Name: Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Odkryj metodę wizualizacji spotkań replisomów z uszkodzeniami DNA w ludzkich komórkach przy użyciu techniki PLA. Ta technika umożliwia analizę interakcji białek z uszkodzeniami DNA in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program of the NIH, National Institute on Aging, United States (Z01-AG000746–08). J.H. jest wspierany przez National Natural Science Foundations of China (21708007 i 31871365).

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Przygotować naczynia hodowlane z szklanym dnem o średnicy 35 mm, traktując je roztworem adhezyjnym dla komórek.</li>
		<li>Wysiać komórki do przygotowanych naczyń na dzień przed traktowaniem. W dniu eksperymentu komórki powinny aktywnie się dzielić i osiągać 50–70% konfluencji. 
		UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano komórki HeLa w podłożu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1x penicylinę/streptomycynę. Nie ma ograniczeń co do linii komórkowych adherentnych. Jednak komórki nieadherentne muszą zostać odwirowane na preparaty i utrwalone przed analizą metodą PLA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy digoksygeniny trimetylopsoralenu (Dig-TMP), resuspensując zamrożoną alykwotę wcześniej zsyntetyzowanego Dig-TMP w mieszaninie EtOH:H2O w stosunku 1:1. Określić stężenie, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 250 nm dla 100-krotnego rozcieńczenia (w H2O) rozpuszczonego Dig-TMP. Współczynnik ekstynkcji Dig-TMP wynosi 25 000. Weryfikować stężenie, mierząc OD przy 250 nm przed każdym użyciem i obliczyć stężenie zapasowe: Abs x 100 x 106/25 000 = stężenie (w µM). Zazwyczaj roztwór zapasowy ma stężenie około 3 mM. Roztwór można przechowywać w temperaturze –20 °C przez około miesiąc. 
		UWAGA: Dig-TMP musi zostać zsyntetyzowany chemicznie wcześniej, zgodnie z opisaną tutaj procedurą. Prowadzić cofanie 4'-chlormetylu-4,5',8-trimetylopsoralenu z 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminą w toluenie w atmosferze azotu przez 12 h. Usunąć rozpuszczalnik i odzyskać produkt 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioksatrideka)] aminometylu-4,5',8-trimetylopsoralen za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym. Połączyć produkt z estrem NHS digoksygeniny w dimetyloformamidzie i trietyloaminie w temperaturze 50 °C przez 18 h. Usunąć rozpuszczalnik i oczyścić pozostałość za pomocą preparatywnej cienkowarstwowej chromatografii na żelu krzemionkowym. Eluować prążek produktu mieszaniną chloroform:metanol: 28% wodorotlenek amonu (8:1:0,1). Odparować rozpuszczalniki i rozpuścić osad w 50% EtOH:H2O.</li>
		<li>Dodać zapas Dig-TMP w 50% EtOH:H2O do pożywki hodowli komórkowej do stężenia końcowego 5 µM. Doprowadzić pożywkę do temperatury 37 °C. Odessać pożywkę z płytek, dodać uprzednio ogrzaną pożywkę zawierającą Dig-TMP i umieścić płytki w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 min, aby umożliwić wyrównanie stężeń Dig-TMP.</li>
		<li>Podczas inkubacji komórek uprzednio ogrzać komorę UV (patrz Tabela materiałów) do 37 °C.</li>
		<li>Umieścić płytki w ogrzanej komorze UV i naświetlać komórki dawką 3 J/cm2 światłem UVA przez 5 min (dla tego eksperymentu). Podczas naświetlania płytki znajdowały się na bloku termostatycznym utrzymywanym w temperaturze 37 °C. Obliczyć czas ekspozycji według wzoru: 
		<img alt="Wzór na dawkę UV: Intensywność UV (µW/cm²) × Czas ekspozycji (sek); równanie procesu fotonicznego." src="/files/ftp_upload/61689/61689equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Odessać pożywkę za pomocą pipety, dodać świeżą, ogrzaną pożywkę i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 h.</li>
		<li>Usunąć pożywkę i delikatnie przemyć naczynia raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS).</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 0,1% formaldehydu (FA) w PBS na 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Zapobiega to odrywaniu się komórek podczas wstępnego traktowania buforem CSK-R (bufor do ekstrakcji cytoszkieletu zawierający RNazę, opisany w punkcie 1.2.9.), który jest wymagany do usunięcia elementów cytoplazmatycznych i zmniejszenia tła w metodzie PLA.</li>
		<li>Odessać FA i przemyć naczynia raz PBS.</li>
		<li>Dodać bufor CSK-R i inkubować przez 5 min w RT, aby usunąć cytoplazmę [bufor CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 300 µg/mL RNazy A]. Odessać bufor, dodać świeży CSK-R i inkubować przez 5 min w RT. 
