Name: Izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Naucz się izolować sok trzustkowy i płyn międzykomórkowy guza w modelach ludzkich i mysich w celu identyfikacji biomarkerów raka trzustki. Ta metoda umożliwia badanie mikrośrodowiska nowotworowego i mechanizmów choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Robercie Migliore za pomoc techniczną. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie ze środków Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) w ramach projektu IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dla wszystkich pacjentów zapisanych pobrano krew obwodową i sok trzustkowy podczas operacji, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyczny Instytucji. Wszyscy pacjenci zostali włączeni do badania po podpisaniu świadomej zgody, w tym po pobraniu próbek biologicznych i danych klinicznych. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Instytucji (numer protokołu ICH-595, zatwierdzenie wydane w maju 2009 r.). Procedury dotyczące myszy i opieki nad nimi były zgodne z wytycznymi UE i instytucjonalnymi (protokół ID 121/2016-PR).
1. Izolacja soku trzustkowego
UWAGA: Pobranie soku trzustkowego odbywa się w kontekście otwartej procedury resekcji trzustki (np. pankreatykoduodenektomia, całkowita pankreatektomia, dystalna pankreatektomia) przez wykwalifikowanych chirurgów trzustki.
<ol>
	<li>Selekcja pacjentów
	<ol>
		<li>Do zabiegu należy wziąć pod uwagę każdego pacjenta, u którego zaplanowano otwartą resekcję trzustki.</li>
		<li>Potwierdzić włączenie, jeśli rozmiar głównego przewodu trzustkowego jest uważany za wystarczający, aby umożliwić pobranie soku trzustkowego. Minimalna granica średnicy głównego przewodu trzustkowego wynosi 2 mm w obrazowaniu CT ze wzmocnieniem kontrastowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie przedoperacyjne przewodu trzustkowego w obrazowaniu CT ze wzmocnieniem kontrastowym, aby pomóc w planowaniu pobrania soku trzustkowego
	<ol>
		<li>Trójwymiarowo zlokalizuj główny przewód trzustkowy w gruczole na poziomie szyi trzustki: zmierz odległość głównego przewodu trzustkowego od przedniego, górnego i dolnego brzegu trzustki na slajdach przekroju poprzecznego oraz renderingi koronalne i strzałkowe. Na sali operacyjnej należy skorzystać z tych pomiarów, aby określić w przybliżeniu właściwe miejsce, w którym należy nakłuć trzustkę, aby kaniulować przewód Wirsung i pobrać sok trzustkowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie materiału
	<ol>
		<li>Sterylny materiał: Otwórz sterylną kopertę z jedną igłą 25 G i jedną strzykawką 3 ml i umieść je w sterylnym polu we współpracy z pielęgniarką szorującą.</li>
		<li>Materiał niesterylny: Probówkę próżniową K2EDTA o pojemności 3 ml należy przechowywać w pobliżu na sali operacyjnej w celu przechowywania płynu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pacjenta
	<ol>
		<li>Ułóż pacjenta na łóżku na sali operacyjnej. Wywołać mieszane znieczulenie ogólne za pomocą Remifentanylu, Sevorane i Rocuronium, a następnie zaintubować i rozpocząć wentylację pacjenta. Ułóż pacjenta w pozycji odleżynowej z prawą ręką przyciśniętą do ciała, a lewą ręką odprowadzoną pod kątem 90° przytwierdzoną na podłokietniku.</li>
		<li>Zdezynfekuj skórę brzucha w miejscu nacięcia. Stwórz i utrzymuj sterylne pole na brzuchu otulające pacjenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabiegu chirurgicznego
	<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie podżebrowe i uzyskaj dostęp do jamy brzusznej. Ustaw retrakcję brzucha Rochard do odsłonięcia narządów.</li>
		<li>Odsłoń i zmobilizuj trzustkę poprzez manewr Kochera, otwarcie więzadła żołądkowo-kolkowego, nacięcie tkanki zaotrzewnowej wzdłuż górnej i dolnej granicy trzustki, tworząc płaszczyznę rozwarstwienia między szyją trzustki a żyłą krezkową górną położoną z tyłu.</li>
		<li>Po zmobilizowaniu i odsłonięciu trzustki przystąp do pobrania soku trzustkowego przed sekcją szyi trzustki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja i lokalizacja przewodu trzustkowego
	<ol>
		<li>Oszacuj położenie przewodu trzustkowego za pomocą pomiaru wykonanego podczas obrazowania, a następnie zbadaj palpacyjnie przednią powierzchnię trzustki, aby określić jej dokładną lokalizację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobranie soku trzustkowego
