa protokoły jego izolacji.
Opisana tutaj metoda izolacji płynu proksymalnego zarówno u ludzi, jak i u myszy, może być zastosowana do badania mikrośrodowiska raka trzustki w celu identyfikacji nowych biomarkerów choroby. Korzystając z tego prostego protokołu, możliwe jest przetłumaczenie wyników klinicznych z soku trzustkowego na mysie modele PDAC w celu przeprowadzenia badań mechanistycznych. Sok trzustkowy jest w dużej mierze niezbadanym płynem ustrojowym, który okazał się obiecującym źródłem cennych biomarkerów pomagających w diagnostyce przedoperacyjnej i profilowaniu pacjentów.
Ja zademonstruję pierwszą część protokołu, a Marialuisa Barbagallo, doktor habilitowany z naszego laboratorium, zademonstruje drugą część protokołu. Oszacuj lokalizację przewodu trzustkowego na podstawie pomiarów uzyskanych podczas obrazowania. Następnie wykonaj badanie dotykowe przedniej powierzchni trzustki, aby określić jej dokładną lokalizację.
Przytrzymaj głowę trzustki w dwunastnicy od spodu i podnieś ją lewą ręką, zaznaczając położenie przewodu trzustkowego pierwszą cyfrą. Prawą ręką włóż trzymililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 25 do trzustki, tuż dystalnie do lewego kciuka. Zdecyduj o głębokości penetracji i stopniu nachylenia igły na podstawie pomiarów przedoperacyjnych oraz wrażenia penetracji ściany kanału.
Pobrać sok za pomocą strzykawki. Jeśli nie jest możliwe pobranie soku, przenieś igłę, próbując kaniulować przewód trzustkowy. Po pobraniu soku trzustkowego przenieś go poza sterylne pole i przenieś do trzymililitrowej probówki próżniowej EDTA.
Trzymaj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż próbka zostanie przeniesiona do laboratorium. Aby przetworzyć sok trzustkowy, odwiruj go w temperaturze 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć wszelkie komórki lub zanieczyszczenia. Odzyskać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszych analiz.
Aby wyizolować płyn śródmiąższowy guza lub TIF, przez wirowanie przeciąć guz na pół, przepłukać dwie części w PBS i delikatnie osuszyć je na bibule filtracyjnej, poruszając się tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć parowania z guza. Natychmiast przenieś guz do 20-mikrometrowego nylonowego sitka komórkowego, przymocowanego do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Odwirować probówkę o stężeniu 400 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odzyskaj TIF z dna probówki, a następnie podwielokrotn go i natychmiast zamroź na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Aby wyizolować TIF za pomocą elucji, pokrój guz na małe kawałki nożyczkami lub skalpelem i dokładnie spłucz je zimnym PBS.
Przenieś kawałki guza do 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 500 mikrolitrów PBS z koktajlem inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji analitów. Inkubuj tkankę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wykonaj serię etapów wirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie komórki z próbki.
Odzyskiwanie supernatantu po każdym odwirowaniu i przenoszenie go do nowej probówki. Po ostatnim odwirowaniu natychmiast podwielokrotność próbki TIF należy podzielić na porcje i zamrozić na suchym lodzie. Przechowuj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.
Protokół ten zastosowano do uzyskania soku trzustkowego od pacjentów z PDAC i innymi łagodnymi dolegliwościami trzustki. Po przefiltrowaniu szerokich sygnałów NMR makrocząsteczek widoczne były sygnały z metabolitów o małej masie cząsteczkowej. Nadzorowana analiza OPLS-DA wykazała, że profil metaboliczny w soku trzustkowym był w stanie rozróżnić pacjentów z PDAC i bez PDAC z dokładnością 82,4%Co ciekawe, analiza metabolomiczna przeprowadzona na próbkach osocza od tych samych pacjentów nie dała takiej samej mocy dyskryminującej.
Aby wykazać, że zawartość płynu śródmiąższowego guza niezawodnie odzwierciedla zmiany w mikrośrodowisku guza, dwie linie komórkowe raka trzustki o przeciwstawnych wskaźnikach glikolitycznych wstrzyknięto podskórnie myszom. Po wycięciu guzów oznaczono ilościowo stężenia glukozy i mleczanu. Płyn śródmiąższowy guza z guzów o wysokim stopniu glikolityzmu zawierał mniej glukozy i więcej mleczanu w porównaniu z guzami o niskiej glikolityce.
W tym badaniu przeprowadziliśmy analizę metabolomiczną. Jednak te proksymalne płyny nadają się do wielu innych zastosowań, takich jak spektrometria mas i profilowanie mikroRNA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę śródoperacyjnego pobierania soku trzustkowego, który stanowi cenne źródło biomarkerów raka trzustki. Dodatkowo wprowadzono alternatywny rodzaj próbki — płyn śródmiąższowy guza — wraz z protokołami jego izolacji w modelach mysich.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Odkrywanie biomarkerów
Wstęp
- Sok trzustkowy jest niedostatecznie zbadanym źródłem biomarkerów.
- Posiada on potencjał w pomocniczej diagnostyce przedoperacyjnej.
