Name: Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę przygotowania ostrych plastrów mózgu myszy do badania spontanicznej aktywności sieci hipokampa. Technika umożliwia rejestrację oscylacji neuronalnych i analizę potencjałów polowych w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować Steve'owi Siegelbaumowi za wsparcie. Finansowanie zapewnia 5R01NS106983-02 oraz 1 F31 NS113466-01.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Columbia (AC-AAAU9451).
1. Przygotuj rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do krojenia sacharozy do krojenia zgodnie z opisem w tabeli 1. 
	UWAGA: Po przygotowaniu 1 l roztworu sacharozy zamrozić niewielką ilość (około 100–200 ml) w tacce na lód. Te zamrożone kostki lodu sacharozy zostaną zmieszane w lodowatą zawiesinę (patrz krok 4.3).</li>
	<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) do zapisu zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
	<li>Przygotuj 1 M NaCl do pipet stymulacyjnych, rozpuszczając 0,05844 g NaCl w 1 ml oczyszczonej wody, która została przefiltrowana w celu usunięcia metali śladowych i innych zanieczyszczeń. 
	UWAGA: Roztwór do cięcia sacharozy i ACSF należy przygotowywać świeże do każdego eksperymentu.</li>
</ol>
2. Przygotuj rampę agarową
<ol>
	<li>Przygotuj 4% agar (np. 2 g agaru w 50 ml wody), rozpuszczając proszek agarowy w oczyszczonej wodzie, która została przefiltrowana w celu usunięcia metali śladowych i innych zanieczyszczeń. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż zacznie wrzeć (około 30–60 s). Wlej stopiony agar do formy i pozwól mu ostygnąć i zestaleniu się w temperaturze 4 °C w lodówce pod kątem około 12°. 
	UWAGA: Do formy można użyć dowolnego szklanego lub plastikowego pojemnika ustawionego pod kątem, z wlaną wystarczającą ilością stopionego agaru, aby utworzyć rampę o długości 4 cm i wysokości około 0,8 cm.</li>
</ol>
3. Przygotowanie obszaru krojenia
<ol>
	<li>Napełnij zlewkę o pojemności 400 ml zawierającą komorę odzyskiwania plastrów około 250 ml ACSF; umieść ją w łaźni wodnej ogrzanej do 32 °C i rozpocznij bulgotanie z karbogenem (95% tlenu gazowego/5% gazowego dwutlenku węgla). 
	UWAGA: Napełnij zlewkę regeneracyjną wystarczającą ilością płynu, aby umieścić nylonową siatkę komory trzymania na samej powierzchni roztworu, tak aby plastry były trzymane na styku mieszaniny ciepłego roztworu i powietrza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Umieść małe kawałki papieru do soczewek na nylonowej siatce. Plasterki zostaną ułożone na wierzchu papieru do soczewek, który można później wykorzystać do przeniesienia plasterków pojedynczo do komory nagrywającej (patrz krok 6.6).</li>
	<li>Umieść kolbę z roztworem sacharozy w wiaderku z lodem, aby się schłodziła i zacznij bulgotać z carbogen. 
	UWAGA: Zlewka regeneracyjna i roztwór sacharozy powinny być odpowiednio podgrzane i schłodzone z bulgotaniem karbogenu przez co najmniej 30 minut przed umieszczeniem myszy w komorze izofluranu.</li>
	<li>Wyciągnij z zamrażarki tacę z gotowymi, zamrożonymi kostkami lodu w roztworze sacharozy i umieść na ławce do częściowego rozmrożenia.</li>
	<li>Umieść połowę czystej, obosiecznej żyletki w mikrotomie i skalibruj, jeśli to konieczne. Odłóż na bok drugą połowę żyletki do użycia podczas sekcji.</li>
	<li>Uruchom przewód karbogeniczny i sondę temperatury do komory krojenia i otocz lodem, aby schłodzić komorę.</li>
	<li>Przygotuj czystą ławkę lub stół pokryty dwoma jednorazowymi wkładami chłonnymi. Rozłóż wszystkie narzędzia do preparowania i trzy kawałki taśmy laboratoryjnej na lewej podkładce, gdzie zostanie przeprowadzona perfuzja przezsercowa. 
