Name: Skuteczna metoda produkcji adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół produkcji adenowirusa z wykorzystaniem systemu pAdEasy, obejmujący rekombinację plazmidów, amplifikację w komórkach AD293 oraz oczyszczanie cząstek wirusowych. Metoda umożliwia skuteczną transdukcję różnych typów komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt współfinansowany z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego poprzez Program Operacyjny na rzecz Konkurencyjności 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; akronim DIABETER), grant rumuńskiego Ministerstwa Badań i Innowacji PCCDI- UEFISCDI, Numer projektu PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 w ramach PNCD III oraz przez Akademię Rumuńską. Autorzy dziękują Kyriakosowi Kypreosowi (Uniwersytet w Patras, Grecja) za hojne i trafne rady, Ovidiu Croitoru (Uniwersytet Sztuk Pięknych, Bukareszt, Rumunia) za filmowanie, montaż i projekt graficzny oraz Mihaeli Bratu za pomoc techniczną.

<ol><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery%3A+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, Pt 11 2573-2604 (2000).</li>
<li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li>
<li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers%3A+a+scientific+review+and+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+the+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector%3A+what+parameters+are+governing+the+production+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Advances%22%5BJournal%5D)">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li>
<li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li>
<li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li>
<li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li>
<li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li>
<li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li>
<li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li>
<li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li>
<li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li>
<li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li>
<li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+%5BL261A%2C+W264A%2C+F265A%2C+L268A%2C+V269A%5D%2C+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li>
<li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li>
<li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li>
<li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li>
<li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%2C+North+America%22%5BJournal%5D)">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li>
<li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+producer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li>
<li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li>
<li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+911%3A+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li>
<li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2F+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li>
<li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium%3A+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li>
<li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton+%27pegylation%27%3A+use+of+PEG+%28polyethylene+glycol%29+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li>
<li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rekombinowane adenowirusy są wszechstronnym narzędziem do dostarczania i ekspresji genów 12,13,14. Aby wywołać silną ekspresję białka przez transdukcję adenowirusa, sekwencja kodująca genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wprowadzana do genomu adenowirusa. System adenowirusowy AdEasy, opracowany w laboratorium Vogelsteina, składa się z plazmidu szkieletowego (pAdEasy-1) zawierającego większość genomu serotypu 5 adenowirusa typu dzikiego oraz wektora wahadłowego (pAdTrack), przeznaczonego do klonowania genów 2,10. Delecja genów adenowirusowych E1 (odpowiedzialnych za składanie zakaźnych cząstek wirusa) i E3 (kodujących białka zaangażowane w unikanie odporności gospodarza) stworzyła przestrzeń w genomie adenowirusa, w którą można wprowadzić gen o wielkości 6,5-7,5 kb 2,3. Ten rozmiar jest wystarczający dla wielu genów, zwłaszcza dla tych z krótszymi intronami 15,16,17. Są również badacze donoszący o produkcji adenowirusów przenoszących cDNA transgenu 18,19,20. Uzyskaliśmy jednak niższą wydajność ekspresji transgenu dla adenowirusów przenoszących cDNA niż dla ich odpowiedników przenoszących gen lub mini-gen (dane nie pokazane).
Ulepszając i dostosowując poprzednie metody 2,10,14,18,21, technologia produkcji adenowirusów wymaga krótszego czasu, niższych kosztów i mniejszego wysiłku. Pełnowymiarowe DNA adenowirusowe uzyskuje się w wyniku rekombinacji między wektorem czółenkowym a plazmidem pAdEasy-1 w homologicznym szczepie E. coli podatnym na rekombinację, BJ5183. Protokół zakłada transformację chemiczną komórek AdEasier-1 (bakterie BJ5183 zawierające pAdEasy-1). Technika ta nie wymaga elektroporatora, który może nie być dostępny w niektórych laboratoriach, jest bardzo prosta, zwiększa wydajność rekombinacji i skraca czas niezbędny do uzyskania kompetentnych komórek i przeprowadzenia transformacji. Wstępna selekcja rekombinowanych klonów przeprowadzana metodą PCR dodatkowo skraca czas i ułatwia całą procedurę. Podobną procedurę zastosował Zhao i współpracownicy22, jednak w protokole zoptymalizowaliśmy sekwencje starterów.
Do pakowania i amplifikacji GFP-adenowirusa użyto pochodnej linii komórkowej HEK293, a mianowicie komórek AD293, które są bardziej przylegające do płytki hodowlanej. Inne linie komórkowe powszechnie stosowane do produkcji adenowirusa to: 911, 293FT, pTG6559 (pochodna A549), PER. C6 (pochodna HER), GH329 (pochodna HeLa), N52. E6 oraz HeLa-E1 23,24,25,26. W naszych rękach nie uzyskano poprawy produkcji adenowirusa po użyciu 911 komórek (dane nie pokazane). Transfekcja komórek AD293 rekombinowanym plazmidem przy użyciu odczynnika K2 znacznie zwiększyła skuteczność etapu pakowania wirusa. Po wyprodukowaniu adenowirusa do ~70% adenowirusa nadal znajduje się w komórkach i jest uwalniane w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania. Zwiększanie liczby cykli nie jest odpowiednie, ponieważ niszczy adenowirusa.