		UWAGA: Zapas buforu CSK można przechowywać w temperaturze 4 °C, dodając Triton X i RNazę A bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Utrwalić komórki 4% formaldehydem w PBS przez 10 min w RT.</li>
		<li>Przemyć komórki PBS. Powtórzyć ten krok trzy razy.</li>
		<li>Dodać zimny 100% metanol i inkubować przez 20 min w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki trzykrotnie PBS. Na tym etapie komórki można przechowywać w PBS w komorze wilgotnej w temperaturze 4 °C do tygodnia.</li>
		<li>Inkubować komórki w 80 µL 5 mM TritonX-100 przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Inkubować komórki z 100 µL 5 mM EDTA w PBS uzupełnionym o 1 µL 100 mg/mL RNazy A przez 30 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Przechowywać komórki w buforze blokującym (5% BSA i 10% surowicy koziej w PBS) w komorze wilgotnej przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test ligacji bliskości (proximity ligation assay)
UWAGA: Przeprowadź test przybliżonej ligacji (proximity ligation assay) w dniu 3.
<ol>
	<li>Barwienie przeciwciałami
	<ol>
		<li>Przygotować 40 μL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na płytkę: dodać odpowiednią objętość przeciwciał pierwszorzędowych w celu uzyskania pożądanego rozcieńczenia (przeciwciała mysie anty-Digoksygenina oraz królicze przeciwko komponentowi replisomu, takiemu jak MCM5, CDC45, PSF1 lub pMCM2; rozcieńczenia określone w Tabeli Materiałów) do buforu blokującego (aby osiągnąć objętość końcową 24 μL). Pomieszać przez delikatne opukiwanie i pozostawić na 20 min w RT. Przygotować mieszaninę główną (master mix) dla wielu próbek i wymieszać przez opukiwanie przed naniesieniem do dołków.</li>
		<li>Dodać 40 μL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do centrum dołka i inkubować w komorze wilgotnej przez 1 h w 37 °C. Podczas barwienia pozwolić sondom PLA i buforowi blokującemu ogrzać się do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Przemyć komórki PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 w 1X PBS] w RT. Powtórzyć ten krok trzy razy.</li>
		<li>Podczas płukania przygotować 40 μL roztworu sond PLA na płytkę (sondy PLA składają się z przeciwciała wtórnego rozpoznającego IgG mysie lub królicze, kowalencyjnie powiązanego z oligonukleotydem PLUS lub MINUS): 8 μL sondy PLA anty-mysie-PLUS + 8 μL sondy PLA anty-królicze-MINUS + 24 μL buforu blokującego. Wymieszać i pozostawić na 20 min w RT. Przygotować mieszaninę główną dla wielu próbek i dobrze wymieszać przed naniesieniem do dołków. Nanieść roztwór na środek dołka w płytce.</li>
		<li>Odessać ostatni płuczący roztwór, dodać 40 μL roztworu sond PLA do centrum dołka i inkubować w komorze wilgotnej przez 1 h w 37 °C.</li>
		<li>Przemyć trzy razy w buforze A po 10 min każdy, na platformie skośnej w RT. Podczas płukania doprowadzić mieszaninę ligacyjną do temperatury RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacja i amplifikacja
	<ol>
		<li>Przygotować 40 μL mieszaniny ligacyjnej na płytkę: 8 μL (5x) zapasu ligacyjnego + 31 μL wody destylowanej + 1 μL ligazy. Przygotować mieszaninę główną dla wielu płytek i dobrze wymieszać przed naniesieniem do dołków.</li>
		<li>Dodać 40 μL roztworu ligacyjnego do każdej płytki i inkubować w komorze wilgotnej przez 30 min w 37 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki 3x buforem A, po 2 min każdy, na platformie skośnej w RT.</li>
		<li>Przygotować 40 μL roztworu amplifikacyjnego na płytkę: 8 μL (5x) zapasu amplifikacyjnego + 31,5 μL wody destylowanej + 0,5 μL polimerazy DNA. Przygotować mieszaninę główną dla wielu próbek i dobrze wymieszać przed naniesieniem do dołków.</li>
		<li>Dodać 40 μL roztworu amplifikacyjnego do każdej płytki i inkubować w komorze wilgotnej w 37 °C przez 100 min.</li>
		<li>Odessać roztwór amplifikacyjny i przemyć buforem B. Wykonać 6 płukań po 10 min każde, na platformie skośnej w RT.</li>
		<li>Przemyć raz 0,01x buforem B przez 1 min w RT.</li>
		<li>Odessać bufor B i inkubować płytki z przeciwciałami wtórnymi, Alexa Fluor 488 anty-mysie IgG oraz Alexa Fluor 568 anty-królicze IgG w roztworze blokującym przy odpowiednich rozcieńczeniach w buforze blokującym, w komorze wilgotnej, przez 30 min w 37 °C lub przez noc w 4 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki trzy razy PBS-T, po 10 min każde na platformie skośnej w RT.</li>