	UWAGA: Narzędzia do preparowania obejmują małe nożyczki Bonn, nożyczki do rozwarstwiania, dużą szpatułkę/łyżkę, mikroszpatułkę, skalpel z nowym ostrzem, szpatułkę, ostre/nożyczki chirurgiczne, duże kleszczyki do tkanek i małe kleszczyki do tkanek (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Na drugiej podkładce chłonnej po prawej stronie obszaru perfuzji umieść okrągły kawałek bibuły filtracyjnej w pokrywie szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm. Umieść spód szalki Petriego obok pokrywki i umieść żyłkę karbogeniczną w obu częściach naczynia.</li>
	<li>Za pomocą żyletki lub skalpela wytnij małą rampę agaru (około 4 cm wzdłuż pochylonej powierzchni, 0,8 cm wysokości, 2 cm szerokości). Odetnij kawałek rampy od wysokiego końca i odwróć go, aby utworzyć blok podkładowy z agaru. Użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować rampę agarową i blok podkładowy do platformy do krojenia i odłożyć na bok. 
	UWAGA: Blok podkładowy agaru pomaga ustabilizować mózg podczas krojenia i zapewnia powierzchnię, na której można wypreparować niepotrzebne tkanki z każdego plasterka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Perfuzja przezsercowa
<ol>
	<li>Zawieś strzykawkę o pojemności 60 ml jako zbiornik na roztwór do cięcia sacharozy około 18 cali nad blatem (np. za pomocą trójzębnego zacisku obrotowego na pionowym słupku). Przymocuj rurkę do dna zbiornika, przeprowadź rurkę przez rolkę clamp i podłącz drugi koniec rurki do czystej igły 20 G.</li>
	<li>Napełnij zbiornik o pojemności 60 ml około 30 ml schłodzonego roztworu sacharozy i skieruj linię karbogeniczną do zbiornika sacharozy, aby w sposób ciągły pęcherzykować perfuzat. 
	UWAGA: Upewnij się, że sacharoza przepływa przez rurkę i igłę bez uwięzionych pęcherzyków. Natężenie przepływu powinno być wystarczająco szybkie, aby mieć stały, ciągły strumień kapiącej sacharozy z igły.</li>
	<li>Za pomocą blendera zmiażdż i zmiksuj zamrożoną sacharozę na lodowatą zawiesinę i użyj dużej szpatułki/łyżki do rozprowadzenia gnojowicy.
	<ol>
		<li>Umieść niewielką ilość zawiesiny sacharozy wokół krawędzi szklanej pokrywki szalki Petriego. Dodaj niewielką ilość zawiesiny sacharozy na dno szalki Petriego.</li>
		<li>Dodaj około 20-30 ml zawiesiny sacharozy do zbiornika płynu perfuzyjnego, dobrze mieszając go z 30 ml schłodzonej ciekłej sacharozy, aż zbiornik będzie zawierał mieszaninę bardzo zimnej, głównie płynnej sacharozy z resztkami zamrożonego roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz w komorze podłączonej do waporyzatora izofluranowego. Przy przepływie tlenu z prędkością około 2 l/min przekręć pokrętło parownika, aby dostarczyć izofluran w stężeniu 5% i uruchom timer. 
	UWAGA: Utrzymuj ten licznik czasu przez cały czas krojenia, aby ocenić, jak szybko uzyskuje się plastry. Procedura powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe, tak aby krojenie zostało zakończone, a tkanka odzyskała się w komorze interfejsu w ciągu 15–20 minut od wejścia zwierzęcia do komory izofluranu. Obserwuj mysz, aby upewnić się, że osiągnięty został stan głębokiego znieczulenia. Po minimum 5 minutach mysz powinna być głęboko znieczulona i nie reagować na szczypanie palców</li>.
	<li>Bezpośrednio przed wyjęciem myszy z komory izofluranu należy napełnić pokrywkę szalki Petriego schłodzonym roztworem sacharozy na głębokość około 3–5 mm i napełnić dno szalki Petriego schłodzonym roztworem sacharozy na głębokość około 1,0 cm.</li>
	<li>Szybko przenieś mysz do lewej wkładki chłonnej i użyj 3 kawałków taśmy, aby zabezpieczyć przednie kończyny i ogon. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi tylnej kończyny, aby upewnić się, że mysz nie reaguje przed wykonaniem jakiegokolwiek nacięcia. Za pomocą dużych kleszczy do tkanek i nożyczek chirurgicznych naciągnij skórę i wykonaj nacięcie wzdłuż od dołu mostka do górnej części klatki piersiowej. Za pomocą kleszczy pociągnij do góry mostek i nożyczkami przetnij przeponę. 