W trakcie rutynowego procesu produkcji adenowirusa w pożywce do hodowli komórkowej uwalniane są liczne cząsteczki wirusa. Odrzucenie tej pożywki do hodowli komórkowych podczas pobierania zakażonych komórek AD293 spowodowałoby istotną utratę wirusa. Zoptymalizowaliśmy protokół opisany przez Schagena i współpracowników, aby oczyścić cząstki adenowirusa z pożywki do hodowli komórkowej poprzez wytrącanie siarczanem amonu27. Metoda ta charakteryzuje się wyższą skutecznością w odzyskiwaniu adenowirusa z pożywki do hodowli komórkowej w porównaniu z metodą z użyciem glikolu polietylenowego28. Wytrącony adenowirus należy natychmiast oczyścić przez ultrawirowanie lub przechowywać w lodówce przez kilka dni, ale tylko po dializie, w celu usunięcia nadmiaru soli. Utrzymywanie osadu dłużej niż kilka godzin bez dializy jest szkodliwe dla wirusa.
Oczyszczanie cząstek adenowirusa za pomocą ultrawirowania wykonanego w jednym kroku zmniejsza manipulację bulionem adenowirusowym i ułatwia procedurę w porównaniu z protokołami wykorzystującymi kolejne etapy ultrawirowania14,29. Dializa oczyszczonego adenowirusa jest konieczna w celu usunięcia chlorku cezu, który może dalej wpływać na transdukcję. W protokole użyliśmy buforu Tris zawierającego MgCl2, ale nie sacharozę do dializy, ponieważ wymaga on ogromnej, nieuzasadnionej ilości sacharozy, która jest potrzebna w inny sposób jako środek konserwujący do zamrażania. W ten sposób dodaliśmy sacharozę później, bezpośrednio do zapasów adenowirusowych przygotowanych do zamrożenia. Aby uniknąć częstego zamrażania i rozmrażania oczyszczonego adenowirusa, zaleca się porcjowanie zapasów adenowirusa i przechowywanie ich w temperaturze -80 °C. Miano adenowirusa oceniano za pomocą cytometrii przepływowej, biorąc pod uwagę gen reporterowy GFP i procent transdukowanych komórek dla określonego rozcieńczenia wirusa. Metoda ta jest szybsza w porównaniu z klasycznym testem płytki nazębnej i jest bardziej wiarygodna w porównaniu z oceną białek kapsydu (za pomocą różnych metod, takich jak ELISA lub cytometria przepływowa), która nie ujawnia zdolności do infekcji cząstek adenowirusa. Jednak kwantyfikacja oparta na teście ELISA, Q-PCR lub test płytki nazębnej przy użyciu dostępnych na rynku zestawów są metodami alternatywnymi, szczególnie przydatnymi do miareczkowania adenowirusów, które nie zawierają znacznika fluorescencyjnego.
Biorąc pod uwagę, że adenowirusy pAdTrack pochodzą z ludzkich adenowirusów serotypu 5, który jest rozpoznawany przez wirusa Coxsackie i receptory adenowirusa (CAR), wykazaliśmy zdolność adenowirusa GFP do transdukcji komórek pochodzenia ludzkiego (komórki śródbłonka), ale także komórek innego pochodzenia: bydlęcego (komórki śródbłonka) i mysiego (mezenchymalne komórki zrębu i hepatocyty). Dane wykazały, że adenowirus GFP może indukować wysoki poziom ekspresji transgenu.
Podsumowując, zoptymalizowaliśmy tę pracochłonną technologię, aby skrócić czas, koszty i wysiłek potrzebny do uzyskania cząsteczek adenowirusa. Przygotowany adenowirus jest w stanie infekować różne typy komórek i indukować ekspresję interesującego genu. Protokół ten może być stosowany w różnych eksperymentach, ponieważ transfer genów za pośrednictwem adenowirusa stanowi jedno z głównych narzędzi do opracowywania nowoczesnych terapii genowych.
SKRÓTY: AdV-GFP, cząstki adenowirusowe; BAEC, komórki śródbłonka aorty bydlęcej; CsCl, chlorek cezu; GFP, białko zielonej fluorescencji; MSC, mezenchymalne komórki zrębowe; TU, jednostki przetwornikowe.

