Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Witamy w Instytucie Biologii Komórkowej i Patologii, Nicolae Simionescu z Bukaresztu, Rumunia. Tutaj, w Laboratorium Transdukcji Wirusa, pokazujemy część produkcji cząstek adenowirusa przy użyciu zoptymalizowanej metodologii opartej na systemie AdEasy opracowanym przez profesora Vogelsteina. Głównymi etapami technologii wytwarzania tych adenowirusów są, po pierwsze, rekombinacja pAdTrack zawierającego GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183.

Po drugie, pakowanie cząsteczek adenowirusa. Po trzecie, amplifikacja adenowirusa w komórkach AD293. Po czwarte, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej.

Po piąte, miareczkowanie wirusa i testy funkcjonalne adenowirusa. W tym miejscu przedstawimy ważny krok metodologii. Oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej.

Oczyszczanie adenowirusa rozpoczyna się od pobrania komórek produkujących wirusa i pożywki. Komórki AD293 transfekowano rekombinowanym plazmidem i pakowano adenowirusa. Następnie adenowirus był amplifikowany przez kolejne większe kultury.

Tutaj uzyskaliśmy 25 płytek T175 i rozpoczęliśmy oczyszczanie adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej. Najpierw sprawdziliśmy zieloną fluorescencję GFP wyrażaną przez transdukowane komórki. Jeśli komórki są nadal przymocowane, odczepimy je, dotykając naczynia hodowlanego lub używając długiego skrobaka.

Komórki i pożywka są zbierane. Kolby są myte PBS, który jest również zbierany w probówkach Falcon. Komórki są granulowane przez odwirowanie.

Zachowaj osad komórkowy, a także pożywkę do dalszego oczyszczania adenowirusa. Na tym etapie docenia się pomoc kolegi w celu przyspieszenia procesu zbioru. Osad komórkowy jest zielony ze względu na ekspresję GFP.

Osad jest ponownie zawieszany w hipertonicznym buforze Tris, co ułatwiłoby rozerwanie komórek. Do lizy komórek używamy ciekłego azotu i suchego gazu podgrzanego do 37 stopni. Nie wykonuj więcej niż trzech cykli, ponieważ wirus może zostać uszkodzony.

Aby zwiększyć skuteczność rozbijania komórek, ostrożnie przepuść homogenizację komórek przez igłę strzykawki o rozmiarze 23. Odwirować lizat komórkowy przy 9 600 x g przez 12 minut. Przepuścić supernatant w nowych probówkach i wyrzucić granulki.

Przechowywać supernatant na lodzie w celu dalszego przetwarzania za pomocą ultrawirówki. Teraz przetwarzamy pożywkę hodowlaną, aby wyizolować adenowirusa uwolnionego z komórek. W tym celu najpierw ważymy niezbędną ilość siarczanu amonu i dodajemy ją do butelki, w której zebrano pożywkę hodowlaną.

Butelkę energicznie wstrząsa, aż kryształy całkowicie się rozpuszczą. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dwie i pół godziny. Następnie zawiesinę osadu dzieli się na rurki Sokoła.

Wirować przez 15 minut przy 1 600 x g. Po odwirowaniu supernatant jest odrzucany, a osad jest ponownie zawieszany w 10-milimolowym buforze Tris. Jeśli nie można kontynuować oczyszczania adenowirusa za pomocą etapu ultrawirowania, osad może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze czterech stopni, ale tylko po dializie w celu usunięcia siarczanu amonu.

W tym miejscu przedstawiliśmy etap dializy. Za pomocą strzykawki wprowadzamy zawiesinę do wcześniej zwilżonej kasety. Próbki są dializowane w 10-milimolowym buforze Tris przez noc w temperaturze czterech stopni.

Ostatni etap oczyszczania jest reprezentowany przez etap ultrawirowania na nieciągłym gradiencie chlorku cezu. Aby utworzyć gradient, najpierw pipetujemy trzy mililitry roztworu chlorku cezu o dużej gęstości. Na wierzch tej warstwy delikatnie wlej trzy mililitry chlorku cezu o niskiej gęstości.

Zawiesina cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego lub pożywki hodowlanej jest następnie nakładana na gradient. Rurki są wypełnione olejem mineralnym i wprowadzone do wiader SW41. Po zrównoważeniu rurki są ładowane symetrycznie do wirnika, który jest wprowadzany do ultrawirówki.

Wirówka pracuje z prędkością 35 000 obr./min i czterema stopniami przez 18 godzin bez przerwy. Po ultraodwirowaniu probówki umieszcza się na stojaku z czarnym papierem z tyłu w celu zebrania pasm. Przezroczysta górna faza i resztki komórek są wyrzucane do pojemnika na odpady z roztworem wybielającym.

Najniższe prążki zawierające kompletnego adenowirusa pobiera się za pomocą końcówki pipety i umieszcza w sterylnej probówce Eppendorfa. Po dializie sacharozę dodaje się do zawiesiny wirusa do końcowego stężenia 4%, a podwielokrotność wirusa utrzymuje się w stanie zamrożonym w temperaturze minus 80 stopni. W sekcji wyników pokazaliśmy ekspresję GFP w komórkach transdukowanych uzyskanym adenowirusem.

48 godzin po transdukcji GFP ulega ekspresji w transdukowanych komórkach, jak wykazano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Procent komórek wykazujących ekspresję GFP określa się za pomocą cytometrii przepływowej. Około 50% komórek śródbłonka ludzkiego i bydlęcego transdukowanych z 25 jednostkami transdukcji na komórkę jest GFP-dodatnich.

Taką samą wydajność transdukcji uzyskano dla hepatocytów mysich, gdy użyto tylko pięciu jednostek transdukcji na komórkę, ale wiąże się to z wyższą śmiertelnością ze względu na wrażliwość komórki. Ekspresję zredukowaną do GFP uzyskano przez transdukcję mezenchymalnych komórek zrębu ze względu na niską ekspresję specyficznych receptorów. Uwagi końcowe.

Optymalizujemy tę pracochłonną technologię, aby skrócić czas, koszty i wysiłek potrzebny do uzyskania cząstek adenowirusa. Przygotowany adenowirus jest w stanie infekować różne typy komórek i indukować ekspresję interesującego genu.