	UWAGA: Początkowe ułożenie myszy i pierwsze kilka nacięć w celu przecięcia przepony należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby upewnić się, że mysz nie odzyska przytomności. Aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia podczas całego zabiegu, na myszy można umieścić stożek nosowy, który dostarczy izofluran podczas perfuzji.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową z każdej strony, tnąc jednym dużym ruchem w kierunku punktu, w którym kończyna przednia styka się z ciałem. Za pomocą kleszczy odchyl przód klatki piersiowej i podnieś ją w kierunku głowy, a następnie całkowicie usuń ją poziomym cięciem za pomocą dużych nożyczek. Przytrzymaj serce na miejscu za pomocą dużych kleszczy i włóż igłę perfuzyjną 20 G do lewej komory. Po prawidłowym umieszczeniu igły lewa strona serca powinna szybko zblednąć, gdy schłodzony roztwór sacharozy wypełni komorę.</li>
	<li>Użyj małych nożyczek do rozwarstwiania, aby przeciąć prawy przedsionek i umożliwić przepływ krwi z układu krążenia. Jeśli nacięcia są wykonane prawidłowo, uszkodzenie serca powinno być minimalne, a pompowanie powinno być kontynuowane przez cały czas perfuzji. 
	UWAGA: Zwinięte kawałki bibuły mogą być używane do odprowadzania krwi i roztworu sacharozy z serca i utrzymywania widoczności igły perfuzyjnej podczas zabiegu.</li>
	<li>Upewnij się, że igła perfuzyjna pozostaje na swoim miejscu i nie wypada z lewej komory. Przy odpowiednim natężeniu przepływu i umieszczeniu wątroba zacznie blednąć do jasnobrązowo-beżowego koloru po 20–30 sekundach.</li>
	<li>Po 30–45 s użyj dużych nożyczek, aby odciąć głowę myszy. Trzymając głowę w lewej ręce, odepchnij lub oderwij skórę od czaszki. U zwierzęcia z dobrą perfuzją czaszka powinna być bardzo blada, a mózg powinien mieć bardzo jasnoróżowy kolor (zbliżający się do białego) przez czaszkę bez wyraźnie widocznych naczyń krwionośnych.</li>
</ol>
5. Wyjmij mózg i pokrój plasterki
<ol>
	<li>Za pomocą małych nożyczek Bonn wykonaj dwa boczne nacięcia przez czaszkę w kierunku linii środkowej z przodu czaszki, w pobliżu oczu. Wykonaj dwa dodatkowe nacięcia po obu stronach podstawy czaszki.</li>
	<li>Przenieś głowę na dno szklanej szalki Petriego, gdzie powinna być najbardziej zanurzona w schłodzonym roztworze sacharozy. Użyj małych nożyczek Bonn, aby przeciąć linię środkową wzdłuż czaszki, podciągając nożyczkami, aby zminimalizować uszkodzenie leżącej poniżej tkanki mózgowej. Używając małych kleszczyków do tkanek, mocno chwyć każdą stronę czaszki i odchyl ją w górę i z dala od mózgu, tak jak otwieranie książki.</li>
	<li>Użyj palców lewej ręki, aby przytrzymać otwarte płaty czaszki i włóż mikroszpatułkę pod mózg w pobliżu opuszki węchowej. Odwróć mózg z czaszki do sacharozy i użyj mikroszpatułki, aby odciąć pień mózgu. Umyj mózg, aby usunąć resztki krwi, futra lub innych tkanek.</li>
	<li>Użyj dużej szpatułki/łyżki, aby przenieść mózg na pokrywkę szklanej szalki Petriego. Odłożywszy na bok drugą połowę obosiecznej żyletki, wykonaj dwa nacięcia koronalne, aby najpierw usunąć móżdżek, a następnie najbardziej przednią część mózgu, w tym opuszki węchowe (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Nałóż klej cyjanoakrylowy na rampę agarową. Bardzo krótko umieść mózg na kawałku suchej bibuły filtracyjnej za pomocą dużych kleszczy do tkanek, a następnie natychmiast przenieś go na rampę agarową, umieszczając brzuszną powierzchnię mózgu na kleju. 