Adenowirusy są wirusami nieotoczkowymi zawierającymi nukleokapsyd oraz dwuniciowy liniowy genom DNA1,2,3. Adenowirusy mogą infekować szeroki zakres typów komórek, a infekcja ta nie zależy od aktywnego podziału komórek gospodarza. Po infekcji adenowirus wprowadza swoje DNA genomowe do jądra komórki gospodarza, gdzie pozostaje ono epichromosomalne i jest transkrybowane wraz z genami gospodarza. Dzięki temu uzyskuje się minimalne potencjalne ryzyko mutagenezy insercyjnej lub regulacji onkogenów4,5,6. Genom adenowirusowy nie replikuje się wraz z genomem gospodarza, przez co geny adenowirusowe ulegają rozcieńczeniu w dzielącej się populacji komórek. Do zalet transdukcji adenowirusowej należą: (i) wysoki poziom ekspresji transgenu; (ii) zmniejszone ryzyko związane z integracją wirusowego DNA z genomem gospodarza dzięki ekspresji episomalnej; (iii) możliwość transdukcji szerokiej gamy dzielących się i niedzielących się typów komórek. Większość adenowirusów stosowanych w badaniach biomedycznych jest niereplikacyjna ze względu na brak regionu E17,8,9. Do ich produkcji wymagana jest linia komórkowa dostarczająca sekwencję E1 (np. HEK293). Ponadto, w celu umożliwienia insercji transgenu do genomu wirusowego, usunięto region nieistotny dla cyklu życiowego wirusa (E3); w niektórych adenowirusach usunięto również inne regiony (E2 i E4), jednak w takich przypadkach zgłaszano obniżoną wydajność produkcji adenowirusów oraz niską ekspresję transgenu7.
W niniejszej pracy przedstawiamy ulepszony protokół konstrukcji, pakowania i oczyszczania adenowirusów przy użyciu systemu AdEasy. Ulepszenia te pozwoliły na szybsze i bardziej ekonomiczne pakowanie adenowirusów w porównaniu z oryginalną metodą opracowaną przez Bert Vogelsteina2,10, dzięki następującym zaletom: (i) rekombinacji w pAdEasy-1 zawierającym BJ5183 poprzez chemiczną transformację bakterii; (ii) selekcji klonów rekombinowanych za pomocą PCR; (iii) transfekcji komórek AD293 z wykorzystaniem systemu transfekcyjnego K2 do pakowania adenowirusów; (iv) wytrącania cząsteczek adenowirusowych z pożywki hodowlanej po pakowaniu i amplifikacji wirusa; (v) oczyszczania adenowirusów za pomocą jednokrotniej ultrawirówkowej centrifugacji w gradiencie chlorku cezu (CsCl).
Protokół produkcji adenowirusów z wykorzystaniem systemu AdEasy (Rysunek 1) obejmuje następujące etapy:
(1) Rekombinacja pAdTrack-GFP z pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183 
(2) Pakowanie cząsteczek adenowirusowych 
(3) Amplifikacja adenowirusa 
(4) Oczyszczanie cząsteczek adenowirusowych z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej 
(5) Miareczkowanie adenowirusa.
<img alt="Schemat procesu edycji genów; rekombinacja plazmidu pAdTrack-GFP, pakowanie, amplifikacja, oczyszczanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Technologia produkcji adenowirusa. Główne etapy technologii adenowirusowej obejmują: (1) Rekombinację pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183. Wyselekcjonowane plazmidy rekombinowane są amplifikowane w bakteriach DH5α, a następnie oczyszczane; (2) Pakowanie cząstek adenowirusowych w komórkach AD293, które produkują białka adeno-E1; (3) Amplifikację adenowirusa w komórkach AD293; (4) Oczyszczanie cząstek adenowirusowych z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości CsCl; (5) Miareczkowanie adenowirusa i testy funkcjonalne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W niniejszym protokole zaprezentowano technologię produkcji adenowirusa, który może indukować ekspresję GFP w komórkach gospodarza. GFP jest już wstawione w szkielet wektora wahadłowego pAdTrack-CMV (Addgene #16405), pod drugim promotorem CMV i służy jako gen reporterowy (Rysunek 1). Z tego powodu w niniejszej pracy wektor pAdTrack-CMV oznaczono jako pAdTrack-GFP i w celach demonstracyjnych oceniono ekspresję GFP. Poza ekspresją GFP system ten może być wykorzystany do nadekspresji genu zainteresowania, który można sklonować w miejscach wielokrotnego klonowania (MCS) wektora pAdTrack-CMV. Gen lub minigen sklonowany w pAdTrack-CMV jest zazwyczaj bardziej efektywny w indukcji ekspresji w porównaniu z cDNA11. Dane wykazały silną ekspresję GFP w przetransdukowanych komórkach (takich jak hepatocyty, komórki śródbłonka) pochodzących z różnych źródeł (ludzkiego, bydlęcego, mysiego). Transfer genów za pośrednictwem adenowirusów stanowi jedno z głównych narzędzi w rozwoju nowoczesnych terapii genowych.