		<li>Odessać PBS-T i zamontować w medium montującym z DAPI. Zamontowane płytki można obrazować natychmiast lub przechowywać w 4 °C w ciemności nie dłużej niż przez 4 dni przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego (jeśli wymagane jest obrazowanie 3D, obejmij obszar co najmniej 3 µm w 15 warstwach). Przeprowadź eksperymenty w trzech powtórzeniach i wykonaj obrazy wystarczającej liczby pól, aby uzyskać co najmniej 100 obserwacji na próbkę lub warunek. Wszystkie pola i próbki, w tym kontrole, obrazuj przy użyciu tych samych ustawień ekspozycji.</li>
	<li>Kwantyfikację przeprowadź za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazów (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o darmowym i komercyjnym oprogramowaniu umożliwiającym przeprowadzenie tej analizy dla obrazów pojedynczych lub wielopłaszczyznowych).
	<ol>
		<li>Wyodrębnij jądra komórkowe na podstawie barwienia DAPI. Wykonaj detekcję kropek PLA w jądrach. Przypisz kropki PLA do odpowiadających im jąder. Eksportuj wyniki liczby kropek PLA na jądro do pliku csv (patrz Plik uzupełniający 1 oraz Plik uzupełniający 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza statystyczna (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o sugerowanym darmowym i komercyjnym oprogramowaniu).
	<ol>
		<li>Zweryfikuj, czy próbki wykazują rozkład normalny za pomocą testu Shapiro-Wilka.</li>
		<li>Ustal, czy istnieje istotna różnica między dwiema próbkami, stosując test t Studentowi (jeśli spełnione jest założenie o rozkładzie normalnym) lub test sum rang Wilcoxona (jeśli założenie o rozkładzie normalnym dla próbki nie jest spełnione).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja danych: Wygeneruj wykresy punktowe połączone z wykresami pudełkowymi, aby zwizualizować rozkład danych, medianę (Q2) oraz 25.th (Q1) i 75.th percentyl dla różnych próbek (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o sugerowanym darmowym i komercyjnym oprogramowaniu).</li>
</ol>
4. Trójwymiarowa wizualizacja oddziaływań pMCM2: ICL
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie płytek PLA za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym, używając obiektywu olejowego Plan Fluor 60x/1.25 z aperturą numeryczną. Pozyskaj 16 stosów obrazów obejmujących 1,6 mm i wygeneruj rekonstrukcję 3D przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li>
<li>Wright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+reagents+and+protocols+for+engineering+zinc+finger+nucleases+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+fidelity+of+the+repair+of+Cas9-induced+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks.</a> Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).</li>
<li>Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+DNA+double-strand+break+repair%3A+An+ever-growing+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24(2020).</li>
<li>Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+method+provides+direct+evidence+of+persistent+DNA+damage+in+senescent+cells+and+aged+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues.</a> Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).</li>
<li>Vitelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advancements+in+DNA+damage-transcription+crosstalk+and+high-resolution+mapping+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).</li>
<li>Canela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breaks+and+end+resection+measured+genome-wide+by+end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing.</a> Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).</li>
<li>Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interstrand+crosslink+repair+in+mammalian+cells%3A+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).</li>
<li>Nejad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrand+DNA+cross-links+derived+from+reaction+of+a+2-aminopurine+residue+with+an+abasic+site%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).</li>
<li>Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fanconi+anaemia+and+the+repair+of+Watson+and+Crick+DNA+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks.</a> Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).</li>