	UWAGA: W przypadku wycinków pośredniego hipokampa mózg powinien być zorientowany tak, aby przód był skierowany w górę zbocza rampy, a tył bliżej ostrza. W przypadku wycinków brzusznego hipokampa zorientuj mózg tak, aby przedni koniec był skierowany w dół zbocza rampy, z tylnym końcem na szczycie rampy, dalej od ostrza. W obu przypadkach mózg powinien być umieszczony na szczycie rampy, tak aby przecięta koronalnie powierzchnia mózgu stykała się z blokiem podkładowym agaru (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Umieść platformę do krojenia z agarem i mózgiem w komorze krojenia mikrotomu i całkowicie zanurz w schłodzonym roztworze sacharozy. Użyj dużej szpatułki/łyżki, aby przenieść trochę zawiesiny sacharozy do komory, mieszając, aby stopić zamrożoną sacharozę i szybko obniżyć temperaturę mieszaniny do ~1–2 °C. 
	UWAGA: Obserwuj wskaźnik temperatury podczas krojenia. Jeśli roztwór sacharozy ogrzeje się powyżej 3 °C, dodaj więcej zawiesiny i wymieszaj, aby obniżyć temperaturę.</li>
	<li>Pokrój plastry o grubości 450 μm z prędkością mikrotomu ustawioną na 0,07 mm/s. Gdy każdy plasterek zostanie uwolniony, użyj małych kleszczyków do tkanek i ostrego skalpela, aby najpierw oddzielić dwie półkule, a następnie odciąć tkankę, aż plasterek będzie składał się głównie z obszarów hipokampa i przyhipokampa (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść plastry pojedynczo do komory odzyskiwania granic faz, upewniając się, że są one umieszczone na granicy faz ACSF i powietrza, a plasterki pokrywa tylko cienki menisk ACSF. Szczelnie zamknąć pokrywę komory i pozostawić plastry do odtworzenia w temperaturze 32 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Po wstępnym odzysku w temperaturze 32 °C wyjąć komorę odzysku granicy faz z łaźni wodnej i umieścić na mieszadle ustawionym na niską prędkość, tak aby mieszadło magnetyczne sprzyjało cyrkulacji ACSF w komorze. Pozwól mu stopniowo ostygnąć do temperatury pokojowej, gdy plastry zregenerują się przez dodatkowe 90 minut. Upewnij się, że komora odzyskiwania jest stale bąbelkowa karbogenem i nie pozwól, aby duże pęcherzyki zostały uwięzione pod plastrami.</li>
</ol>
6. Wykonywanie nagrań lokalnego potencjału pola (LFP) spontanicznej aktywności
<ol>
	<li>Przygotuj się do nagrań LFP, włączając wszystkie niezbędne urządzenia, w tym komputer z oprogramowaniem do akwizycji, monitor podłączony do komputera, stymulatory, mikromanipulator, regulator temperatury, źródło światła mikroskopu, kamerę podłączoną do mikroskopu, wzmacniacz mikroelektrod, digitizer i pompę perystaltyczną. W przypadku korzystania z centralnego systemu próżniowego należy otworzyć zawór ścienny, aby przygotować przewód podciśnieniowy, który usunie ACSF z komory nagrywania.</li>
	<li>Napełnij podgrzewany zbiornik ACSF, a następnie umieść jeden koniec rurki w zlewce o pojemności 400 ml zawierającej bulgoczący ACSF. Włączyć pompę perystaltyczną, aby skierować ACSF ze zlewki o pojemności 400 ml do podgrzewanego zbiornika, a następnie z zbiornika do komory rejestracyjnej. Dotknij lub ściśnij rurkę, aby uwolnić uwięzione pęcherzyki.</li>
	<li>Wyreguluj pompę perystaltyczną, aby upewnić się, że natężenie przepływu ACSF przez komorę rejestracyjną jest szybkie (~ 8–10 ml/min). Użyj sondy temperatury, aby upewnić się, że ACSF wynosi 32 °C w środku komory nagrywania. 