	<ol>
		<li>Chwyć głowę trzustki i dwunastnicę od spodu i podnieś je lewą ręką, zaznaczając położenie przewodu trzustkowego pierwszą cyfrą.</li>
		<li>Chwycić prawą ręką strzykawkę o pojemności 3 ml z założoną igłą 25 G.</li>
		<li>Prawą ręką wbij igłę w trzustkę dystalnie do lewego kciuka. Zdecyduj o głębokości penetracji i stopniu nachylenia igły na podstawie pomiarów przedoperacyjnych i wrażenia penetracji ściany kanału.</li>
		<li>Pobrać sok za pomocą strzykawki. Jeśli nie jest możliwe odzyskanie soku, przesuń igłę w czterech kierunkach, próbując kaniulować przewód trzustkowy.</li>
		<li>Po pobraniu soku trzustkowego przenieś go poza sterylne pole i przenieś do probówki próżniowej K2EDTA o pojemności 3 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przeniesienia próbki do laboratorium i jak najszybciej przystąpić do dalszego przetwarzania. 
		UWAGA: Objętość soku trzustkowego, którą można odzyskać za pomocą tej procedury, jest bardzo zróżnicowana, z naszego doświadczenia wynika, że wynosi od około 0,2 ml do 3 ml. Ilość pobranego soku jest w dużym stopniu zależna od pacjenta: wymiaru przewodu Wirsunga i stanu funkcjonalnego trzustki (funkcjonowanie a gruczoł zanikowy). Z naszego doświadczenia wynika, że nie ma środka, który można by zastosować w celu zwiększenia ilości pobieranego soku trzustkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie soku trzustkowego
<ol>
	<li>Odwirować sok trzustkowy o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich komórek lub zanieczyszczeń. 
	UWAGA: Sok trzustkowy przed odwirowaniem powinien być klarowny i przezroczysty. Czasami może dojść do zanieczyszczenia krwi podczas operacji, co powoduje, że próbka wydaje się bardziej mętna i czerwona. Należy rozważyć wyłączenie takich próbek z dalszych analiz.</li>
	<li>Odzyskać supernatant, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszych analiz.</li>
</ol>
3. Indukcja guzów podskórnych
UWAGA: Mysie linie komórkowe Panc02 i DT6606 zostały uzyskane odpowiednio od prof. Lorenzo Piemontiego (San Raffaele Diabetes Institute, Mediolan, Włochy) i prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Turyn, Włochy), jak wcześniej opisano12.
<ol>
	<li>Wzrost komórek nowotworowych
	<ol>
		<li>Hodowla komórek Panc02 i DT6606 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2mM L-glutaminy i 1% antybiotyku penicylina-streptomycyna.</li>
		<li>Rozmrozić zamrożone komórki 1-2 tygodnie przed wstrzyknięciem guza, w zależności od tempa wzrostu linii komórkowej.</li>
		<li>Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% w sterylnych warunkach.</li>
		<li>Odłącz komórki z 0,025% roztworem trypsyny/EDTA na 5 minut w temperaturze 37 °C, gdy osiągną 80% konfluencji i wyeliminuj trypsynę przez odwirowanie. 
		UWAGA: DT6606 są pierwotnymi, nie unieśmiertelnionymi komórkami, pochodzącymi z myszy LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre i nie powinny być pasażowane więcej niż 3 razy przed wstrzyknięciem in vivo, aby zachować ich pierwotne cechy. Zaleca się rozmrożenie komórek DT6606 na 7-10 dni przed wstrzyknięciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja komórek nowotworowych in vivo
	<ol>
		<li>Trypsynizować komórki (patrz krok 3.1.4) i przemyć je raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Wyeliminuj PBS przez odwirowanie i ponowne zawieś komórki w świeżym PBS przed zliczeniem.</li>
		<li>Policz komórki i ponownie zawieś je w PBS w stężeniu 0,5-1 x 107 komórek/ml, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-1 x 106 komórek/100 μl do wstrzyknięcia każdej myszy. Przygotuj komórki w nadmiarze. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C lub na lodzie do końca zabiegu.</li>
		<li>Pogrupuj zwierzęta (8-tygodniowe samice myszy C57BL/6J) w różnych klatkach zgodnie z różnymi liniami komórkowymi lub zabiegami.</li>
		<li>Krępować zwierzęta ręcznie i znieczulać je mieszaniną ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) lub zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi procedurami.</li>
		<li>Ogolić miejsce wstrzyknięcia, zwykle bok nad nogą, golarką elektryczną i dokładnie oczyścić miejsce wstrzyknięcia alkoholem.</li>