<li>Kaushal, S., Freudenreich, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fork+stalling+and+DNA+structures+in+causing+chromosome+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).</li>
<li>Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+interstrand+cross-link+repair+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).</li>
<li>Klein, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPF-ERCC1+acts+in+Unhooking+DNA+interstrand+crosslinks+in+cooperation+with+FANCD2+and+FANCP%2FSLX4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4.</a> Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).</li>
<li>Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+RAD51-dependent+DNA+interstrand+cross-link+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair.</a> Science. 333 (6038), 84-87 (2011).</li>
<li>Benedetto, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psoralens.+An+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cutis%22%5BJournal%5D)">The psoralens. An historical perspective.</a> Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>O'Donnell, M. E., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ring-shaped+hexameric+helicases+that+function+at+DNA+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).</li>
<li>Koos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+interactions+in+situ+by+proximity+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+Interstrand+Crosslink+Proximal+Replisomes+Is+Dependent+on+ATR%2C+FANCM%2C+and+FANCD2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2.</a> Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+laser+localized+psoralen+adducts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55541(2017).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+ATR%3A+ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minichromosome+maintenance+proteins+are+direct+targets+of+the+ATM+and+ATR+checkpoint+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).</li>
<li>Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+classification+of+cell+cycle+phases+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Computing+and+Computer-Assisted%22%5BJournal%5D)">Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging.</a> Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+NPAT%2C+a+novel+substrate+of+cyclin+E-CDK2%2C+promotes+S-phase+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry.</a> Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż PLA jest bardzo potężną techniką, istnieją problemy techniczne, które należy rozwiązać, aby uzyskać jasne i powtarzalne wyniki. Przeciwciała muszą mieć wysokie powinowactwo i swoistość. Ponadto ważne jest, aby w jak największym stopniu zredukować niespecyficzne sygnały tła. Odkryliśmy, że błony i szczątki komórkowe przyczyniają się do tworzenia tła i usunęliśmy je w jak największym stopniu. Mycie zawierającymi detergent przed utrwaleniem i mycie metanolem po utrwaleniu pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie. Z...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ishani Majumdar1 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Odpowiedź komórkowa na pęknięcia podwójnej nici jest dobrze udokumentowana dzięki kolejnym coraz skuteczniejszym metodom kierowania przerw do określonych miejsc genomowych1,2,3. Pewność lokalizacji umożliwia jednoznaczną charakterystykę białek i innych czynników, które gromadzą się w tym miejscu i uczestniczą w odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR), napędzając w ten sposób szlaki niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) i rekombinacji homologicznej (HR), które naprawiają pęknięcia. Oczywiście, wiele przerw jest wprowadzanych przez czynniki takie jak promieniowanie i związki chemiczne, które nie atakują określonych sekwencji4. Jednak dla nich dostępne są procedury, które mogą przekształcić końce w struktury nadające się do tagowania i lokalizacji5,6. Przerwy są również wprowadzane przez procesy biologiczne, takie jak przegrupowanie immunoglobulin, a najnowsza technologia pozwala również na ich lokalizację7. Następnie można określić związek między odpowiadającymi czynnikami a tymi miejscami.
