Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy
2 listopada 2020
Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.
Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala naukowcom jednocześnie badać funkcje supresyjne setek genów w raku głowy i szyi za ułamek kosztów konwencjonalnego modelu myszy z nokautem. Technika ta jest elastyczna i może być dostosowana do pokrycia ekspresji genów w celu zbadania ich funkcji w skórze. Ukierunkowany protokół biblioteki CRISPR może być również stosowany w przypadku innych typów raka.
Umieść znieczulone zwierzę brzuszną stroną do góry na podgrzewanym etapie operacji i użyj taśmy chirurgicznej, aby przytrzymać łapy na miejscu. Zastosuj rurkę znieczulającą nosa, aby zapewnić stały dopływ izofluranu i tlenu aż do zakończenia operacji. Aby potwierdzić ciążę E9.5, nałóż niewielką ilość kremu do depilacji na brzuch i rozprowadź go na powierzchni o wymiarach trzy na trzy centymetry kwadratowe za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
Po dwóch do trzech minutach delikatnie usuń krem gazą lub chusteczką i wytrzyj obszar do czysta za pomocą PBS i 70% etanolu. Za pomocą sondy ultradźwiękowej i żelu sprawdź, czy ciężarna mysz ma dzień embrionalny E9.5. Można to również zrobić dzień wcześniej w E8.5, aby zaoszczędzić czas w dniu zabiegu.
Usuń żel ultradźwiękowy i wytrzyj obszar do czysta za pomocą BPS, a następnie 70% etanolu. Wstrzykuj najwięcej podskórnych leków przeciwbólowych. Następnie sterylujesz kleszcze i nożyczki, aby wykonać pionowe nacięcie w skórze.
Użyj kleszczy, aby oddzielić skórę wokół nacięcia od otrzewnej. Następnie sterylne kleszcze i nożyczki, aby przeciąć otrzewną. Za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij lewy i prawy róg macicy i policz zarodki.
Włóż ponownie większość rogów macicy, ale pozostaw odsłonięty dystalny koniec jednego rogu macicy zawierającego trzy zarodki. Za pomocą kleszczy delikatnie popchnij i przeciągnij macicę z trzema zarodkami przez otwór w silikonowej błonie zmodyfikowanej szalki Petriego. Ustabilizuj szalkę Petriego za pomocą kostek plasteliny.
Ustabilizuj macicę z trzema zarodkami wewnątrz szalki Petriego za pomocą silikonowej formy. Następnie spłaszcz silikonową zatyczkę z boku zarodków za pomocą narzędzia. Napełnij szalkę Petriego sterylnym PBS i przepłucz silikonową membranę na dnie szalki Petriego z brzuchem ciężarnej matki, zapobiegając w ten sposób wyciekom.
Przenieś głowicę ultrasonograficzną na szalkę Petriego, około 0,5 centymetra powyżej górnego zarodka i wyreguluj stopień tak, aby jama owodniowa stała się wyraźnie widoczna w widoku ultrasonograficznym. Ostrożnie wyrównać igłę wtryskiwacza ze zmodyfikowaną szalką Petriego. Za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę igły w odległości pięciu milimetrów od górnego zarodka, a następnie przełączaj igłę w przód iw tył, aby przesunąć się do płaszczyzny, w której jej końcówka wydaje się najjaśniejsza na obrazie ultrasonograficznym.
Za pomocą mikromanipulatora wepchnij igłę przez ścianę macicy do jamy owodniowej. Wstrzyknij 62 nanolitry lentiwirusa za pomocą biblioteki sgRNA z małą prędkością wstrzykiwania. Naciśnij przycisk Wstrzyknij osiem razy, co daje w sumie 496 nanolitrów na zarodek.
Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych dwóch zarodków. Następnie podnieś głowicę ultradźwiękową i wyjmij silikonową zatyczkę. Delikatnie wepchnął pierwsze dwa z trzech zarodków do brzucha myszy za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.
Wyciągnij kolejne trzy zarodki i wepchnij wcześniej wstrzyknięty trzeci zarodek. Powtarzaj procedurę wstrzykiwania, aż do wstrzyknięcia pożądanej liczby zarodków, upewniając się, że nie przekraczasz 30 minut znieczulenia. Po zakończeniu podnieś głowicę ultradźwiękową, wyjmij mikromanipulator z igłą, zassaj PBS i wyjmij szalkę Petriego.
Za pomocą sterylnych chusteczek wchłonąć wszelkie PBS, które mogły nagromadzić się w jamie brzusznej. Zamknij nacięcie otrzewnej za pomocą szwów wchłanialnych. Następnie użyj dwóch zszywek, aby zamknąć nacięcie w skórze brzucha.