<table><tbody><tr><td>Ogniwa AD293</td><td>Agilent Technologies</td><td>240085</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa AdEasier-1</td><td>Addgene</td><td>16399</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza I (do elektroforezy)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>BamH I</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych 100 mm</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Sigma</td><td>L4036</td><td></td></tr><tr><td>Bakterie DH5alpha</td><td>Thermo Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (GlutaMAX, 4,5g/L D-Glukoza)</td><td>Gibco</td><td>3240-027</td><td></td></tr><tr><td>EA.hy926 komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,8%)</td><td>Roth</td><td>5054.2</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Sigma</td><td></td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T25, T75, T175</td><td>Eppendorf</td><td></td> 30712129 <td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepa 1-6 mysie hepatocyty</td><td>ATCC</td><td>CRL-1830</td><td></td></tr><tr><td>Hind III</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan Kanamycyny</td><td>Thermo Scientific 15160054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji K2</td><td>Biontex</td><td>T060-5.0</td><td></td></tr><tr><td>LB średni</td><td>Formedium</td><td>LBx0102</td><td></td></tr><tr><td>LB-agar</td><td>Formedium</td><td>LBx0202</td><td></td></tr><tr><td>Mix & Go E. coli Zestaw transformacyjny</td><td>Zymo Research</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Midori Green Zaawansowane barwienie DNA</td><td>Nippon Genetics Europe</td><td>MG-04</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Pac I</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD2204</td><td></td></tr><tr><td>pAdEasy-1</td><td>Addgene</td><td>16400</td><td></td></tr><tr><td>pAdTrack-CMV</td><td>Addgene</td><td>16405</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (24:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza GoTaq</td><td>Promega</td><td>M3005</td><td></td></tr><tr><td>Pme I (Mss I)</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1344</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>VWR Chemicals</td><td>43065P</td><td></td></tr><tr><td>Pst I</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0614</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Midi Zestaw przygotowawczy</td><td>Qiagen</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>TPP</td><td>99003</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td> Kasety dializacyjne <td>Thermo Scientific</td><td>28365</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66330</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>SIGMA</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z 23G neeedle</td><td>B Braun</td><td>464BR</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50ml</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Probówki (14x89 mm)</td>Wirówka <td>do redlic Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>(chłodzona)</td><td>Sigma Sartorius</td><td>3-19KS</td><td></td></tr><tr><td>HeraeusFresco 17 Mikrowirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka z rotorem SW41Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td></td></tr><tr><td>Breed Hood Pipety</td><td>Thermo Scientific</td><td>Class II</td><td></td></tr><tr><td>(0-2&mikro; l, 1-10 i mikro; l, 2-20&mikro; l, 10-100 i mikro; l, 20-200 i mikro; l, 100-1000 i mikro; l)</td> <td>Termostat grzewczy Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr> z <tr><td>suchym blokiem</td><td>Biosan</td><td>TDB-120</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycle</td><td>SensoQuest</td><td>012-103</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda produkcji adenowirusa

An Efficient Method for Adenovirus Production

Transdukcja adenowirusowa ma tę zaletę, że powoduje silną i przejściową indukcję ekspresji interesującego genu do szerokiej gamy typów komórek i narządów. Jednak technologia rekombinowanego adenowirusa jest pracochłonna, czasochłonna i kosztowna. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół wykorzystujący system pAdEasy do uzyskiwania oczyszczonych cząstek adenowirusa, które mogą indukować silną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w transdukowanych komórkach. Zaletą tej ulepszonej metody jest szybsze przygotowanie i obniżenie kosztów produkcji w porównaniu z oryginalną metodą opracowaną przez Vogelsteina. Główne etapy technologii adenowirusowej to: (1) rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183; 2) opakowania cząstek adenowirusowych; (3) amplifikacja adenowirusa w komórkach AD293; 4) oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej; oraz (5) miareczkowanie wirusa i badania funkcjonalne adenowirusa. Ulepszenia w stosunku do oryginalnej metody polegają na: (i) rekombinacji w pAdEasy-1 zawierającym BJ5183 poprzez chemiczną transformację bakterii; (ii) selekcja rekombinowanych klonów metodą "ujemnej" i "dodatniej" reakcji PCR; (iii) transfekcja komórek AD293 przy użyciu systemu transfekcji K2 do pakowania adenowirusów; (iv) wytrącanie siarczanem amonu cząstek wirusa uwalnianych przez komórki AD293 w pożywce do hodowli komórkowych; oraz (v) oczyszczanie wirusa przez jednoetapowe ultrawirowanie w nieciągłym gradionym gradiacji chlorku cezu. Silną ekspresję interesującego genu (w tym przypadku GFP) uzyskano w różnych typach transdukowanych komórek (takich jak hepatocyty, komórki śródbłonka) z różnych źródeł (ludzkich, bydlęcych, mysich). Transfer genów za pośrednictwem adenowirusa stanowi jedno z głównych narzędzi do opracowywania nowoczesnych terapii genowych.

Zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy oryginalny protokół Vogelsteina, aby uzyskać szybszą i bardziej efektywną produkcję adenowirusów. Po pierwsze, zrewidowaliśmy metodologię w celu ułatwienia selekcji rekombinantów. Po rekombinacji klony bakteryjne BJ5183 poddano testowi „negatywnego PCR”, aby ocenić integralność pAdTrack-GFP jako wskaźnik braku rekombinacji (Rysunek 3A), lub „pozytywnego PCR”, aby zidentyfikować geny zainteresowania, którym w naszym przypadku było GFP (Rysunek 3B). W obu typach PCR („negatywnym” i „pozytywnym”) jako matrycę kontrolną wykorzystano pAdTrack-GFP, co dało prążek 986 bp dla integralności pAdTrack (Rysunek 3A, ścieżka 1) oraz prążek 264 bp dla GFP (Rysunek 3B, ścieżka 3). Startery użyte do „negatywnego PCR” zaprojektowano tak, aby amplifikowały fragment o długości 986 bp zawierający miejsce PmeI w pAdTrack-GFP. Fragment ten ulega drastycznemu powiększeniu po rekombinacji i nie jest amplifikowany w pozytywnych klonach rekombinantycznych. Klony negatywne pod kątem rekombinacji, w których pAdTrack-GFP pozostał nienaruszony, przedstawiono na Rysunku 3A, ścieżki 3, 4 i 6. Startery wiążą się z sekwencjami DNA sąsiadującymi z miejscem rekombinacji. Potencjalne pozytywne klony rekombinantyczne (Rysunek 3A, ścieżki 2 i 5) wykazywały ekspresję GFP, co pokazano na Rysunku 3B, ścieżki 1 i 2. DNA plazmidowe z tych klonów wyizolowano i wykorzystano do transformacji DH5α w celu uzyskania większej ilości DNA. Te wstępnie wyselekcjonowane plazmidy rekombinantyczne namnożone w DH5α poddano następnie analizie poprzez trawienie enzymatyczne. Na Rysunku 3C-E przedstawiono wyniki trawienia enzymatycznego jednego pozytywnego klonu rekombinantycznego za pomocą enzymów restrykcyjnych Hind III, PstI i BamHI (Rysunek 3C, D, E, ścieżka 2). Wzory trawienia HindIII i PstI klonu rekombinantycznego były podobne do wzorów uzyskanych dla pAdEasy-1, ponieważ HindIII i PstI tną plazmid pAdEasy-1 odpowiednio 24 i 25 razy (Rysunek 3C i D, ścieżka 3); natomiast HindIII przeciął raz, a PstI cztery razy wektor pAdTrack-GFP (Rysunek 3C i D, ścieżka 1). BamHI przeciął wektor pAdEasy-1 dwa razy (Rysunek 3C, ścieżka 3) oraz pAdTrack-GFP jeden raz (Rysunek 3C, ścieżka 1).
PacI wycięła fragment o wielkości 4,5 kb z plazmidu rekombinowanego (Rysunek 3F, ścieżka 2), fragment o wielkości 2863 bp z pAdTrack-GFP (Rysunek 3F, ścieżka 1) oraz zlinearyzowała wektor pAdEasy-1 (Rysunek 3F, ścieżka 3). Drabina DNA przedstawiona jest na Rysunku 3C-F, w ścieżkach 4. Plazmid rekombinowany został poddany trawieniu enzymem PacI w celu dalszego wykorzystania do transfekcji komórek AD293.
<img alt="Schematy selekcji PCR i trawienia enzymatycznego przedstawiające analizę plazmidów; żele elektroforetyczne z oznakowanymi rozmiarami prążków; użyte enzymy HindIII, PstI, BamHI, PacI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1. Plazmidy otrzymane po rekombinacji pAdTrack-GFP i pAdEasy-1 przebadano za pomocą „negatywnej” reakcji PCR pod kątem integralności pAdTrack-GFP (A). Klony nierekombinowane objawiły się obecnością prążka 986 bp odpowiadającego sekwencji namnożonej z plazmidu pAdTrack-GFP (A, ścieżki 3, 4 i 6). Uzyskano również klony potencjalnie pozytywne pod kątem rekombinacji (A, ścieżki 2 i 5). Gdy jako matrycy użyto wektora pAdTrack-GFP, otrzymano prążek 986 bp dla pAdTrack-GFP (A, ścieżka 1). Potencjalnie pozytywne klony rekombinowane przebadano pod kątem ekspresji GFP za pomocą „pozytywnej” reakcji PCR (B); prążek 264 bp pojawił się dla obu potencjalnie rekombinowanych klonów (B, ścieżki 1 i 2), a także dla plazmidu pAdTrack-GFP. DNA z jednego potencjalnego klonu rekombinowanego poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi HindIII, PstI, BamHI i PacI (C-F, ścieżki 2). W kontrolach wektor pAdEasy-1 (C-F, ścieżki 3) oraz plazmid pAdTrack-GFP (C-F, ścieżki 1) trawiono tymi samymi enzymami. Drabina DNA jest przedstawiona w C-F ścieżka 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
Pakowanie i amplifikacja adenowirusów zostały przeprowadzone w komórkach AD293. Cząsteczki adenowirusowe (AdV-GFP) oczyszczono z lizatu komórek AD293 oraz z pożywki hodowlanej, do której zostały uwolnione przez zainfekowane komórki. W celu skoncentrowania adenowirusów znajdujących się w pożywce hodowlanej, cząsteczki wytrącono siarczanem amonu, a następnie resuspendowano w 10 mM Tris HCl pH 8 z 2 mM MgCl2, w tym samym buforze, który zastosowano do lizy komórek. Następnie cząsteczki adenowirusowe z lizatu komórkowego i z pożywki hodowlanej oczyszczono metodą ultrawirowania w nieciągłym gradiencie CsCl. Po ultrawirowaniu uzyskano wyraźny prążek oczyszczonego AdV-GFP, co przedstawiono na Rysunku 4.