Przerwy pojawiają się również jako pośrednia konsekwencja adduktów tworzonych przez związki, które nie są nieodłącznymi łamaczami, ale zakłócają transakcje DNA, takie jak transkrypcja i replikacja. Mogą powstać jako cecha odpowiedzi komórkowej na te przeszkody, być może podczas naprawy lub dlatego, że prowokują strukturę podatną na atak nukleazy. Zazwyczaj fizyczny związek między przywodzeniem, pęknięciem i powiązaniem z czynnikami reagującymi jest wywnioskowany. Na przykład ICL są tworzone przez chemioterapeutyki, takie jak cisplatyna i mitomycyna C8 oraz jako produkt reakcji abasic sites9. ICL są dobrze znane jako silne bloki do replikacji widełek10, tym samym blokując widełki, które mogą zostać rozszczepione przez nukleazy11. Wiązanie kowalencyjne między niciami jest często łagodzone przez szlaki, które mają obligatoryjne przerwy jako produkty pośrednie12,13, co wymaga rekombinacji homologicznej w celu odbudowania replikacji fork14. W większości eksperymentów badacz śledzi reakcję czynników będących przedmiotem zainteresowania na pęknięcia, które powstają po zderzeniu widełek replikacyjnych z ICL. Ponieważ jednak nie ma technologii pozwalającej na lokalizację zmiany prowokacyjnej, można jedynie przypuszczać bliskość replikosmu i jego części składowych do ICL.
Opracowaliśmy strategię umożliwiającą analizę powiązań białek z kowalencyjnymi adduktami niespecyficznymi dla sekwencji, zilustrowaną tutaj za pomocą ICL. W naszym systemie są one wprowadzane przez psoralen, fotoaktywny produkt naturalny stosowany od tysięcy lat jako środek terapeutyczny na choroby skóry15. Nasze podejście opiera się na dwóch ważnych cechach psoralensów. Pierwszym z nich jest wysoka częstotliwość tworzenia się usieciowania, która może przekraczać 90% adduktów, w przeciwieństwie do mniej niż 10% tworzonych przez popularne związki, takie jak cisplatyna lub mitomycyna C8,16. Drugim jest dostępność związku do koniugacji bez utraty zdolności do sieciowania. Kowalencyjnie połączyliśmy psoralen trimetylowy z digoksygeniną (Dig), od dawna uznanym znacznikiem immunologicznym. Umożliwia to wykrycie adduktów psoralenu w genomowym DNA poprzez barwienie immunologiczne znacznika Dig i wizualizację za pomocą konwencjonalnej immunofluorescencji17.
Ten odczynnik został zastosowany, w naszej poprzedniej pracy, do analizy spotkań widełek replikacyjnych z ICL za pomocą testu opartego na włóknach DNA16. W ramach tych prac odkryliśmy, że replikacja może być kontynuowana po nienaruszonym ICL. Było to zależne od kinazy ATR, która jest aktywowana przez stres replikacyjny. Ponowne uruchomienie replikacji było nieoczekiwane, biorąc pod uwagę strukturę helikazy replikacyjnej CMG. Składa się z hetero-heksameru MCM (M), który tworzy przesunięty pierścień z przerwami wokół nici matrycowej do syntezy nici wiodącej, która jest zablokowana przez białka kompleksu GINS (G, składającego się z PSF1, 2, 3 i SLD5) i CDC45 (C)18. Propozycja, że replikacja może zostać wznowiona po stronie ICL dystalnie w stosunku do strony zderzenia replikomu, przemawiała za zmianą struktury replikomu. Aby odpowiedzieć na pytanie, które składniki znajdowały się w odpowiedzi w momencie spotkania z ICL, opracowaliśmy opisane tutaj podejście. Wykorzystaliśmy znacznik Dig jako partnera w testach ligacji zbliżeniowej (PLA)19, aby zbadać ścisły związek ICL z białkami klasy replisome<sup="xref">20.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568, Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo</td><td>Invitrogen</td><td>A-10011</td><td>1 na 1000</td></tr><tr><td>Płytki 35 mm ze szkiełkiem nakrywkowym 1,5</td><td>MatTek</td><td>P35-1.5-14-C</td><td>Naczynia Microwell ze szklanym dnem 35 mm Szalka Petriego Microwell</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>A-10001</td><td>1 na 1000</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albumina (BSA)</td><td>SeraCare</td><td>1900-0012</td><td>Roztwór blokujący, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało CDC45 (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab126762</td><td>1 w 200</td></tr><tr><td>Klej komórkowy</td> Life <td>Science</td><td>354240</td><td>do roztworu cell-TAK</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikkon</td><td>Nikon TE2000 mikroskop z wirującym dyskiem</td><td>wyposażony w oprogramowanie Volocity</td></tr><tr><td>Przeciwciało digoksygeniny (Dig) (mysz)</td><td>Abcam</td><td>ab420</td><td>1 na 200</td></tr><tr><td>Dig-TMP</td><td>zsyntetyzowane w Odczynniki Seidman Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duolink Amplification (5 razy;)</td><td>Odczynniki DUO82010 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>należy przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Odczynniki do wykrywania