Radiografia neutronowa i tomografia komputerowa systemów biologicznych w reaktorze izotopowym wysokiego strumienia w Oak Ridge National Laboratory
7 maja 2021
Ten manuskrypt opisuje protokół radiografii neutronowej i tomografii komputerowej próbek biologicznych przy użyciu linii badawczej CG-1D High Flux Isotope Reactor (HFIR) do pomiaru metalowego implantu w kości udowej szczura, płucu myszy i systemie korzeniowo-glebowym roślin zielnych.
Radiografia składników odżywczych i tomografia komputerowa mają wyjątkową pozycję do pomiaru próbek biologicznych ze względu na wrażliwość składników odżywczych na atomy wodoru. Główną zaletą tych technik jest dostarczanie nieniszczących i nieinwazyjnych trójwymiarowych map zawartości wodoru w próbkach tkanek czy zawartości wody w korzeniach roślin i glebie. Obrazowanie składników odżywczych ma zastosowanie w wielu różnych dziedzinach badań, takich jak materiały energetyczne, materiałoznawstwo, inżynieria, rośliny, gleba, ruchy wody i tak dalej.
Technika ta nie może być stosowana w terapii lub diagnostyce instytutowej ze względu na ryzyko narażenia na promieniowanie. Można go jednak wykorzystać na przykład do określenia marginesów guza w małych, wyciętych, nienaruszonych guzach. Polecam osobie zainteresowanej tą techniką skontaktowanie się z nami i omówienie swoich pytań badawczych.
Nasze informacje są dostępne na naszej stronie internetowej neutrons.ornl.gov. Procedurę zademonstrują Yuxuan Zang, naukowiec zajmujący się rozpraszaniem neutronów, Jean Bilheux, naukowiec zajmujący się instrumentami komputerowymi oraz Erik Stringfellow, współpracownik naukowy z naszego zespołu ds. obrazowania. Aby rozpocząć, otwórz okno terminala na komputerze Beamline.
Wpisz CSS i naciśnij Enter, aby uruchomić interfejs użytkownika. Jeśli nie jest otwarty domyślnie, wybierz opcję Strona główna użytkownika na karcie Menu, aby otworzyć interfejs obrazowania APEX. W pierwszej zakładce interfejsu, Urządzenie ProposalCameraSE, wybierz optykę Beamline, klikając na przycisk Optyka znajdujący się obok Camera/Detectors.
Kliknij przycisk Szczeliny, aby ustawić rozmiar otworu otworkowego i otwór systemu szczelinowego. Przykręcić stolik obrotowy do stolików XY, na których ma być umieszczona próbka. Jeśli używasz detektora innego niż CCD, wybierz obiektyw zgodnie z żądaną rozdzielczością przestrzenną i ogniskową.
Po ustawieniu ostrości kamery ustaw ostrość obrazu w miejscu, w którym znajduje się scyntylator neutronów. Następnie umieść maskę pochłaniającą neutrony na scyntylatorze detektora, aby precyzyjnie dostroić ostrość obiektywu za pomocą neutronów. Następnie, za pomocą APEX, zautomatyzuj poruszanie silnikiem detektora i zbierz nadmiar zdjęć rentgenowskich przy użyciu różnych pozycji detektora od lustra.
Porównaj zdjęcia rentgenowskie, oceniając pary linii w oprogramowaniu do obrazowania, takim jak Fiji lub ImageJ. Następnie zabezpiecz próbkę w odpowiednim aluminiowym pojemniku lub wytrzymałej folii aluminiowej i umieść próbkę na stoliku rotacyjnym jak najbliżej detektora. Zmierz odległość od próbki do detektora i usuń próbkę.
Zastąp ją maską rozdzielczości, aby ocenić rozmiar piksela w pozycji próbki w tej konfiguracji Beamline. Korzystając ze znanego wymiaru elementu, oblicz liczbę pikseli w całym elemencie, aby określić rozmiar piksela. Ponownie umieścić próbkę na stoliku rotacyjnym.
Następnie, korzystając z zakładki Align Sample w interfejsie APEX, wyrównaj próbkę z wiązką neutronów, wykonując kolejne, szybkie zdjęcia rentgenowskie, podczas gdy próbka jest w ruchu, aż znajdzie się w pełnym polu widzenia detektora. Zapisz przykładowy plik wyrównania. Przed rozpoczęciem tomografii komputerowej kliknij kartę Wyrównaj próbkę i użyj opcji Automatyczna rotacja próbki, aby sprawdzić, czy próbka pozostaje w polu widzenia pod różnymi kątami, oceniając zdjęcia rentgenowskie generowane w różnych orientacjach próbki z wiązką.