		<li>Pipetować w górę i w dół zawiesiny komórek za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza, przesuwając tłok w górę i w dół. Przymocować igłę 25 G do strzykawki i popchnąć tłok do góry, aż zawiesina komórek dotrze do otworu igły.</li>
		<li>Uszczypnij skórę boku kleszczami z płaską końcówką i ostrożnie włóż igłę u podstawy fałdu skórnego między kleszcze, nie nakłuwając jamy otrzewnej ani mięśni. Aby sprawdzić prawidłowe położenie igły, delikatnie spróbuj przesunąć końcówkę igły na boki pod skórą. Igła powinna poruszać się swobodnie.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek (zawierających 0,5-1 x 106 komórek), delikatnie zaciskać miejsce wstrzyknięcia przez kilka sekund i powoli wyjmować igłę bez żadnych ruchów na boki.</li>
		<li>Wróć mysz z powrotem do klatki i monitoruj powrót do zdrowia po znieczuleniu.</li>
		<li>Sprawdzaj wzrost guza za pomocą suwmiarki przez 3-4 tygodnie. Poddaj zwierzęta eutanazji, gdy guzy osiągną około 0,5-1cm3 za pomocą CO2 lub zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi procedurami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja płynu śródmiąższowego guza (TIF)
<ol>
	<li>Wycięcie guzów podskórnych
	<ol>
		<li>Zablokuj kończyny zwierząt taśmą papierową i oczyść skórę alkoholem. Rozetnij skórę na brzuchu, aby oddzielić ją od otrzewnej i przejdź do kończyn. Wytnij guz wyrosły pod skórą boku za pomocą nożyczek, zacisków i ostatecznie skalpela.</li>
		<li>Zważ guz i trzymaj go w czystej probówce na lodzie do czasu wyizolowania TIF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja TIF przez odwirowanie
	<ol>
		<li>Przetnij guz na pół, szybko opłucz dwie części w PBS i delikatnie osusz je na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar PBS. Wykonaj te kroki tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć parowania z guza.</li>
		<li>Natychmiast przenieś guz do sitka z komórek nylonowych o wielkości 20 μm umieszczonego na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: To wirowanie o niskiej prędkości zachowuje integralność komórek, unikając zanieczyszczenia TIF przez przedział wewnątrzkomórkowy. Wyciek zawartości wewnątrzkomórkowej można przetestować w dalszych zastosowaniach, na przykład poprzez ocenę obecności wewnątrzkomórkowych białek porządkujących, takich jak białka rybosomalne25.</li>
		<li>Odzyskać TIF z dna probówki, ostatecznie podzielić go na porcje i natychmiast zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy. 
		Opcjonalnie: Na podstawie dalszej analizy proteomicznej, którą należy przeprowadzić, rozcieńczyć próbkę w PBS koktajlem inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji określonych cząsteczek. 
		UWAGA: W zależności od składu guza, w niektórych przypadkach bardzo małe guzy nie wytwarzają płynu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja TIF przez elucję
	<ol>
		<li>Pokrój guz na małe kawałki (≈1-3 mm3) nożyczkami lub skalpelem i dokładnie spłucz zimnym PBS. 
		UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby pracować szybko i wykonywać minimalne manipulacje, aby uniknąć uszkodzenia komórek.</li>
		<li>Przenieś kawałki guza do probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 500 μl PBS z koktajlem inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji analitów. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Odzyskać supernatant i przenieść go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia jakichkolwiek komórek z próbki.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie odwirować przy 2 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie odwirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń. Odzyskać supernatant. Natychmiast podwielokrotność próbki TIF należy podzielić na suchy lód i zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opisaliśmy technikę śródoperacyjnego pobierania soku trzustkowego, w dużej mierze niezbadaną biopsję płynu. Niedawno wykazaliśmy, że sok trzustkowy może być wykorzystywany jako źródło metabolicznych markerów choroby12. Analiza metabolomiczna innych płynnych biopsji, takich jakkrew 5,6,7, mocz 8 i ślina9, wykazała obiecujące wyniki w rozróżniani...