in situ Duolink</td> Odczynniki <td>DUO92007 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>należy przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Duolink in situ oligonukleotydowa sonda PLA MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>anty-mysi MINUS, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Duolink in situ oligonukleotydowa sonda PLA PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>anty-króliczek PLUS, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Bufor do płukania in situ Duolink A</td> płuczące <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Bufor do płukania in situ Duolink B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink Wash Buffers, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; </td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td> C <td>Mikroskop Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Wyposażony w pakiety oprogramowania Axio Vision (Zeiss, Niemcy)</td></tr><tr><td>Formaldehyd 16%</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28906</td><td>do roztworu utrwalającego</td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Thermo</td><td>31873</td><td>Roztwór blokujący, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>o otwartym kodzie źródłowym</td><td>Profiler komórek</td><td>działa do analizy obrazów jednopłaszczyznowych</td></tr><tr><td>Wymagane oprogramowanie do analizy obrazu - wymagana licencja</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td>Cell Biology. Potrafi określić ilościowo kropki/jądra PLA w stosach obrazów (3D) i wykonać rekonstrukcje 3D</td></tr><tr><td>Ligaza (1 jednostka/&mu; l)</td> <td>Odczynniki DUO82029 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Odczynnik do podwiązywania (5&razy;)</td><td>Odczynniki DUO82009 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało MCM2 (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab4461</td><td>1 na 200</td></tr><tr><td>Przeciwciało MCM5 (monoklonalne królika)</td><td>Abcam</td><td>Ab75975</td><td>1 na 1000</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Lab ALLEY</td><td>A2076</td><td>wstępnie schłodzone w temperaturze -20&deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>przeciwciało fosfoMCM2S108 (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab109271</td><td>1 w 200</td></tr><tr><td>Polimeraza (10 jednostek /&mu; l)</td> <td>Odczynniki DUO82030 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>należy przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Przedłuż złote podłoże montażowe z DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PSF1 (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab181112</td><td>1 na 200</td></tr><tr><td>RNAzy A 100 mg / ml</td> Odczynniki <td>Qiagen</td><td>19101</td><td>muszą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej i wizualizacji danych</td><td>open source</td> Pakiet ggplot2 <td>R studio</td><td>do generowania wykresów punktowych i pudełkowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej i wizualizacji danych - wymagana licencja</td><td>Oprogramowanie Systat</td><td>Sigmaplot V13</td><td></td></tr><tr><td>TMP (trioksalen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137_1G</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787_250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416_100ML</td><td></td></tr><tr><td>UV box</td><td>Południowa Nowa Anglia Ultrafiolet</td><td></td><td>Wycofany. Zobacz komorę testową UV Opsytec jako możliwy zamiennik</td></tr><tr><td>Komora testowa UV</td><td>Opsytec</td><td>KOMORA TESTOWA UV BS-04</td><td></td></tr><tr><td>VE-821</td><td>Selleckchem</td><td>S8007</td><td>końcowe stężenie wynosi 1&mikro; M</td></tr></tbody></table>

wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Znaczna ilość informacji jest obecna w odpowiedzi komórkowej na pęknięcia podwójnej nici (DSB), indukowane przez nukleazy, promieniowanie i inne czynniki niszczące DNA. Częściowo odzwierciedla to dostępność metod identyfikacji miejsc przerw oraz charakterystykę czynników rekrutowanych do DSB w tych sekwencjach. Jednak DSB pojawiają się również jako półprodukty podczas przetwarzania adduktów DNA utworzonych przez związki, które nie powodują bezpośrednio pęknięć i nie reagują w określonych miejscach sekwencji. W związku z tym w przypadku większości tych leków nieznane są technologie umożliwiające analizę interakcji wiązania z czynnikami odpowiedzi i białkami naprawczymi. Na przykład wiązania krzyżowe międzyniciowe DNA (ICL) mogą powodować pęknięcia po spotkaniach z widełkami replikacyjnymi. Chociaż powstają przez leki szeroko stosowane jako chemioterapeutyki przeciwnowotworowe, nie ma metodologii monitorowania ich interakcji z białkami replikacyjnymi.