<img alt="Gradient wirowania lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, separacja pasm adenowirusowych, gradient gęstości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Oczyszczanie adenowirusów metodą ultrawirowania w nieciągłym gradiencie CsCl. Homogenizat komórkowy oraz adenowirusy wytrącone z pożywki poddano ultrawirowaniu w nieciągłym gradiencie utworzonym z roztworów CsCl o niskiej i wysokiej gęstości. W obu przypadkach zaobserwowano wyraźne pasma adenowirusów GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
W celu wyznaczenia miana wirusa wyrażonego w jednostkach transdukcyjnych na jeden mL (TU/mL), komórki AD293 zainfekowano seryjnymi rozcieńczeniami AdV-GFP. Po 48 godzinach zainfekowane komórki wykazywały ekspresję GFP, co było odwrotnie proporcjonalne do stopnia rozcieńczenia zawiesiny wirusowej. Obserwowano to za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a odsetek komórek GFP-dodatnich określono metodą cytometrii przepływowej (Rysunek 5). Do obliczenia miana przyjęto rozcieńczenie wirusa, które indukowało 5–20% komórek GFP-dodatnich (Rysunek 5C). Zazwyczaj otrzymujemy miano wirusa na poziomie ~1010 (TU/mL) dla adenowirusa GFP.
Poniżej przedstawiamy przykład obliczenia miana adenowirusa dla konkretnej partii adenowirusa, w której 300000 komórek (C) poddano transdukcji 1 mL roztworu adenowirusa (V), przy współczynniku rozcieńczenia 106 (D), co pozwoliło na uzyskanie 6% komórek GFP-dodatnich (F):
Miano (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1.8 x 1010 TU/mL
<img alt="Obrazy mikroskopowe serii rozcieńczeń i wykresy cytometrii przepływowej dla analizy ekspresji GFP w komórkach przetransdukowanych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ocena miana adenowirusa. Komórki AD293 zainfekowano różnymi rozcieńczeniami adenowirusa. Po czterdziestu ośmiu godzinach komórki obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizowano metodą cytometrii przepływowej, aby określić odsetek komórek dodatnich pod kątem GFP wywołany przez różne rozcieńczenia adenowirusa (A-D). W celu ustalenia bramkowania dla cytometrii przepływowej przeanalizowano również komórki nieprzetransdukowane (E). Miano obliczone dla czynnika rozcieńczenia 106, gdy 6% komórek było dodatnich pod kątem GFP, wyniosło 1.8 x 1010 TU/mL. Dla paneli A-E, paski skali: 100µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby przetestować potencjał transdukcyjny przygotowanego adenowirusa, wykorzystano cztery linie komórkowe: ludzkie komórki śródbłonka (EA.hy926), bydlęce komórki śródbłonka aorty (BAEC), mysie hepatocyty (Hepa 1-6) oraz mysie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). Komórki śródbłonka (EA.hy926 i BAEC) poddano transdukcji w dawce 25 TU/cell, hepatocyty w dawce 5 TU/cell, a MSC w dawce 250 TU/cell.
Oto przykład obliczenia objętości zawiesiny adenowirusa potrzebnej do zainfekowania 3 x 106 komórek przy dawce 25 TU/cell, przy użyciu zawiesiny adenowirusa o stężeniu 1.8 x 1010 TU/mL.