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej agresywnych nowotworów i wkrótce stanie się drugą najczęstszą przyczyną zgonów1,2,3. Jest on znany z immunosupresyjnego mikrośrodowiska oraz braku odpowiedzi na protokoły immunoterapii4. Obecnie resekcja chirurgiczna pozostaje jedyną opcją leczenia przyczynowego w przypadku PDAC, jednak często dochodzi do wczesnych nawrotów i powikłań pooperacyjnych. Brak specyficznych objawów aż do zaawansowanego stadium choroby uniemożliwia wczesną diagnozę, co przyczynia się do wysokiej śmiertelności. Ponadto nakładanie się objawów PDAC i innych łagodnych patologii trzustki może utrudniać szybkie i wiarygodne rozpoznanie przy zastosowaniu obecnych strategii diagnostycznych. Identyfikacja zmiennych związanych z konkretnymi patologiami trzustki mogłaby ułatwić proces podejmowania decyzji chirurgicznych i usprawnić profilowanie pacjentów.
Obiecujące wyniki w odkrywaniu biomarkerów osiągnięto przy użyciu łatwo dostępnych płynów ustrojowych, takich jak krew5,6,7, mocz8, ślina9 oraz sok trzustkowy10,11,12. W wielu badaniach wykorzystano kompleksowe podejścia typu „omiki”, takie jak techniki genomowe, proteomiczne i metabolomiczne, aby zidentyfikować cząsteczki kandydackie lub sygnatury, które mogłyby pozwolić odróżnić PDAC od innych łagodnych schorzeń trzustki. Niedawno wykazaliśmy, że sok trzustkowy, będący stosunkowo mało zbadanym płynem ustrojowym, może być wykorzystany do identyfikacji sygnatur metabolicznych u pacjentów o odmiennych profilach klinicznych12. Sok trzustkowy jest płynem bogatym w białka, w którym gromadzi się sekretom komórek przewodowych trzustki; przepływa on do głównego przewodu trzustkowego, a następnie do wspólnego przewodu żółciowo-trzustkowego. Ze względu na bliskość trzustki może on ulegać silnym wpływom zaburzeń mikrośrodowiska indukowanych przez masę guza (Rycina 1), a w związku z tym być bardziej informacyjny niż krew, mocz lub profilowanie oparte na tkankach. W kilku badaniach zbadano potencjał soku trzustkowego w identyfikacji nowych biomarkerów choroby przy użyciu różnych metod, w tym analizy cytologicznej13, analizy proteomicznej z wykorzystaniem spektrometrii mas14,15, oceny markerów genetycznych i epigenetycznych, takich jak mutacje K-ras i p5316,17, zmian w metylacji DNA18 oraz miRNA19. Technicznie sok trzustkowy może być pobierany śródoperacyjnie lub za pomocą procedur małoinwazyjnych, takich jak ultrasonografia endoskopowa, retrogradna cholangiopankreatografia lub endoskopowy pobór wydzieliny z dwunastnicy20. Nie jest jeszcze jasne, w jakim stopniu skład soku trzustkowego zależy od zastosowanej techniki pobierania. Opisujemy tutaj procedurę pobierania śródoperacyjnego i wykazujemy, że sok trzustkowy może stanowić cenne źródło biomarkerów PDAC.
<img alt="Schemat diagnostyki guza trzustki, przedstawiający pobieranie soku trzustkowego do analizy nowotworowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie pobierania soku trzustkowego. (A) Schemat przedstawiający wydzielanie soku trzustkowego do przewodu trzustkowego oraz jego pobieranie podczas operacji. Wstawka pokazuje powiększenie mikrośrodowiska guza: sok trzustkowy gromadzi cząsteczki uwalniane przez komórki nowotworowe i zrębowe w przewodach trzustkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Pozyskiwanie soku trzustkowego w genetycznych i ortotopowych modelach PDAC u myszy byłoby pożądane w celu wykorzystania tego płynu biologicznego w przedklinicznych badaniach mechanistycznych; jednak procedura ta może być bardzo wymagająca technicznie i nie jest możliwa do zastosowania w prostszych modelach, takich jak guzy podskórne. Z tego powodu zidentyfikowaliśmy płyn śródmiąższowy guza (TIF) jako alternatywne źródło w miejsce soku trzustkowego, ze względu na jego podobną właściwość pełnienia roli wskaźnika zaburzeń w otoczeniu. Płyn śródmiąższowy (IF) to płyn pozakomórkowy, znajdujący się poza naczyniami krwionośnymi i limfatycznymi, który obmywa komórki tkankowe21. Skład IF zależy zarówno od ukrwienia narządu, jak i od wydzielania miejscowego; w rzeczywistości komórki otaczające aktywnie produkują i wydzielają białka do IF21. Przestrzeń śródmiąższowa odzwierciedla zmiany mikrośrodowiskowe w otaczających tkankach, a zatem może stanowić cenne źródło do odkrywania biomarkerów w kilku kontekstach patologicznych, takich jak guzy. Wysokie stężenie lokalnie wydzielanych białek w TIF może być wykorzystane do identyfikacji cząsteczek kandydackich do testowania jako biomarkery prognostyczne lub diagnostyczne w osoczu22,23,24. Kilka badań wykazało, że TIF jest odpowiednią próbką dla wysokoprzepustowych podejść proteomicznych, takich jak techniki spektrometrii mas23,24,25, a także dla podejść multiplex ELISA26 oraz profilowania microRNA27.
