Name: Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę CRISPR/Cas9 in vivo do jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze i jamie ustnej myszy. Technika ta umożliwia badanie supresorów nowotworowych w raku głowy i szyi przy niższych kosztach niż konwencjonalne modele.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR 365252), Fundacji Krembil oraz Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan jest stypendystą Kanadyjskiego Towarzystwa Onkologicznego (BC-F-16#31919).

<ol><li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li>
<li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li>
<li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+squamous+cell+carcinoma%3A+an+epidemiological+review%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li>
<li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pathway+network%2C+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34(2006).</li>
<li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knockout+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.</a> Genome Biology. 15, 554(2014).</li>
<li>Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+and+multiplexed+in+vivo+functional+cancer+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics.</a> Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).</li>
<li>Rogers, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+in+vivo+fitness+landscape+of+lung+adenocarcinoma+tumor+suppression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice.</a> Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).</li>
<li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR%E2%80%93mediated+direct+in+vivo+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508(2018).</li>
<li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Edycja genomu CRISPR/Cas9 jest szeroko stosowana w badaniach in vitro i in vivo w celu zbadania funkcji genów i procesów komórkowych. Większość badań in vivo wykorzystuje komórki z edytowanym genem CRISPR/Cas9 przeszczepione do modelu zwierzęcego (alloprzeszczep lub ksenoprzeszczep). Chociaż jest to potężne narzędzie do badania genetyki raka i funkcji komórkowych, nadal brakuje mu natywnego mikrośrodowiska tkanek i może wywoływać zranienia i/lub reakcje immunologiczne.
Aby przezwyciężyć te wyz...

Jednym z wyzwań dla badań nad rakiem w erze postgenomicznej jest eksploracja ogromnej ilości danych genomowych pod kątem przyczynowych mutacji genowych i zidentyfikowanie węzłów w sieci genowej, które mogą być celem terapeutycznym. Chociaż analizy bioinformatyczne ogromnie pomogły w osiągnięciu tych celów, stworzenie skutecznych modeli in vitro i in vivo jest warunkiem wstępnym do rozszyfrowania złożoności systemów biologicznych i stanów chorobowych oraz umożliwienia opracowywania leków. Podczas gdy konwencjonalne transgeniczne modele myszy były szeroko stosowane w badaniach genetycznych in vivo nad rakiem, ich kosztowny, czasochłonny i pracochłonny charakter w dużej mierze uniemożliwił systematyczną analizę setek domniemanych genów nowotworowych odkrytych przez współczesną genomikę. Aby przezwyciężyć to wąskie gardło, połączyliśmy wcześniej ustaloną metodologię iniekcji in utero pod kontrolą ultradźwięków1,2 z technologią edycji genów CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)3, aby jednocześnie indukować i badać mutacje powodujące utratę funkcji setek genów w skórze i jamie ustnej jednej myszy.
Metodologia opisana tutaj wykorzystuje ultradźwiękowe iniekcje zmodyfikowanych lentiwirusów do jamy owodniowej żywych embrionów myszy w dniu embrionalnym E9.5. Ładunek lentiwirusowy zawierający składniki CRISPR/Cas9 przekształca jednowarstwową ektodermę powierzchniową, która następnie powoduje powstanie nabłonka skóry i jamy ustnej. Skóra składa się z zewnętrznego naskórka, po którym następuje błona podstawna i skóra właściwa. Naskórek to nabłonek warstwowy złożony z wewnętrznej, podstawowej warstwy, która utrzymuje kontakt z błoną podstawną i ma zdolność proliferacyjną i komórkową macierzystą. Warstwa podstawowa daje początek zróżnicowanym warstwom powyżej, takim jak warstwy kolczyste, ziarniste i warstwa rogowa naskórka2,4. Badania nad śledzeniem linii pokazują, że ta bezpośrednia metoda CRISPR/Cas9 in vivo genetycznie manipuluje komórkami macierzystymi rezydującymi w tkance w warstwie podstawnej, które utrzymują się przez całe dorosłe życie. Ponieważ lentiwirus może być miareczkowany w celu transdukcji ektodermy powierzchniowej E9.5 przy gęstości klonalnej, metoda ta może być stosowana do generowania myszy mozaikowych zawierających tysiące dyskretnych klonów z nokautem genów. Sekwencjonowanie nowej generacji może być następnie wykorzystane do analizy wpływu ablacji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w tych klonach w sposób multipleksowany5.
Ostatnio użyliśmy tej metody do oceny funkcji 484 genów, które wykazują powtarzające się mutacje w ludzkim raku płaskonabłonkowym głowy i szyi (HNSCC)5. HNSCC jest wyniszczającym nowotworem o wysokiej śmiertelności wynoszącej 40–50% i jestszóstym najczęściej występującym nowotworem na świecie6. HNSCC powstają w błonie śluzowej górnych dróg oddechowych lub jamy ustnej i są związane ze spożywaniem tytoniu i alkoholu lub zakażeniem wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV). Rak płaskonabłonkowy skóry (SCC) jest nowotworem skóry i stanowi drugi najczęstszy nowotwór u ludzi7. Skórne SCC i HNSCC są histologicznie i molekularnie bardzo podobne, z wysokim odsetkiem przypadków wykazujących zmiany w TP53, PIK3CA, NOTCH1 i HRAS8. Podczas gdy istnieje tylko garstka genów zmutowanych z dużą częstotliwością, istnieją setki genów, które są zmutowane z niską częstotliwością (< 5%), co jest zjawiskiem powszechnie określanym jako dystrybucja długiego ogona. Ponieważ większość genów z długiego ogona nie ma walidacji biologicznej lub klinicznej, wykorzystaliśmy tę technologię badań przesiewowych CRISPR in vivo do modelowania utraty funkcji tych genów u myszy podatnych na nowotwory z mutacjami uczulającymi w p53, Pik3ca lub Hras i zidentyfikowaliśmy kilka nowych genów supresorowych guza, które współpracują z p53, Pik3ca lub Hras, aby wywołać rozwój nowotworu5.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania multipleksowanych bibliotek lentiwirusowych CRISPR sgRNA i przeprowadzania badań przesiewowych nokautujących genów CRISPR/Cas9 w ektodermie na powierzchni myszy. Warto zauważyć, że metodologia ta może zostać zaadaptowana w celu włączenia innych technologii manipulacji genami, takich jak aktywacja CRISPR (CRISPRa) i inaktywacja CRISPR (CRISPRi), lub zmodyfikowana w celu ukierunkowania na inne układy narządów u myszy w celu zbadania funkcji genów.