Tutaj opisujemy naszą strategię śledzenia odpowiedzi komórkowej na zderzenia widełek z tymi trudnymi adduktami. Połączyliśmy antygen steroidowy z psoralenem, który tworzy zależne od fotoaktywacji ICL w jądrach żywych komórek. ICL wizualizowano za pomocą immunofluorescencji względem znacznika antygenowego. Znacznik może być również partnerem w teście ligacji zbliżeniowej (PLA), który informuje o bliskim związku dwóch antygenów. PLA wykorzystano do odróżnienia białek, które były ściśle związane ze znakowanymi ICL od tych, które nie były. Możliwe było zdefiniowanie białek replikomów, które zostały zachowane po spotkaniach z ICL i zidentyfikowanie innych, które zostały utracone. Podejście to ma zastosowanie do każdej struktury lub adduktu DNA, które można wykryć immunologicznie.

PLA Dig-TMP z białkami replisomu 
Struktura Dig-TMP jest przedstawiona na Rysunku 1. Szczegóły syntezy, w której trimetylpsoralen został sprzężony poprzez łącznik glikolowy z digoksygeniną, były omawiane wcześniej17,21. Inkubacja komórek z tym związkiem, a następnie naświetlanie światłem o długości fali 365 nm (UVA), fotoaktywuje związek i indukuje reakcję sieciowania. Nieco ponad 90% adduktów to ICL<sup class="xr...

Podczas gdy zderzenia widełek replikacyjnych z adduktami DNA mogą powodować pęknięcia podwójnej nici, mniej wiadomo o interakcji między replikosomami a zmianami blokującymi. Zastosowaliśmy test ligacji zbliżeniowej, aby zobrazować te spotkania i scharakteryzować konsekwencje dla składu repliksome'owego.

Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

Technika ta ułatwia wizualizację spotkań adduktów DNA znakowanych antygenem replikosomów i może być rozszerzona na interakcje dowolnego białka o strukturze DNA lub zmianie podatnej na immunodetekcję. Metoda ta może być stosowana do oceny częstości interakcji w obrębie pojedynczych komórek, a nie w całej populacji, i umożliwia wizualizację interakcji zależnych od cyklu komórkowego in situ bez uszkadzania komórek. Procedurę zademonstruje Ishani Majumdar, post-doc z Seidman Laboratory.W dniu poprzedzającym eksperyment wysiewaj 1,5 razy 10 do piątej komórki w dwóch mililitrach pożywki na 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych wstępnie potraktowanych roztworem kleju komórkowego. Następnego dnia zastąp supernatant w każdym naczyniu pożywką uzupełnioną mikromolowym Dig TMP o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 50 do 70% zlewających się kultur komórkowych i umieść płytki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut, aby umożliwić zrównoważenie Dig TMP. Podczas inkubacji komórek podgrzej pudełko UV do 37 stopni Celsjusza.Pod koniec równoważenia przenieść płytki do wstępnie ogrzanego pudełka, aby wystawić komórki na działanie pięciominutowej dawki światła UVA wynoszącej trzy dżule na centymetr kwadratowy i zastąpić supernatanty dwoma mililitrami świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej przed powrotem płytkami do inkubatora do hodowli komórkowych na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji delikatnie przemyć kultury PBS i utrwalić komórki jednym mililitrem 0,1% formaldehydu w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jeden raz PBS, a następnie dwukrotnie potraktować komórki 80 mikrolitrami buforu ekstrakcyjnego cytoszkieletu uzupełnionego RNazą przez pięć minut w temperaturze pokojowej na zabieg w celu usunięcia cytoplazmy.Po drugiej inkubacji umyj komórki trzema mililitrami PBS przed utrwaleniem komórek jednym mililitrem 4% formaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po drugim utrwaleniu przemyj komórki trzykrotnie PBS, jak pokazano, a następnie potraktuj jednym mililitrem zimnego 100% metanolu przez 20 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w dwóch mililitrach PBS, a następnie 10-minutową