Zaproponowano kilka podejść do izolacji IF w guzach, które można szeroko podzielić na metody in vivo (ultrafiltracja kapilarna28,29,30,31 i mikrodializa32,33,34,35) oraz metody ex vivo (wirowanie tkanek22,36,37,38 i elucja z tkanek39,40,41,42). Techniki te zostały szczegółowo omówione w przeglądach literatury43,44. Wybór odpowiedniej metody powinien uwzględniać takie kwestie jak analizy i zastosowania końcowe oraz objętość odzyskanego płynu. Niedawno zastosowaliśmy to podejście jako dowód koncepcji w celu wykazania różnic w aktywności metabolicznej guzów pochodzących z dwóch mysich linii komórkowych gruczolakoraka trzustki12. Na podstawie literatury24,38 zdecydowaliśmy się na zastosowanie metody wirowania z niską prędkością, aby uniknąć rozpadu komórek i rozcieńczenia treści wewnątrzkomórkowej. Zarówno ilość glukozy, jak i mleczanu w TIF odzwierciedlały odmienne charakterystyki glikolityczne dwóch różnych linii komórkowych. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy protokoły dla dwóch najczęściej stosowanych metod izolacji TIF: wirowania tkanek oraz elucji z tkanek (Rycina 2).
<img alt="Schemat oddzielania guza; metoda wirowania; bufor elucyjny; płyn śródmiąższowy w probówkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie metod izolacji płynu śródmiąższowego z guza. Schematyczny rysunek technik opisanych szczegółowo w protokole, mianowicie wirowania tkanki (A) oraz elucji tkanki (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka Eppendorf</td><td>Greiner BioOne</td><td>GR616201</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; m nylonowe sitko komórkowe</td><td>pluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25G</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Vacutainer K2EDTA Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>366473</td><td></td></tr><tr><td>3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon probówka</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zaciski Medicon</td><td>06.20.12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy</td><td>Medicom</td><td>9000-10</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Microtech</td><td>MG10432</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze płaskie</td><td>Medicon</td><td>06.00.10</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td></td><td></td>34044100</tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Medicon</td><td>02.04.09</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA 1x</td><td>Lonza</td><td>BE17-161F</td><td></td></tr><tr><td>Ultraglutamina 100x</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Gruczolakorak trzustki (PDAC) jest czwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem, a wkrótce stanie się drugą. Istnieje pilne zapotrzebowanie na zmienne związane z określonymi patologiami trzustki, aby pomóc w przedoperacyjnej diagnostyce różnicowej i profilowaniu pacjenta. Sok trzustkowy jest stosunkowo mało zbadanym płynem ustrojowym, który ze względu na bliskie sąsiedztwo miejsca guza odzwierciedla zmiany w otaczającej tkance. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę pobrania śródoperacyjnego. Niestety, przełożenie pobierania soku z trzustki na mysie modele PDAC w celu przeprowadzenia badań mechanistycznych jest technicznie bardzo trudne. Płyn śródmiąższowy guza (TIF) to płyn zewnątrzkomórkowy, poza krwią i osoczem, który obmywa komórki guza i zrębu. Podobnie jak sok trzustkowy, ze względu na swoją właściwość zbierania i koncentrowania cząsteczek rozcieńczonych w osoczu, TIF może być wykorzystywany jako wskaźnik zmian mikrośrodowiskowych i jako cenne źródło biomarkerów związanych z chorobą. Ponieważ TIF nie jest łatwo dostępny, zaproponowano różne techniki jego izolacji. Opisujemy tutaj dwie proste i niewymagające technicznie metody jego izolacji: wirowanie tkanek i elucję tkanek.