	UWAGA: Jeśli ACSF jest dostarczany do komory rejestrującej za pomocą pompy perystaltycznej, wysokie natężenie przepływu może spowodować znaczne wahania natężenia przepływu. Stałe natężenie przepływu można osiągnąć za pomocą prostego tłumika pulsacji składającego się z szeregu pustych strzykawek zintegrowanych z rurką (Rysunek 2).</li>
	<li>Przygotuj pipety do stymulacji i rejestracji z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą podgrzewanego ściągacza do filamentu. Protokół ściągacza powinien być skonfigurowany tak, aby dawał pipety o rezystancji 2–3 MOhm do stymulacji lub elektrody rejestrujące potencjał lokalnego pola.</li>
	<li>Pipety stymulacyjne należy napełnić pipetami 1 M NaCl, a pipety LFP filtrem ACSF.</li>
	<li>Na krótko clamp rurkę i wyłącz pompę, aby wstrzymać przepływ ACSF. Przenieś plasterek do komory nagrywania, używając cienkich kleszczy, aby chwycić róg papieru do soczewek, na którym spoczywa plasterek - plasterek przyklei się do papieru do soczewek. Umieść papier do soczewek i pokrój w komorze nagrywania plasterkiem skierowanym w dół, a następnie "odklej" papier do obiektywu, pozostawiając plasterek zanurzony w komorze nagrywania. Zabezpiecz plasterek za pomocą harfy. 
	UWAGA: Harfy można kupić gotowe lub wykonane w laboratorium przy użyciu kawałka stali nierdzewnej w kształcie litery U lub platyny i cienkiego nylonu.</li>
	<li>Umieść pipetę stymulacyjną wypełnioną NaCl w ręcznym mikromanipulatorze i powoli wsuń końcówkę pipety w powierzchnię plastra (np. w warstwę promienistą) pod kątem około 30–45°. Gdy końcówka pipety wejdzie w tkankę, powoli przesuwaj pipetę do przodu i powstrzymaj się od dużych ruchów w kierunku bocznym lub pionowym, które mogłyby niepotrzebnie uszkodzić aksony w plasterku. Umieść końcówkę pipety na głębokości co najmniej 50–100 μm w plastrze, aby uniknąć komórek w pobliżu powierzchni, które zostały uszkodzone podczas krojenia.</li>
	<li>Umieść pipetę LFP wypełnioną ACSF w uchwycie na pipety przymocowanym do mikromanipulatora z napędem. Zastosować bardzo lekkie nadciśnienie za pomocą ciśnienia ustnego lub strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej za pomocą zaworu odcinającego i krótkiego odcinka rurki do uchwytu pipety. 
	UWAGA: Pipety LFP należy umieścić w warstwie warstwy, aby rejestrować interesujące sygnały: w przypadku ostrych fal jedną pipetę LFP należy umieścić w warstwie piramidalnej (SP), a drugą pipetę w warstwie promieniowej (SR). Taka konfiguracja pozwala na jednoczesne rejestrowanie ujemnej fali ostrej w SR i oscylacji tętnień o wysokiej częstotliwości w SP (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3).</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora powoli przesuwaj końcówkę pipety LFP w obszar zainteresowania (np. warstwę komórek piramidalnych CA1) pod kątem około 30–45°. Umieść końcówkę pipety na głębokości co najmniej 50–100 μm w plastrze, aby uniknąć komórek w pobliżu powierzchni, które zostały uszkodzone podczas krojenia. Podczas przesuwania pipety LFP należy stale dostarczać mały impuls testowy napięcia za pomocą oprogramowania do akwizycji i obserwować nagły wzrost rezystancji elektrody. Może to oznaczać, że pipeta została zatkana lub dociśnięta do ogniwa.</li>
	<li>Po umieszczeniu pipety LFP w obszarze zainteresowania ostrożnie zwolnij nadciśnienie, otwierając zawór na rurki przymocowanej do uchwytu pipety.</li>
	<li>Aby jednocześnie nagrać LFP w drugim miejscu, powtórz kroki 6.8–6.10 z drugą pipetą i mikromanipulatorem.</li>
	<li>Użyj wzmacniacza mikroelektrod w bieżącej konfiguracji cęgów, aby zarejestrować spontaniczną aktywność w potencjale pola lokalnego po użyciu funkcji balansu mostka w oprogramowaniu do akwizycji w celu skorygowania rezystancji szeregowej pipety. Spontaniczne SWR pojawią się jako dodatnie odchylenia w potencjale zewnątrzkomórkowym warstwy SP (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>W celu zarejestrowania wywołanych potencjałów pola należy za pomocą stymulatorów podłączonych do digitizera dostarczyć krótki (200 us) impuls napięcia kwadratowego przez pipetę stymulacyjną wypełnioną NaCl. Dostosuj pokrętło napięcia stymulacji, aby wywołać zakres amplitud odpowiedzi.</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W tym protokole krojenia składa się z kilku etapów, które mają na celu promowanie zdrowia tkanek i sprzyjanie pojawieniu się spontanicznej naturalistycznej aktywności sieciowej: mysz jest transcardially perfundowana schłodzonym roztworem do cięcia sacharozy; plastry kory horyzontalno-śródwęchowej (HEC) są cięte na grubość 450 μm od pośredniego lub brzusznego hipokampa; plastry regenerują się na styku ogrzanego ACSF i nawilżonego, bogatego w karbogen powietrza; podczas nagrań warstwy są przetapiane za pomocą ACSF podgrzan...

