Izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki

Sok z trzustki jest cennym źródłem biomarkerów ludzkiego raka trzustki. Opisujemy tutaj metodę procedury pobrania śródoperacyjnego. Aby sprostać wyzwaniu polegającemu na zastosowaniu tej procedury w modelach mysich, sugerujemy alternatywną próbkę, płyn śródmiąższowy guza, i opisujemy tutaj dwa protokoły jego izolacji.

Opisana tutaj metoda izolacji płynu proksymalnego zarówno u ludzi, jak i u myszy, może być zastosowana do badania mikrośrodowiska raka trzustki w celu identyfikacji nowych biomarkerów choroby. Korzystając z tego prostego protokołu, możliwe jest przetłumaczenie wyników klinicznych z soku trzustkowego na mysie modele PDAC w celu przeprowadzenia badań mechanistycznych. Sok trzustkowy jest w dużej mierze niezbadanym płynem ustrojowym, który okazał się obiecującym źródłem cennych biomarkerów pomagających w diagnostyce przedoperacyjnej i profilowaniu pacjentów.

Ja zademonstruję pierwszą część protokołu, a Marialuisa Barbagallo, doktor habilitowany z naszego laboratorium, zademonstruje drugą część protokołu. Oszacuj lokalizację przewodu trzustkowego na podstawie pomiarów uzyskanych podczas obrazowania. Następnie wykonaj badanie dotykowe przedniej powierzchni trzustki, aby określić jej dokładną lokalizację.

Przytrzymaj głowę trzustki w dwunastnicy od spodu i podnieś ją lewą ręką, zaznaczając położenie przewodu trzustkowego pierwszą cyfrą. Prawą ręką włóż trzymililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 25 do trzustki, tuż dystalnie do lewego kciuka. Zdecyduj o głębokości penetracji i stopniu nachylenia igły na podstawie pomiarów przedoperacyjnych oraz wrażenia penetracji ściany kanału.

Pobrać sok za pomocą strzykawki. Jeśli nie jest możliwe pobranie soku, przenieś igłę, próbując kaniulować przewód trzustkowy. Po pobraniu soku trzustkowego przenieś go poza sterylne pole i przenieś do trzymililitrowej probówki próżniowej EDTA.

Trzymaj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż próbka zostanie przeniesiona do laboratorium. Aby przetworzyć sok trzustkowy, odwiruj go w temperaturze 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć wszelkie komórki lub zanieczyszczenia. Odzyskać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszych analiz.

Aby wyizolować płyn śródmiąższowy guza lub TIF, przez wirowanie przeciąć guz na pół, przepłukać dwie części w PBS i delikatnie osuszyć je na bibule filtracyjnej, poruszając się tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć parowania z guza. Natychmiast przenieś guz do 20-mikrometrowego nylonowego sitka komórkowego, przymocowanego do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Odwirować probówkę o stężeniu 400 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odzyskaj TIF z dna probówki, a następnie podwielokrotn go i natychmiast zamroź na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Aby wyizolować TIF za pomocą elucji, pokrój guz na małe kawałki nożyczkami lub skalpelem i dokładnie spłucz je zimnym PBS.

Przenieś kawałki guza do 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 500 mikrolitrów PBS z koktajlem inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji analitów. Inkubuj tkankę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i wykonaj serię etapów wirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie komórki z próbki.

Odzyskiwanie supernatantu po każdym odwirowaniu i przenoszenie go do nowej probówki. Po ostatnim odwirowaniu natychmiast podwielokrotność próbki TIF należy podzielić na porcje i zamrozić na suchym lodzie. Przechowuj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.

Protokół ten zastosowano do uzyskania soku trzustkowego od pacjentów z PDAC i innymi łagodnymi dolegliwościami trzustki. Po przefiltrowaniu szerokich sygnałów NMR makrocząsteczek widoczne były sygnały z metabolitów o małej masie cząsteczkowej. Nadzorowana analiza OPLS-DA wykazała, że profil metaboliczny w soku trzustkowym był w stanie rozróżnić pacjentów z PDAC i bez PDAC z dokładnością 82,4%Co ciekawe, analiza metabolomiczna przeprowadzona na próbkach osocza od tych samych pacjentów nie dała takiej samej mocy dyskryminującej.

Aby wykazać, że zawartość płynu śródmiąższowego guza niezawodnie odzwierciedla zmiany w mikrośrodowisku guza, dwie linie komórkowe raka trzustki o przeciwstawnych wskaźnikach glikolitycznych wstrzyknięto podskórnie myszom. Po wycięciu guzów oznaczono ilościowo stężenia glukozy i mleczanu. Płyn śródmiąższowy guza z guzów o wysokim stopniu glikolityzmu zawierał mniej glukozy i więcej mleczanu w porównaniu z guzami o niskiej glikolityce.

W tym badaniu przeprowadziliśmy analizę metabolomiczną. Jednak te proksymalne płyny nadają się do wielu innych zastosowań, takich jak spektrometria mas i profilowanie mikroRNA.