Postępowaliśmy zgodnie z opisaną powyżej procedurą w celu pobrania soku trzustkowego od pacjentów z PDAC (n=31) oraz z innymi łagodnymi schorzeniami trzustki (non-PDAC, n=9), w tym zapaleniem trzustki (n=2), guzami brodawkowatymi wpustu dwunastnicy (n=4), guzami neuroendokrynnymi (n=2) oraz wewnątrzprzewodową brodawkowatą nowotworem śluzowym (IPMN; n=1)12. Próbki soku trzustkowego poddano następnie analizie metabolomicznej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (<sup clas...

Sok z trzustki jest cennym źródłem biomarkerów ludzkiego raka trzustki. Opisujemy tutaj metodę procedury pobrania śródoperacyjnego. Aby sprostać wyzwaniu polegającemu na zastosowaniu tej procedury w modelach mysich, sugerujemy alternatywną próbkę, płyn śródmiąższowy guza, i opisujemy tutaj dwa protokoły jego izolacji.

Izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Opisana tutaj metoda izolacji płynu proksymalnego zarówno u ludzi, jak i u myszy, może być zastosowana do badania mikrośrodowiska raka trzustki w celu identyfikacji nowych biomarkerów choroby. Korzystając z tego prostego protokołu, możliwe jest przetłumaczenie wyników klinicznych z soku trzustkowego na mysie modele PDAC w celu przeprowadzenia badań mechanistycznych. Sok trzustkowy jest w dużej mierze niezbadanym płynem ustrojowym, który okazał się obiecującym źródłem cennych biomarkerów pomagających w diagnostyce przedoperacyjnej i profilowaniu pacjentów.Ja zademonstruję pierwszą część protokołu, a Marialuisa Barbagallo, doktor habilitowany z naszego laboratorium, zademonstruje drugą część protokołu. Oszacuj lokalizację przewodu trzustkowego na podstawie pomiarów uzyskanych podczas obrazowania. Następnie wykonaj badanie dotykowe przedniej powierzchni trzustki, aby określić jej dokładną lokalizację.Przytrzymaj głowę trzustki w dwunastnicy od spodu i podnieś ją lewą ręką, zaznaczając położenie przewodu trzustkowego pierwszą cyfrą. Prawą ręką włóż trzymililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 25 do trzustki, tuż dystalnie do lewego kciuka. Zdecyduj o głębokości penetracji i stopniu nachylenia igły na podstawie pomiarów przedoperacyjnych oraz wrażenia penetracji ściany kanału.Pobrać sok za pomocą strzykawki. Jeśli nie jest możliwe pobranie soku, przenieś igłę, próbując kaniulować przewód trzustkowy. Po pobraniu soku trzustkowego przenieś go poza sterylne pole i przenieś do trzymililitrowej probówki próżniowej EDTA.Trzymaj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż próbka zostanie przeniesiona do laboratorium. Aby przetworzyć sok trzustkowy, odwiruj go w temperaturze 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć wszelkie komórki lub zanieczyszczenia. Odzyskać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszych analiz.Aby wyizolować płyn śródmiąższowy guza lub TIF, przez wirowanie przeciąć guz na pół, przepłukać dwie części w PBS i delikatnie osuszyć je na bibule filtracyjnej, poruszając się tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć parowania z guza. Natychmiast przenieś guz do 20-mikrometrowego nylonowego sitka komórkowego, przymocowanego do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Odwirować probówkę o stężeniu 400 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odzyskaj TIF z dna probówki, a następnie podwielokrotn go i natychmiast zamroź na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Aby wyizolować TIF za pomocą elucji, pokrój guz na małe kawałki nożyczkami lub skalpelem i dokładnie spłucz je zimnym PBS.Przenieś kawałki guza do 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 500 mikrolitrów PBS z koktajlem inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji analitów. Inkubuj tkankę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wykonaj serię etapów wirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie komórki z próbki.Odzyskiwanie supernatantu po każdym odwirowaniu i przenoszenie go do nowej probówki. Po ostatnim odwirowaniu natychmiast podwielokrotność próbki TIF należy podzielić na porcje i zamrozić na suchym lodzie. Przechowuj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.Protokół ten zastosowano do uzyskania soku trzustkowego od pacjentów z PDAC i innymi łagodnymi dolegliwościami trzustki. Po przefiltrowaniu szerokich sygnałów NMR makrocząsteczek widoczne były sygnały z metabolitów o małej masie cząsteczkowej. Nadzorowana analiza OPLS-DA wykazała, że profil metaboliczny w soku trzustkowym był w stanie rozróżnić pacjentów z PDAC i bez PDAC z dokładnością 82,4%Co ciekawe, analiza metabolomiczna przeprowadzona na próbkach osocza od tych samych pacjentów nie dała takiej samej mocy dyskryminującej.Aby wykazać, że zawartość płynu śródmiąższowego guza niezawodnie odzwierciedla zmiany w mikrośrodowisku guza, dwie linie komórkowe raka trzustki o przeciwstawnych wskaźnikach glikolitycznych wstrzyknięto podskórnie myszom. Po wycięciu guzów oznaczono ilościowo stężenia glukozy i mleczanu. Płyn śródmiąższowy guza z guzów o wysokim stopniu glikolityzmu zawierał mniej glukozy i więcej mleczanu w porównaniu z guzami o niskiej glikolityce.W tym badaniu przeprowadziliśmy analizę metabolomiczną. Jednak te proksymalne płyny nadają się do wielu innych zastosowań, takich jak spektrometria mas i profilowanie mikroRNA.