Wybierz pierwszą zakładkę APEX o nazwie ProposalCameraSE Device. Kliknij przycisk Zmień propozycję lub Próbkę. Wybierz numer projektu i identyfikator próbki, które mają zostać zmierzone, na przykładowej liście po prawej stronie i liście propozycji po lewej stronie.
Użyj strzałki wstecz, aby wrócić do głównego interfejsu APEX. Z listy opcji Camera Detector (Detektor kamery) wybierz detektor spośród czterech dostępnych detektorów i/lub CCD i/lub sCMOS, SBIG CCD lub MCP. W sekcji Sample Environment Device (Urządzenie do przykładowego środowiska) kliknij Rotation Stage, CT Scan.
Następnie wybierz jeden z etapów rotacji, który odpowiada próbce, która ma być skanowana. U dołu karty wybierz Tryb akwizycji danych i wybierz białą wiązkę. Następnie wybierz drugą kartę APEX o nazwie Wyrównaj przykład.
Wpisz nazwę przykładowego pliku i naciśnij Enter. Powtórz te czynności dla nazwy podfolderu. Załóżmy, że próbka jest wyrównana i gotowa do tomografii komputerowej. Wybierz żądany czas akwizycji i kliknij przycisk Zrób szybkie obrazy, aby zebrać serię zdjęć rentgenowskich z różnymi czasami akwizycji.
Aby ocenić stosunek sygnału do szumu, otwórz zebrane zdjęcia rentgenowskie na ImageJ lub Fiji i narysuj profil idący od próbki do otwartego obszaru. Jeśli na stoliku XY ustawiono wiele próbek na wielu stopniach obrotu, zapisz każdą pozycję próbki po wyrównaniu i kliknij przycisk Zapisz w pliku, aby zapisać dane jako plik CSV. Następnie wybierz trzecią zakładkę APEX zatytułowaną Zbieraj dane, aby skonfigurować parametry skanowania CT.
Wpisz nazwę pliku w pierwszym wierszu zapisywalnym i naciśnij Enter. Powtórz te czynności dla nazwy podfolderu. W sekcji Align Sample Using the Saved File (Wyrównuj próbkę za pomocą zapisanego pliku) wybierz plik, w którym wcześniej zarejestrowano pozycje silnika próbki.
Kliknij Wyrównaj za pomocą pliku, aby próbka wróciła na swoje miejsce w wiązce neutronów. Aby obliczyć liczbę rzutów na podstawie twierdzenia Nyquista, najpierw oblicz liczbę pikseli w wymiarze poziomym próbki i pomnóż przez 1,5, aby uzyskać liczbę projekcji potrzebnych do spełnienia próbkowania Nyquista. Wprowadź kąt początkowy obrotu, kąt końcowy obrotu, rozmiar kroku obrotu, liczbę obrazów na krok oraz czas naświetlania każdego obrazu.
Rozpocznij tomografię komputerową, klikając przycisk Zbierz dane. Na serwerze Linux Analysis uzyskaj dostęp do Imaris 3D Notebook, klikając skrót w górnym menu, Aplikacje, a następnie Analiza-Obrazowanie i rekonstrukcja CT. Uruchom kilka pierwszych wierszy kodu, które załadują narzędzia niezbędne do uruchomienia Imaris 3D.
Załaduj dane płaskie i w ciemnym polu. Sprawdź, czy wszystkie trzy zestawy danych są prawidłowo załadowane. Przytnij dane, wybierając obszar zainteresowania na obrazie.
W razie potrzeby wykonaj filtrowanie, uruchamiając kod w sekcji filtrowania. Kontynuuj normalizację, a następnie korekcję fluktuacji wiązki. Wybierz region tła z obrazu, a następnie transmisję do tłumienia.
Następnie wykonaj automatyczną korekcję nachylenia próbki, obliczając nachylenie za pomocą kodu i stosując poprawkę nachylenia. Następnie wykonaj obliczenia usuwania uderzenia i środka obrotu. Następnie wykonaj rekonstrukcję wolumetryczną i wyświetl dane.
