Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem

Technika ta ułatwia wizualizację spotkań adduktów DNA znakowanych antygenem replikosomów i może być rozszerzona na interakcje dowolnego białka o strukturze DNA lub zmianie podatnej na immunodetekcję. Metoda ta może być stosowana do oceny częstości interakcji w obrębie pojedynczych komórek, a nie w całej populacji, i umożliwia wizualizację interakcji zależnych od cyklu komórkowego in situ bez uszkadzania komórek. Procedurę zademonstruje Ishani Majumdar, post-doc z Seidman Laboratory.

W dniu poprzedzającym eksperyment wysiewaj 1,5 razy 10 do piątej komórki w dwóch mililitrach pożywki na 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych wstępnie potraktowanych roztworem kleju komórkowego. Następnego dnia zastąp supernatant w każdym naczyniu pożywką uzupełnioną mikromolowym Dig TMP o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 50 do 70% zlewających się kultur komórkowych i umieść płytki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut, aby umożliwić zrównoważenie Dig TMP. Podczas inkubacji komórek podgrzej pudełko UV do 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec równoważenia przenieść płytki do wstępnie ogrzanego pudełka, aby wystawić komórki na działanie pięciominutowej dawki światła UVA wynoszącej trzy dżule na centymetr kwadratowy i zastąpić supernatanty dwoma mililitrami świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej przed powrotem płytkami do inkubatora do hodowli komórkowych na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji delikatnie przemyć kultury PBS i utrwalić komórki jednym mililitrem 0,1% formaldehydu w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jeden raz PBS, a następnie dwukrotnie potraktować komórki 80 mikrolitrami buforu ekstrakcyjnego cytoszkieletu uzupełnionego RNazą przez pięć minut w temperaturze pokojowej na zabieg w celu usunięcia cytoplazmy.

Po drugiej inkubacji umyj komórki trzema mililitrami PBS przed utrwaleniem komórek jednym mililitrem 4% formaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po drugim utrwaleniu przemyj komórki trzykrotnie PBS, jak pokazano, a następnie potraktuj jednym mililitrem zimnego 100% metanolu przez 20 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w dwóch mililitrach PBS, a następnie 10-minutową inkubację w 80 mikrolitrach pięciomilimolowego Tritona X-100 w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji potraktuj komórki 100 mikrolitrami pięciomilimolowego EDTA w PBS, uzupełnionymi jednym mikrolitrem 100 miligramów na mililitr RNazy A przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzy razy w PBS przed przechowywaniem ich w 5% albuminie surowicy bydlęcej i 10% surowicy osła w PBS w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wykonać test ligacji zbliżeniowej, dodaj 40 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do środka każdej płytki i inkubuj płytki w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie dwoma mililitrami PBST przed dodaniem 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu sondy PLA do każdej potrawy na jedną godzinę inkubacji w inkubatorze kultur komórkowych. Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzema 10-minutowymi płukaniami w dwóch mililitrach buforu A na przechylnej platformie w temperaturze pokojowej. Po ostatnim myciu dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki ligacyjnej do każdej płytki na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzy dwuminutowe płukanie w buforze A na uchylnej platformie.

Po ostatnim praniu dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu amplifikacyjnego do każdej płytki na 100-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Pod koniec inkubacji przemyć komórki sześć razy świeżym buforem B przez 10 minut na przemycie na platformie przechylnej. Po ostatnim płukaniu buforem B przemyj komórki jeden raz 0,01x buforem B przez jedną minutę w temperaturze pokojowej przed znakowaniem odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umyć próbki trzema 10-minutowymi płukaniami na przechylnej platformie w PBST w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem ich w pożywce montażowej uzupełnionej DAPI. w ciągu czterech dni od zamontowania należy zobrazować co najmniej 100 obserwacji na próbkę lub komórkę kondycyjną pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym, stosując te same ustawienia ekspozycji zarówno dla próbek eksperymentalnych, jak i kontrolnych. Znacznik Dig można zwizualizować za pomocą immunofluorescencji, aby ujawnić obecność międzyniciowych wiązań krzyżowych w całym jądrze.

Aby zobrazować oddziaływanie replikosomów z sieciami międzyniciowymi, PLA można zastosować do wizualizacji częstotliwości asocjacji MCM5 i znacznika Dig, godzinę po wprowadzeniu usieciowania międzyniciowego. Ponieważ stres replikacyjny aktywuje kinazę ATR, PLA między pMCM dwoma seryną 108 a znacznikiem Dig jest również dodatni. Wyniki PLA z pojedynczych jąder mogą być przedstawione w postaci trójwymiarowej rekonstrukcji, co pozwala na wizualizację powtarzalnych spotkań międzyniciowych w całym jądrze.

Analiza widełek replikacyjnych wskazuje, że spotkania międzyniciowe wykazują nieoczekiwane zjawisko ponownego uruchomienia replikacji, ponieważ białka kompleksu GINS nie wykazują sygnału PLA z wiązaniami międzyniciowymi. Natomiast test z CD 45 jest dodatni, co wskazuje, że inne białko blokujące jest zachowane. Kiedy komórki są inkubowane z inhibitorem ATR, ponowne uruchomienie jest całkowicie stłumione, a GINS Dig PLA silnie dodatnie.

Obróbka CSK+R jest niezbędna do redukcji sygnału tła. Pamiętaj, aby pokryć płytki klejem komórkowym i poprzedzić je prefiksem 0,1% FA, w przeciwnym razie komórki odkleją się od płytki.