isolation-proximal-fluids-to-investigate-tumor-microenvironment

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Ten artykuł opisuje technikę izolowania komórek macierzystych raka trzustki (CSC) z ludzkiej tkanki gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC). Te CSC są wykorzystywane do badania funkcjonalnego wpływu leczenia farmakologicznego na zdolność CSC do samoodnawiania się in vitro w celu opracowania bardziej skutecznych metod leczenia raka.

Izolacja komórek macierzystych PDAC: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych z guzów trzustki

Komórki macierzyste raka trzustki (CSC) mogą być namnażane in vitro za pomocą techniki hodowli sferycznej niezależnej od zakotwiczenia, która stanowi potężne narzędzie do badania biologii CSC i może służyć jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na CSC. W tym miejscu przedstawiono metodologię rozszerzania, analizowania i celowania w CSC trzustki.

Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

Tutaj opisujemy metodę izolacji komórek w mikrośrodowisku trzustki z tkanek embrionalnych, noworodkowych i dorosłych myszy, koncentrując się na izolacji komórek mezenchymalnych. Metoda ta umożliwia profilowanie ekspresji genów komórkowych i wydzielania białek w celu wyjaśnienia sygnałów zewnętrznych, które regulują rozwój, funkcję i nowotworzenie trzustki.

Izolowanie i analiza komórek mezenchymy trzustki za pomocą cytometrii przepływowej

Eksperymentalna procedura immunofenotypowania mysich ortotopowych homograftów PDAC ma na celu profilowanie immuno-mikrośrodowiska guza. Guzy są wszczepiane ortotopowo za pomocą operacji. Guzy o wielkości 200–600 mm3 pobrano i zdysocjowano w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych, a następnie przeprowadzono analizę FACS pod kątem wielu markerów immunologicznych przy użyciu różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.

Immunofenotypowanie homograftu ortotopowego (syngenecznego) mysiego pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki KPC za pomocą cytometrii przepływowej

Hodowle organoidowe gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzące od pacjentów są szybko ustalonym trójwymiarowym modelem, który z dużą wiernością przedstawia przedziały komórek nowotworowych nabłonka, umożliwiając badania translacyjne nad tą śmiertelną złośliwością. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody tworzenia i rozmnażania organoidów, a także wykonywania odpowiednich testów biologicznych przy użyciu tych modeli.

Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Naucz się izolować sok trzustkowy i płyn międzykomórkowy guza w modelach ludzkich i mysich w celu identyfikacji biomarkerów raka trzustki. Ta metoda umożliwia badanie mikrośrodowiska nowotworowego i mechanizmów choroby.

Izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki

Przeglądaj więcej filmów