<table><tbody><tr><td>Filtr 0,45 mikrona</td><td>Sigma</td><td>S2HVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>12k lub 92k oligo chip</td><td>Customarray Inc. (Genscript)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych 15 cm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>293NT</td><td>Systems Biosciences</td><td>LV900A-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>Amplicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Chromowy szew jelitowy</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Głębokie sekwencjonowanie (Next-Seq lub Hi-Seq)</td><td>Zestaw</td> do oczyszczania DNA Illumina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zymo Research</td><td>D4008</td><td></td></tr><tr><td>DNAesy Zestaw do ekstrakcji DNA krwi i tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Elektrokompetentne komórki Endura</td><td>Lucigen</td><td>60242-1</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynia włosowate</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>MLS-50</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Bisent Technologies</td><td>800-011-LG</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw plazmidów do mini-przygotowania</td><td>Frogga Bio</td><td>PDH300</td><td></td></tr><tr><td>System znieczulenia tlenowego dla myszy Visual</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II mikromanipulator</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 ( Bufor do BsmBI)</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Ostrzałka do igieł</td><td>Sutter Instrument</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia oligo</td><td>Zymo research</td><td>D4060</td><td></td></tr><tr><td>PAGE oczyszczony podkład do sekwencjonowania illumina</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEI (polietylenoimina)</td><td>Sigma</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Modelina</td><td></td><td></td> <td>permoplastowa</td></tr><tr><td>Petridish z centralnym otworem</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza 2x Master mix NEB</td><td></td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometryczna kwantyfikacja</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>Półokrągła wtyczka silikonowa</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana silikonowa</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>System ultradźwiękowy Vevo2000</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe in vivo crispr/cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) odegrały kluczową rolę w ocenie funkcji genów, modelowaniu chorób ludzkich i służyły jako model przedkliniczny do oceny ścieżek terapeutycznych. Jednak ich czasochłonność, pracochłonność i koszty ogranicza ich przydatność do systematycznej analizy funkcji genów. Najnowsze postępy w technologiach edycji genomu przezwyciężają te ograniczenia i pozwalają na szybkie generowanie specyficznych zaburzeń genów bezpośrednio w określonych narządach myszy w sposób multipleksowany i szybki. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w celu wygenerowania tysięcy klonów nokautujących geny w nabłonku skóry i jamy ustnej myszy oraz przedstawiamy protokół szczegółowo opisujący kroki niezbędne do przeprowadzenia bezpośredniego badania przesiewowego CRISPR in vivo pod kątem genów supresorowych nowotworu. Podejście to można zastosować do innych narządów lub innych technologii CRISPR/Cas9, takich jak aktywacja CRISPR lub inaktywacja CRISPR, w celu zbadania biologicznej funkcji genów podczas homeostazy tkanek lub w różnych warunkach chorobowych.