inkubację w 80 mikrolitrach pięciomilimolowego Tritona X-100 w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji potraktuj komórki 100 mikrolitrami pięciomilimolowego EDTA w PBS, uzupełnionymi jednym mikrolitrem 100 miligramów na mililitr RNazy A przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzy razy w PBS przed przechowywaniem ich w 5% albuminie surowicy bydlęcej i 10% surowicy osła w PBS w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wykonać test ligacji zbliżeniowej, dodaj 40 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do środka każdej płytki i inkubuj płytki w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie dwoma mililitrami PBST przed dodaniem 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu sondy PLA do każdej potrawy na jedną godzinę inkubacji w inkubatorze kultur komórkowych. Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzema 10-minutowymi płukaniami w dwóch mililitrach buforu A na przechylnej platformie w temperaturze pokojowej. Po ostatnim myciu dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki ligacyjnej do każdej płytki na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzy dwuminutowe płukanie w buforze A na uchylnej platformie.Po ostatnim praniu dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu amplifikacyjnego do każdej płytki na 100-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Pod koniec inkubacji przemyć komórki sześć razy świeżym buforem B przez 10 minut na przemycie na platformie przechylnej. Po ostatnim płukaniu buforem B przemyj komórki jeden raz 0,01x buforem B przez jedną minutę w temperaturze pokojowej przed znakowaniem odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji umyć próbki trzema 10-minutowymi płukaniami na przechylnej platformie w PBST w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem ich w pożywce montażowej uzupełnionej DAPI. w ciągu czterech dni od zamontowania należy zobrazować co najmniej 100 obserwacji na próbkę lub komórkę kondycyjną pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym, stosując te same ustawienia ekspozycji zarówno dla próbek eksperymentalnych, jak i kontrolnych. Znacznik Dig można zwizualizować za pomocą immunofluorescencji, aby ujawnić obecność międzyniciowych wiązań krzyżowych w całym jądrze.Aby zobrazować oddziaływanie replikosomów z sieciami międzyniciowymi, PLA można zastosować do wizualizacji częstotliwości asocjacji MCM5 i znacznika Dig, godzinę po wprowadzeniu usieciowania międzyniciowego. Ponieważ stres replikacyjny aktywuje kinazę ATR, PLA między pMCM dwoma seryną 108 a znacznikiem Dig jest również dodatni. Wyniki PLA z pojedynczych jąder mogą być przedstawione w postaci trójwymiarowej rekonstrukcji, co pozwala na wizualizację powtarzalnych spotkań międzyniciowych w całym jądrze.Analiza widełek replikacyjnych wskazuje, że spotkania międzyniciowe wykazują nieoczekiwane zjawisko ponownego uruchomienia replikacji, ponieważ białka kompleksu GINS nie wykazują sygnału PLA z wiązaniami międzyniciowymi. Natomiast test z CD 45 jest dodatni, co wskazuje, że inne białko blokujące jest zachowane. Kiedy komórki są inkubowane z inhibitorem ATR, ponowne uruchomienie jest całkowicie stłumione, a GINS Dig PLA silnie dodatnie.Obróbka CSK+R jest niezbędna do redukcji sygnału tła. Pamiętaj, aby pokryć płytki klejem komórkowym i poprzedzić je prefiksem 0,1% FA, w przeciwnym razie komórki odkleją się od płytki.

visualization-replisome-encounters-with-an-antigen-tagged-blocking

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Odkryj metodę wizualizacji spotkań replisomów z uszkodzeniami DNA w ludzkich komórkach przy użyciu techniki PLA. Ta technika umożliwia analizę interakcji białek z uszkodzeniami DNA in situ.

Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem

Przeglądaj więcej filmów