- Zrozumienie mikrośrodowiska raka trzustki ma kluczowe znaczenie.
- Przeniesienie wyników badań na ludzi do modeli mysich może usprawnić badania.
Cel badania
- W celu wyizolowania soku trzustkowego oraz płynu śródmiąższowego guza do identyfikacji biomarkerów.
- W celu przedstawienia protokołów applicable w modelach ludzkich oraz mysich.
- W celu ułatwienia badań mechanistycznych nad rakiem trzustki.
Zastosowane metody
- Śródoperacyjne pobieranie soku trzustkowego.
- Izolacja płynu śródtkankowego guza.
- Techniki obrazowania służące do lokalizacji przewodu trzustkowego.
- Palpacja trzustki w celu precyzyjnej identyfikacji.
Główne wyniki
- Przedstawiono protokoły izolacji płynów.
- Wskazano na potencjał soku trzustkowego jako źródła biomarkerów.
- Wykazano możliwość przeniesienia wyników klinicznych na modele mysie.
- Stworzono podstawy dla przyszłych badań nad mechanizmami.
Wnioski
- Sok trzustkowy oraz płyn śródmiąższowy guza są obiecującymi materiałami do badań nad biomarkerami.
- Opisane protokoły mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia raka trzustki.
- Konieczne są dalsze badania w celu pełnego wykorzystania potencjału tych płynów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja płynów proksymalnych umożliwia bezpośrednią analizę mikrośrodowiska gruczolakoraka trzustki, oferując drogę do odkrywania biomarkerów, która łączy obserwacje kliniczne z przedklinicznymi badaniami mechanistycznymi. Dostarczając technicznie dostępnych metod pobierania soku trzustkowego oraz płynu śródmiąższowego guza zarówno w układach ludzkich, jak i mysich, protokół ten wspiera wysiłki w zakresie walidacji celów i opracowywania testów skoncentrowanych na zmianach mikrośrodowiskowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć poprzez uzyskiwanie płynów istotnych dla przebiegu choroby, które odzwierciedlają interakcje między komórkami zrębu i komórkami nowotworowymi, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów opracowywania leków w raku trzustki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację płynów koncentrujących biomarkery mikrośrodowiska guza.
- Wartość operacyjna: Zapewnia istotny w kontekście choroby system do funkcjonalnej walidacji celów z wykorzystaniem biomarkerów z płynów proksymalnych.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez analizę porównawczą glikolitycznych fenotypów guzów za pomocą oznaczania poziomu glukozy i mleczanu w TIF.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane płyny biologiczne do dalszych zastosowań, takich jak spektrometria mas i profilowanie microRNA.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne protokoły izolacji (wirowanie i elucja) odpowiednie dla skalowalności analizy.
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów metabolitów, które umożliwiają wykrywanie biomarkerów gotowych do przesiewu o wysokiej mocy dyskryminacyjnej (82,4% dokładności w OPLS-DA).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ustanawia ciągłość systemu istotną dla przebiegu choroby poprzez przeniesienie wyników analiz soku trzustkowego człowieka na mysie modele TIF.
- Wartość operacyjna: Ułatwia walidację przedkliniczną poprzez izolację TIF z podskórnych modeli nowotworowych odzwierciedlających zmiany w mikrośrodowisku.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez powiązanie profili biomarkerów w płynach z fenotypem nowotworu.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum odkryć – od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając profilowanie mikrośrodowiska, które dostarcza informacji dla badań mechanistycznych oraz kampanii przesiewowych opartych na biomarkerach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez izolację płynów odzwierciedlających interakcje między stromą a guzem w PDAC.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów poprzez standaryzowaną izolację TIF i soku trzustkowego, dostarczając ilościowych wyników dotyczących metabolitów i kwasów nukleinowych.
- Analityka: Dostarcza mierzalne biomarkery (glukoza, mleczan, metabolity) do analizy porównawczej stanów oraz przesiewania fenotypowego.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez wykazanie, że TIF odzwierciedla stan glikolityczny guza w modelach mysich.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną możliwość izolacji płynów proksymalnych w układach ludzkich i mysich, redukując bariery w translacji modeli.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki wykrywaniu biomarkerów mikrośrodowiskowych i walidacji celów w PDAC.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki prostym technikom wirowania i elucji w izolacji TIF.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie biomarkerów płynowych z fenotypem guza, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o dyskryminujące profile biomarkerów w płynach (dokładność 82,4% w rozróżnianiu PDAC od non-PDAC).
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgicznego obchodzenia się z płynami oraz wycinania guzów w celu izolacji płynów proksymalnych.
- Niezbędny jest sprzęt do wirowania (400 G, 4°C) oraz sterylne techniki postępowania z płynami podczas przetwarzania soku trzustkowego i TIF.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa obejmująca zespoły chirurgiczne, patomorfologiczne i analityczne w celu zapewnienia integralności próbek.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji metody izolacji TIF u myszy poprzez wirowanie lub elucję, w zależności od wielkości tkanki i zastosowań w dalszych etapach analizy.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak trudności techniczne w pobieraniu soku trzustkowego od myszy, co sprawia, że TIF musi służyć jako substytut.