Pomiar elektrofizjologiczny z żywych wycinków hipokampa in vitro to potężne eksperymentalne podejście z licznymi zaletami. Eksperymentator może użyć mikroskopu, mikromanipulatorów i systemu rejestracji, aby bezpośrednio wizualizować i zbierać pomiary z poszczególnych neuronów w tkance. Wycinki tkanek są również bardzo łatwo dostępne do fotostymulacji lub dostarczania leków do eksperymentów optogenetycznych, chemogenetycznych lub farmakologicznych.
Sieć hipokampa generuje wysoce synchroniczną aktywność populacji in vivo, widoczną jako oscylacje w zewnątrzkomórkowym potencjale lokalnego pola1,2,3,4,5. Wykorzystano metody wycinków mózgu, aby uzyskać wgląd w mechanizmy komórkowe i obwodowe leżące u podstaw tych oscylacji sieci neuronalnych. Podstawowe prace Maiera i wsp. wykazały, że ostre kompleksy falowo-falowe (SWR) mogą pojawiać się spontanicznie w wycinkach brzusznego hipokampa6,7. Kolejne badania przeprowadzone przez wielu badaczy stopniowo wyjaśniły wiele aspektów SWR, w tym rolę neuromodulatorów w regulacji stanu sieci hipokampa8,9,10 oraz mechanizmy synaptyczne, które napędzają reaktywację in vitro zespołów neuronalnych wcześniej aktywnych podczas zachowania in vivo11. Eksperymenty z próbkowaniem mózgu dostarczyły również informacji na temat oscylacji zakresu gamma (30–100 Hz), odrębnego stanu sieci hipokampa, który uważa się za wspierający kodowanie pamięci i przypominanie12,13. Wreszcie, uznając centralną rolę hipokampa i związanych z nim struktur w patofizjologii padaczki skroniowej14,15, naukowcy wykorzystali preparaty z plastrów hipokampa do zbadania generowania i rozprzestrzeniania się aktywności padaczkowej. Carter i wsp. wykazali, że połączone wycinki kory hipokampowo-śródwęchowej przygotowane z przewlekle chorych na padaczkę zwierząt mogą spontanicznie generować wyładowania padaczkowe in vitro16. Następnie Karlócai i wsp. zbadali mechanizmy leżące u podstaw wyładowań padaczkowych w wycinkach hipokampa, stosując zmodyfikowany sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) ze zmienionymi stężeniami jonów (obniżone Mg2+ lub podwyższone K+) lub dodane leki (4AP lub gabazyna) 17.
Badacze opracowali liczne podejścia do wycinków hipokampa, które różnią się pod kluczowymi względami: (1) obszar hipokampa zawarty w wycinku (grzbietowy, pośredni lub brzuszny); (2) obecność lub brak tkanek pozahipokampowych, takich jak kora śródwęchowa; (3) orientacja używana do krojenia plastrów (czołowa, strzałkowa, pozioma lub ukośna); oraz (4) warunki, w których tkanka jest utrzymywana po pokrojeniu (całkowicie zanurzona w ACSF lub utrzymywana na granicy ACSF i wilgotnego, bogatego w karbogeny powietrza).
Wybór metody krojenia powinien być zdeterminowany przez cel eksperymentalny. Na przykład, poprzeczne lub czołowe wycinki grzbietowego hipokampa utrzymywane w warunkach zanurzonych zostały bardzo skutecznie wykorzystane do badania obwodów wewnątrzhipokampowych i plastyczności synaptycznej18,19,20. Jednak takie preparaty nie generują spontanicznie oscylacji sieci tak łatwo, jak wycinki z brzusznego hipokampa21,22,23. Chociaż stan trwałej aktywności SWR może być wywołany przez stymulację tężcową w poprzecznych warstwach z grzbietowego i brzusznego hipokampa24, spontaniczne SWR są łatwiej obserwowane w warstwach brzusznych7,25.