Zapisz dane w folderze z numerem projektu o nazwie Udostępnione. Następnie włącz oprogramowanie Amira na serwerze Facility Analysis, załaduj zrekonstruowane wycinki do oprogramowania i przystąp do wizualizacji, dalszego filtrowania i analizy. Opracowano specjalnie zaprojektowany interfejs, aby kierować tym eksperymentalnym protokołem i zminimalizować błędy ludzkie.
Interfejs logicznie przechodzi przez niezbędne kroki przed pomiarem próbki. Pokazano tutaj neutronową tomografię komputerową lub NCT kości udowej szczura z tytanowym implantem. Uzyskano NCT kości udowej na podstawie fałszywego tłumienia koloru i ukośnego przecięcia kości w celu odsłonięcia implantu.
Implant nie oddziałuje z neutronami tak bardzo, jak materiał kostny, więc jego tłumienie jest minimalne i wydaje się ciemniejszy niż otaczająca go kość. Kość beleczkowa, która znajduje się w przestrzeni szpikowej kości udowej, jest wyraźnie widoczna na bliższym końcu próbki. Zdolność neutronów do wykrywania próbek tkanek miękkich zademonstrowano na płucu myszy utrwalonym etanolem.
Zrekonstruowaną objętość płuca uzyskano z NCT. Przecięcie przez prawy płat płuca jest zilustrowane tutaj. Uzyskano również wolumetryczne odwzorowanie systemu korzeni i gleby roślin w prostokątnym aluminiowym pojemniku.
Pomimo słabego stosunku sygnału do szumu, system korzeniowy w glebie jest wyraźnie widoczny w pionowych nacięciach próbki. Bardzo ważna jest ocena rozmiaru piksela, aby zarejestrowane obrazy można było przekazać do wymiarów fizycznych. Jakość rekonstrukcji objętości 3D zależy od dobrego próbkowania zgodnie z twierdzeniem Nyquista.
Bardziej zaawansowane techniki obrazowania neutronów, takie jak interferometria stopniowania neutronów, mogą być wykonywane zgodnie z podobną procedurą. Te nowatorskie metody pozwolą odpowiedzieć na pytania, takie jak trójwymiarowy rozkład nanoporowatości w materiałach porowatych. Radiografia neutronowa i tomografia komputerowa mają szerokie znaczenie naukowe.
Techniki te mają na celu zastosowanie i zrozumienie baterii i mechanizmu ich awarii. Zaawansowane zachowanie materiałów, takich jak drukowane w 3D, archeologia, biologia i lepsza lokalizacja nowotworów.
Przegląd
Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół radiografii neutronowej i tomografii komputerowej próbek biologicznych z wykorzystaniem linii wiązki CG-1D w reaktorze HFIR (High Flux Isotope Reactor). Metoda ta ma na celu opracowanie szczegółowych trójwymiarowych map zawartości wodoru i wody w tkankach oraz systemach glebowych, w szczególności poprzez pomiar implantu metalowego w kości udowej szczura, płuca myszy oraz systemu korzeń rośliny zielnej/gleba.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Techniki obrazowania w badaniach biologicznych
- Nieniszcząca analiza próbek biologicznych
- Ocena implantów metalicznych w kontekstach biologicznych
Wstęp
- Radiografia i tomografia komputerowa z wykorzystaniem substancji kontrastowych mogą ujawnić krytyczne informacje na temat próbek wrażliwych na wodór.
- Ta technika obrazowania znajduje zastosowanie w takich obszarach jak materiały energetyczne, nauka o materiałach oraz badania środowiskowe.
- Ma ona istotne znaczenie przy określaniu parametrów takich jak marginesy nowotworowe w nienaruszonych próbkach guzów.
Zastosowane metody
- Radiografia neutronowa i tomografia komputerowa
- Próbki biologiczne obejmują kości udowe gryzoni, płuca oraz korzenie roślin
- Wykorzystanie interfejsu APEX Imaging do akwizycji i analizy danych
Główne wyniki
- Skuteczne mapowanie zawartości wodoru w tkankach biologicznych
- Generowanie obrazów trójwymiarowych w celu oceny zawartości wody w systemach roślinnych
- Postęp technologiczny wspierający precyzyjny pomiar struktur biologicznych
Wnioski
- Badanie wykazuje skuteczność technik obrazowania neutronowego w zastosowaniach biologicznych.