Rysunek 1A przedstawia projekt oligonukleotydów służących do kosztowo efektywnego multipleksowania kilku niestandardowych bibliotek CRISPR na pojedynczym chipie oligo 12k lub 92k. Po wybraniu sgRNA (oznaczonych kolorem niebieskim), oligonukleotydy projektuje się z miejsc restrykcyjnymi (BsmBI zaznaczone na pomarańczowo) oraz specyficznymi dla biblioteki parami starterów PCR (oznaczonymi kolorem zielonym). Można zaprojektować kilka bibliotek, stosując unikalne kombinacje par starterów do mult...

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala naukowcom jednocześnie badać funkcje supresyjne setek genów w raku głowy i szyi za ułamek kosztów konwencjonalnego modelu myszy z nokautem. Technika ta jest elastyczna i może być dostosowana do pokrycia ekspresji genów w celu zbadania ich funkcji w skórze. Ukierunkowany protokół biblioteki CRISPR może być również stosowany w przypadku innych typów raka.Umieść znieczulone zwierzę brzuszną stroną do góry na podgrzewanym etapie operacji i użyj taśmy chirurgicznej, aby przytrzymać łapy na miejscu. Zastosuj rurkę znieczulającą nosa, aby zapewnić stały dopływ izofluranu i tlenu aż do zakończenia operacji. Aby potwierdzić ciążę E9.5, nałóż niewielką ilość kremu do depilacji na brzuch i rozprowadź go na powierzchni o wymiarach trzy na trzy centymetry kwadratowe za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.Po dwóch do trzech minutach delikatnie usuń krem gazą lub chusteczką i wytrzyj obszar do czysta za pomocą PBS i 70% etanolu. Za pomocą sondy ultradźwiękowej i żelu sprawdź, czy ciężarna mysz ma dzień embrionalny E9.5. Można to również zrobić dzień wcześniej w E8.5, aby zaoszczędzić czas w dniu zabiegu.Usuń żel ultradźwiękowy i wytrzyj obszar do czysta za pomocą BPS, a następnie 70% etanolu. Wstrzykuj najwięcej podskórnych leków przeciwbólowych. Następnie sterylujesz kleszcze i nożyczki, aby wykonać pionowe nacięcie w skórze.Użyj kleszczy, aby oddzielić skórę wokół nacięcia od otrzewnej. Następnie sterylne kleszcze i nożyczki, aby przeciąć otrzewną. Za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij lewy i prawy róg macicy i policz zarodki.Włóż ponownie większość rogów macicy, ale pozostaw odsłonięty dystalny koniec jednego rogu macicy zawierającego trzy zarodki. Za pomocą kleszczy delikatnie popchnij i przeciągnij macicę z trzema zarodkami przez otwór w silikonowej błonie zmodyfikowanej szalki Petriego. Ustabilizuj szalkę Petriego za pomocą kostek plasteliny.Ustabilizuj macicę z trzema zarodkami wewnątrz szalki Petriego za pomocą silikonowej formy. Następnie spłaszcz silikonową zatyczkę z boku zarodków za pomocą narzędzia. Napełnij szalkę Petriego sterylnym PBS i przepłucz silikonową membranę na dnie szalki Petriego z brzuchem ciężarnej matki, zapobiegając w ten sposób wyciekom.Przenieś głowicę ultrasonograficzną na szalkę Petriego, około 0,5 centymetra powyżej górnego zarodka i wyreguluj stopień tak, aby jama owodniowa stała się wyraźnie widoczna w widoku ultrasonograficznym. Ostrożnie wyrównać igłę wtryskiwacza ze zmodyfikowaną szalką Petriego. Za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę igły w odległości pięciu milimetrów od górnego zarodka, a następnie przełączaj igłę w przód iw tył, aby przesunąć się do płaszczyzny, w której jej końcówka wydaje się najjaśniejsza na obrazie ultrasonograficznym.Za pomocą mikromanipulatora wepchnij igłę przez ścianę macicy do jamy owodniowej. Wstrzyknij 62 nanolitry lentiwirusa za pomocą biblioteki sgRNA z małą prędkością wstrzykiwania. Naciśnij przycisk Wstrzyknij osiem razy, co daje w sumie 496 nanolitrów na zarodek.Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych dwóch zarodków. Następnie podnieś głowicę ultradźwiękową i wyjmij silikonową zatyczkę. Delikatnie wepchnął pierwsze dwa z trzech zarodków do brzucha myszy za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.Wyciągnij kolejne trzy zarodki i wepchnij wcześniej wstrzyknięty trzeci zarodek. Powtarzaj procedurę wstrzykiwania, aż do wstrzyknięcia pożądanej liczby zarodków, upewniając się, że nie przekraczasz 30 minut znieczulenia. Po zakończeniu podnieś głowicę ultradźwiękową, wyjmij mikromanipulator z igłą, zassaj PBS i wyjmij szalkę Petriego.Za pomocą sterylnych chusteczek wchłonąć wszelkie PBS, które mogły nagromadzić się w jamie brzusznej. Zamknij nacięcie otrzewnej za pomocą szwów wchłanialnych. Następnie użyj dwóch zszywek, aby zamknąć nacięcie w skórze brzucha.Następnie, odczyty sekwencjonowania generacji amplifikowanego DNA PCR z komórek transdukowanych w bibliotece plazmidowej i lentiwirusowej powinny wykazać wysoką korelację. Jeśli odczyty sgRNA z plazmidowego DNA nie wykazują równej reprezentacji sgRNA, wówczas procedurę przygotowania i zagęszczenia wirusa należy powtórzyć ostrożnie. Wyniki wstrzyknięcia lentiwirusa pod kontrolą ultradźwięków przenoszącego rekombinazę Cre u młodych myszy konfetti E9.5 Lox-STOP-Lox w dniu poporodowym P0 przedstawiono tutaj.Podczas gdy wysokie miano wirusa skutkowałoby większym pokryciem skóry myszy, skutkowałoby to również transdukcją wielu sgRNA do tej samej komórki. Ten wykres pokazuje odczyty sekwencjonowania nowej generacji DNA amplifikowanego PCR, z komórek transdukowanych w bibliotece plazmidowej i lentiwirusowej, a także odczyty z czterech reprezentatywnych guzów. Przewodniki sgRNA ukierunkowane na supresory nowotworów ADAM10 i RIPK4 są wzbogacone w próbki guza w porównaniu z pulą plazmidów lub zakażonymi komórkami.Wykonanie operacji w E9.5 ma kluczowe znaczenie. Pamiętaj, aby sprawdzić ciążę za pomocą USG, dziewięć dni po założeniu krzyżówki i zidentyfikować punkt czasowy embrionalny u każdej samicy myszy. Po urodzeniu szczeniąt transdukowane komórki można wyizolować i szeroko profilować przy użyciu najnowszych technik profilowania genów, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.

in-vivo-crisprcas9-screening-to-simultaneously-evaluate-gene-function

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj metodę CRISPR/Cas9 in vivo do jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze i jamie ustnej myszy. Technika ta umożliwia badanie supresorów nowotworowych w raku głowy i szyi przy niższych kosztach niż konwencjonalne modele.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Przeglądaj więcej filmów