Następnie, odczyty sekwencjonowania generacji amplifikowanego DNA PCR z komórek transdukowanych w bibliotece plazmidowej i lentiwirusowej powinny wykazać wysoką korelację. Jeśli odczyty sgRNA z plazmidowego DNA nie wykazują równej reprezentacji sgRNA, wówczas procedurę przygotowania i zagęszczenia wirusa należy powtórzyć ostrożnie. Wyniki wstrzyknięcia lentiwirusa pod kontrolą ultradźwięków przenoszącego rekombinazę Cre u młodych myszy konfetti E9.5 Lox-STOP-Lox w dniu poporodowym P0 przedstawiono tutaj.
Podczas gdy wysokie miano wirusa skutkowałoby większym pokryciem skóry myszy, skutkowałoby to również transdukcją wielu sgRNA do tej samej komórki. Ten wykres pokazuje odczyty sekwencjonowania nowej generacji DNA amplifikowanego PCR, z komórek transdukowanych w bibliotece plazmidowej i lentiwirusowej, a także odczyty z czterech reprezentatywnych guzów. Przewodniki sgRNA ukierunkowane na supresory nowotworów ADAM10 i RIPK4 są wzbogacone w próbki guza w porównaniu z pulą plazmidów lub zakażonymi komórkami.
Wykonanie operacji w E9.5 ma kluczowe znaczenie. Pamiętaj, aby sprawdzić ciążę za pomocą USG, dziewięć dni po założeniu krzyżówki i zidentyfikować punkt czasowy embrionalny u każdej samicy myszy. Po urodzeniu szczeniąt transdukowane komórki można wyizolować i szeroko profilować przy użyciu najnowszych technik profilowania genów, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje szybki i bezpośredni in vivo metodę przesiewowego CRISPR/Cas9 za pomocą wskazywanych ultradźwiękami in utero iniekcji lentiwirusa do zarodków. Umożliwia badaczom ocenę funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej immunokompetentnych myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Badania nad rakiem
Tło
- Technika umożliwia badanie funkcji supresyjnych dla nowotworów setek genów.
- Jest efektywna kosztowo w porównaniu do konwencjonalnych modeli myszy knockout.
- Metoda może być przystosowana do badania ekspresji genów w skórze.
- Może być zastosowana do różnych rodzajów raka.
Cel badania
- Rozwój metodologii do jednoczesnej oceny funkcji genów.
- Poprawa zrozumienia ról genów w raku głowy i szyi.
- Dostarczenie elastycznego narzędzia do badań nad rakiem.
Stosowane metody
- Wskazywany ultradźwiękami in utero iniekcje lentiwirusa do zarodków.
- Zastosowanie izofluranu i tlenu do znieczulenia.
- Potwierdzenie ciąży poprzez zastosowanie kremu do depilacji.
- Użycie skoncentrowanego protokołu biblioteki CRISPR.
Główne wyniki
- Udana ocena funkcji genów in vivo.
- Wykazana efektywność kosztowa metody.
- Potwierdzona adaptacyjność do różnych rodzajów raka.
- Możliwość szerszych zastosowań w badaniach funkcji genów.
Wnioski
- Protokół oferuje szybkie i efektywne podejście do analizy funkcji genów.
- Otwierają nowe szanse dla badań nad rakiem i genami.
- Przyszłe zastosowania mogą wykraczać poza rak głowy i szyi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
In vivo CRISPR/Cas9 screening enables rapid, multiplexed functional interrogation of gene roles in disease-relevant mouse tissues, accelerating target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery. This approach reduces the time and cost barriers of traditional GEMMs, supporting earlier, data-driven portfolio triage and prioritization. Its adaptability across tissues and gene perturbation types positions it as a scalable platform for preclinical model innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables simultaneous functional assessment of hundreds of candidate tumor suppressor genes in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in tissue-specific oncogenesis.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target prioritization for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Generates validated, multiplexed knockout models for robust screening of gene function.
- Provides quantitative readouts via next-generation sequencing of sgRNA representation.
- Improves reproducibility and scalability compared to single-gene knockout workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease biology by enabling tissue- and context-specific gene perturbation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling single-cell profiling of transduced cells.
- Reduces late-stage attrition risk by providing early, in vivo functional evidence for candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo CRISPR screening method bridges early discovery and preclinical model development, enabling direct functional genomics in relevant tissues before lead identification.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene function testing and pathway mapping in disease-relevant systems.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs for robust comparison of gene perturbations.
- Analytics: Leverages next-generation sequencing for precise measurement of sgRNA enrichment and depletion.
- Translational Research: Supports biomarker discovery and mechanistic alignment with clinical phenotypes.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues, gene sets, and disease models across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and enables high-throughput functional genomics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by providing early, multiplexed in vivo data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero surgery, CRISPR library design, and next-generation sequencing analytics.
- Demands access to ultrasound-guided injection systems and high-titer lentiviral production capabilities.
- Standardization of sgRNA library representation and viral delivery is critical for reproducibility.
- Protocol can be adapted to other organs or CRISPR modalities with appropriate optimization.
- Careful control of viral titer and injection parameters is necessary to avoid confounding effects from multiple sgRNA integration.