Dla 1 komórki .............. 25 TU 
3 x 106 komórek .............. x TU <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0; układ dźwigni i punktu podparcia; rozkład sił i momentów obrotowych." src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> x=75 x 106 TU 
Jeśli zapas wirusa zawiera 
1.8 x 1010 TU .............. 1 mL 
75 x 106 TU .............. y mL <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0; układ dźwigni i punktu podparcia; rozkład sił i momentów obrotowych." src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> y= 4.2 x 10-3 mL = 4.2µL zapasu wirusa
Czterdzieści osiem godzin po transdukcji komórki przeanalizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jak pokazano na Rysunku 6, ludzkie lub bydlęce komórki śródbłonka zostały poddane transdukcji z dobrą wydajnością (~50%) przy 25 TU/cell (Rysunek 6 EA.hy926 i BAEC). Hepatocyty mysie (Hepa 1-6) zostały wydajnie poddane transdukcji adenowirusem przy niskiej ilości cząsteczek adenowirusa (5 TU/cell), lecz są one również wrażliwe na adenowirusa, ponieważ odnotowano wyższy odsetek martwych komórek (komórki PI-dodatnie) (~16%) w porównaniu z innymi typami komórek. Komórki macierzyste mezenchymalne były najtrudniejsze do transdukcji (Rysunek 6), co wynikało z braku specyficznych receptorów adenowirusowych (dane niepublikowane).
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej i obrazy fluorescencyjne pokazują wydajność transdukcji AdV-GFP w różnych typach komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zakaźność adenowirusa i indukcja ekspresji GFP w komórkach poddanych transdukcji.Ludzkie komórki śródbłonka (EA.hy926), bydlęce komórki śródbłonka aorty (BAEC), mysie hepatocyty (Hepa 1-6) oraz mysie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) poddano transdukcji wskazaną ilością adenowirusa. GFP wykryto za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a odsetek komórek GFP-dodatnich przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej. Komórki PI-dodatnie, określone za pomocą cytometrii przepływowej, wskazują śmiertelność komórek spowodowaną transdukcją wirusową. Komórki EA.hy926, bydlęce komórki śródbłonka aorty oraz komórki Hepa 1-6 zostały w wysokim stopniu poddane transdukcji adenowirusem, a wydajność transdukcji wyniosła od 41% do 52%. W przypadku MSC większa ilość wirusa (250 TU/cells) spowodowała uzyskanie jedynie 27% komórek GFP-dodatnich wśród komórek poddanych transdukcji. Paski skali: 100µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Witamy w Instytucie Biologii Komórkowej i Patologii, Nicolae Simionescu z Bukaresztu, Rumunia. Tutaj, w Laboratorium Transdukcji Wirusa, pokazujemy część produkcji cząstek adenowirusa przy użyciu zoptymalizowanej metodologii opartej na systemie AdEasy opracowanym przez profesora Vogelsteina. Głównymi etapami technologii wytwarzania tych adenowirusów są, po pierwsze, rekombinacja pAdTrack zawierającego GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183.Po drugie, pakowanie cząsteczek adenowirusa. Po trzecie, amplifikacja adenowirusa w komórkach AD293. Po czwarte, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej.Po piąte, miareczkowanie wirusa i testy funkcjonalne adenowirusa. W tym miejscu przedstawimy ważny krok metodologii. Oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej.Oczyszczanie adenowirusa rozpoczyna się od pobrania komórek produkujących wirusa i pożywki. Komórki AD293 transfekowano rekombinowanym plazmidem i pakowano adenowirusa. Następnie adenowirus był amplifikowany przez kolejne większe kultury.Tutaj uzyskaliśmy 25 płytek T175 i rozpoczęliśmy oczyszczanie adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej. Najpierw sprawdziliśmy zieloną fluorescencję GFP wyrażaną przez transdukowane komórki. Jeśli komórki są nadal przymocowane, odczepimy je, dotykając naczynia hodowlanego lub używając długiego skrobaka.Komórki i pożywka są zbierane. Kolby są myte PBS, który jest również zbierany w probówkach Falcon. Komórki są granulowane przez odwirowanie.Zachowaj osad komórkowy, a także pożywkę do dalszego oczyszczania adenowirusa. Na tym etapie docenia się pomoc kolegi w celu przyspieszenia procesu zbioru. Osad komórkowy jest zielony ze względu na ekspresję GFP.Osad jest ponownie zawieszany w hipertonicznym buforze Tris, co ułatwiłoby rozerwanie komórek. Do lizy komórek używamy ciekłego azotu i suchego gazu podgrzanego do 37 stopni. Nie wykonuj więcej niż trzech cykli, ponieważ wirus może zostać uszkodzony.Aby zwiększyć skuteczność rozbijania komórek, ostrożnie przepuść homogenizację komórek przez igłę strzykawki o rozmiarze 23. Odwirować lizat komórkowy przy 9 600 x g przez 12 minut. Przepuścić supernatant w nowych probówkach i wyrzucić granulki.Przechowywać supernatant na lodzie w celu dalszego przetwarzania za pomocą ultrawirówki. Teraz przetwarzamy pożywkę hodowlaną, aby wyizolować adenowirusa uwolnionego z komórek. W tym celu najpierw ważymy niezbędną ilość siarczanu amonu i dodajemy ją do butelki, w której zebrano pożywkę hodowlaną.Butelkę energicznie wstrząsa, aż kryształy całkowicie się rozpuszczą. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dwie i pół godziny. Następnie zawiesinę osadu dzieli się na rurki Sokoła.Wirować przez 15 minut przy 1 600 x g. Po odwirowaniu supernatant jest odrzucany, a osad jest ponownie zawieszany w 10-milimolowym buforze Tris. Jeśli nie można kontynuować oczyszczania adenowirusa za pomocą etapu ultrawirowania, osad może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze czterech stopni, ale tylko po dializie w celu usunięcia siarczanu amonu.W tym miejscu przedstawiliśmy etap dializy. Za pomocą strzykawki wprowadzamy zawiesinę do wcześniej zwilżonej kasety. Próbki są dializowane w 10-milimolowym buforze Tris przez noc w temperaturze czterech stopni.Ostatni etap oczyszczania jest reprezentowany przez etap ultrawirowania na nieciągłym gradiencie chlorku cezu. Aby utworzyć gradient, najpierw pipetujemy trzy mililitry roztworu chlorku cezu o dużej gęstości. Na wierzch tej warstwy delikatnie wlej trzy mililitry chlorku cezu o niskiej gęstości.Zawiesina cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego lub pożywki hodowlanej jest następnie nakładana na gradient. Rurki są wypełnione olejem mineralnym i wprowadzone do wiader SW41. Po zrównoważeniu rurki są ładowane symetrycznie do wirnika, który jest wprowadzany do ultrawirówki.Wirówka pracuje z prędkością 35 000 obr./min i czterema stopniami przez 18 godzin bez przerwy. Po ultraodwirowaniu probówki umieszcza się na stojaku z czarnym papierem z tyłu w celu zebrania pasm. Przezroczysta górna faza i resztki komórek są wyrzucane do pojemnika na odpady z roztworem wybielającym.Najniższe prążki zawierające kompletnego adenowirusa pobiera się za pomocą końcówki pipety i umieszcza w sterylnej probówce Eppendorfa. Po dializie sacharozę dodaje się do zawiesiny wirusa do końcowego stężenia 4%, a podwielokrotność wirusa utrzymuje się w stanie zamrożonym w temperaturze minus 80 stopni. W sekcji wyników pokazaliśmy ekspresję GFP w komórkach transdukowanych uzyskanym adenowirusem.48 godzin po transdukcji GFP ulega ekspresji w transdukowanych komórkach, jak wykazano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Procent komórek wykazujących ekspresję GFP określa się za pomocą cytometrii przepływowej. Około 50% komórek śródbłonka ludzkiego i bydlęcego transdukowanych z 25 jednostkami transdukcji na komórkę jest GFP-dodatnich.Taką samą wydajność transdukcji uzyskano dla hepatocytów mysich, gdy użyto tylko pięciu jednostek transdukcji na komórkę, ale wiąże się to z wyższą śmiertelnością ze względu na wrażliwość komórki. Ekspresję zredukowaną do GFP uzyskano przez transdukcję mezenchymalnych komórek zrębu ze względu na niską ekspresję specyficznych receptorów. Uwagi końcowe.Optymalizujemy tę pracochłonną technologię, aby skrócić czas, koszty i wysiłek potrzebny do uzyskania cząstek adenowirusa. Przygotowany adenowirus jest w stanie infekować różne typy komórek i indukować ekspresję interesującego genu.

an-efficient-method-for-adenovirus-production

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Tradycyjne procedury izolacji rozpuszczalnego kolagenu typu 1 (COL1) wymagają około 10 dni od początku do końca ze względu na długie inkubacje buforowe i pracochłonne zawieszanie włókienek. Tutaj opisujemy sposób oczyszczania COL1 z małych biopsji skóry w mniej niż 3 godziny.

Ulepszona metoda przygotowania kolagenu typu I ze skóry

Przedstawiono ulepszoną metodę mechanicznego testowania zakotwiczenia kości na powierzchniach potencjalnych implantów. Metoda ta pozwala na wyrównanie siły rozrywającej dokładnie prostopadle lub równolegle do płaszczyzny powierzchni implantu i zapewnia dokładny sposób kierowania sił zakłócających na dokładny obszar wokół implantu.

Ulepszona metoda badań mechanicznych do oceny zakotwiczenia implantu kostnego

Poznaj zoptymalizowany protokół produkcji adenowirusa z wykorzystaniem systemu pAdEasy, obejmujący rekombinację plazmidów, amplifikację w komórkach AD293 oraz oczyszczanie cząstek wirusowych. Metoda umożliwia skuteczną transdukcję różnych typów komórek.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Przeglądaj więcej filmów