- Wyniki mają znaczenie dla różnych dziedzin biologii i inżynierii materiałowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Radiografia neutronowa i tomografia komputerowa umożliwiają nieniszczące, trójwymiarowe mapowanie zawartości wodoru i wody w systemach biologicznych, co pozwala na szczegółową analizę strukturalną bez zmiany stanu próbki. Możliwość ta wspiera walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez wizualizację architektury tkankowej, integracji implantów oraz dynamiki płynów w kontekstach istotnych fizjologicznie. Technika ta łączy etapy odkrywania z procesami przedklinicznymi, generując ilościowe i powtarzalne dane niezbędne do podejmowania decyzji typu go/no-go podczas identyfikacji wiodących związków oraz wyboru kandydata przedklinicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację bogatych w wodór struktur biologicznych, takich jak tkanki miękkie i szpik kostny.
- Wartość operacyjna: Wspiera wyjaśnianie mechanizmów poprzez nieinwazyjne mapowanie strumienia wody i rozkładu składników odżywczych w systemach roślina-korzeń-gleba jako modelach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w kwestii wybranego celu poprzez wykazanie interakcji na linii implant-tkanka oraz integralności strukturalnej w tkankach eksplantowanych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez dostarczenie podstawowych danych strukturalnych i kompozycyjnych.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zautomatyzowanemu pozyskiwaniu danych za pomocą interfejsu APEX Imaging oraz protokołów próbkowania opartych na kryterium Nyquista.
- Skalowalność: Podkreśla możliwość ponownego wykorzystania platformy dla różnych typów próbek, w tym kości udowych gryzoni, płuc oraz systemów roślin zielnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie istotności choroby poprzez wizualizację struktury kości beleczkowej oraz próbek tkanek miękkich w eksplantowanych modelach gryzoni.
- Zgodność przedkliniczna: Opis ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki możliwości podłużnego, nieniszczącego monitorowania zmian strukturalnych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju projektu poprzez kwantyfikację parametrów strukturalnych, takich jak pozycjonowanie implantu i gęstość tkanki, bez konieczności wykonywania sekcji histologicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od wczesnej fazy odkrywania, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – wspierając weryfikację hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz redukcję ryzyka biologicznego poprzez niedestrukcyjne fenotypowanie strukturalne.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wizualizację rozkładu wodoru w systemach biologicznych w warunkach fizjologicznych lub utrwalonych.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość i powtarzalność analizy dzięki standaryzowanemu pozycjonowaniu próbek, kalibracji detektora oraz zautomatyzowanemu gromadzeniu radiogramów za pomocą interfejsu APEX.
- Analityka: Wyróżnia wyniki ilościowe, takie jak rekonstrukcje oparte na tłumieniu, kalibracja rozmiaru piksela oraz dane wolumetryczne umożliwiające porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając ocenę strukturalną wyeksplantowanych tkanek oraz integrację implantów w badaniach nad interakcjami między urządzeniem a tkanką.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako funkcjonalność możliwą do ponownego wykorzystania w wielu projektach ze względu na jej zastosowanie w różnorodnych systemach biologicznych oraz nieniszczący charakter.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w relacjach struktura-funkcja.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność w różnych typach próbek i sesjach obrazowania.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszenie biologicznego ryzyka w późnych etapach dzięki wczesnej redukcji ryzyka strukturalnego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące rozwoju oparte na ilościowych, nieniszczących danych strukturalnych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu fizyki obrazowania neutronowego, obsługi linii wiązki oraz rekonstrukcji obliczeniowej.
- Potrzeby w zakresie instrumentacji i infrastruktury analitycznej, w tym dostęp do wysokostrumieniowego źródła neutronów, detektorów z oscylatorami oraz oprogramowania do wizualizacji 3D, takiego jak Imaris i Amira.
- Wymogi dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania próbek, protokołów wyrównania oraz potoków analizy danych.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym korekty uwzględniające gęstość próbek, ich rozmiar oraz zmienność zawartości wodoru.
- Ograniczenia praktyczne, w tym wymogi bezpieczeństwa radiologicznego wykluczające zastosowania terapeutyczne lub diagnostyczne oraz zależność od dostępności czasu wiązki w wyspecjalizowanych ośrodkach.