Nieodłączne fizjologiczne i anatomiczne rozróżnienie między grzbietowym i brzusznym hipokampem jest poparte badaniami przeprowadzonymi zarówno in vivo, jak i in vitro26. Nagrania na szczurach ujawniły silnie spójne rytmy theta w całym grzbietowym i pośrednim hipokampie, ale słabą spójność między obszarem brzusznym a resztą hipokampa27. SWR in vivo łatwo rozprzestrzeniają się między grzbietowym i pośrednim hipokampem, podczas gdy SWR, które pochodzą z brzusznego hipokampa, często pozostają lokalne28. Projekcje asocjacyjne pochodzące z neuronów piramidowych CA3, które znajdują się w hipokampie grzbietowym i pośrednim, rzutują na duże odległości wzdłuż osi podłużnej hipokampa. Projekcje CA3 pochodzące z obszarów brzusznych pozostają względnie lokalne, a zatem jest mniej prawdopodobne, że zostaną przerwane podczas procesu krojenia29,30. Warstwy brzuszne mogą zatem lepiej zachowywać sieć rekurencyjną niezbędną do generowania synchronizacji populacji. Skłonność wycinków brzusznych do generowania spontanicznych aktywności sieciowych in vitro może również odzwierciedlać wyższą wewnętrzną pobudliwość neuronów piramidowych lub słabsze hamowanie GABA-ergiczne w brzusznym hipokampie w porównaniu z większą liczbą regionów grzbietowych31. Rzeczywiście, brzuszne warstwy hipokampa są bardziej podatne na aktywność padaczkową32,33. Tak więc wiele badań spontanicznych fizjologicznych 8,9,11,24 lub patologiczne16,34,35,36 oscylacje sieci tradycyjnie stosowały poziome podejście do krojenia, czasami z niewielkim kątem w obszarze czołowo-potylicznym kierunek, który daje wycinki tkanki równoległe do płaszczyzny poprzecznej brzusznego hipokampa.
Procedura krojenia nieuchronnie wpływa na łączność sieciową, ponieważ wiele komórek w wycinku zostanie odciętych. Należy wziąć pod uwagę kąt i grubość wycinka oraz tkankę zatrzymaną w preparacie, aby zoptymalizować łączność w obwodach będących przedmiotem zainteresowania. W wielu badaniach wykorzystano poziome połączone wycinki kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) do zbadania interakcji między tymi dwiema strukturami w kontekście fizjologicznych lub patologicznych oscylacji sieci. Roth i wsp. przeprowadzili podwójne nagrania z podpola CA1 hipokampa i warstwy V przyśrodkowej kory śródwęchowej, aby zademonstrować propagację aktywności SWR przez HEC slice37. W wielu badaniach nad aktywnością padaczkowo-padaczkową wykorzystano preparat warstwy HEC do zbadania, w jaki sposób wydzieliny padaczkowe rozprzestrzeniają się przez sieć korowo-hipokampową16,35,36,38. Ważne jest, aby pamiętać, że zachowanie nienaruszonej pętli korowo-hipokampowej nie jest warunkiem wstępnym spontanicznych SWR, wyładowań padaczkowych lub oscylacji gamma; Oscylacje sieci mogą być generowane w poprzecznych wycinkach grzbietowego lub brzusznego hipokampa bez dołączonych tkanek przyhipokampa21,22,23, 25,39,40,41. Ważniejszym czynnikiem dla spontanicznego generowania oscylacji sieci w wycinkach hipokampa może być grubość każdego wycinka, ponieważ grubszy plasterek (400–550 μm) zachowa więcej połączeń w sieci rekurencyjnej CA2/CA321,22,25.
Chociaż kątowe poziome warstwy HEC (przycięte pod kątem około 12° w kierunku czołowo-potylicznym) zostały użyte do zbadania funkcjonalnej łączności pętli korowo-hipokampowej11,16,34,35,42, takie przygotowanie pod kątem nie jest wymagane do spontanicznej aktywności sieciowej43,44,45. Jednak użycie kątowej płaszczyzny krojenia pozwala badaczowi na selektywne tworzenie plastrów, które najlepiej zachowują poprzecznie zorientowane blaszki brzusznego lub pośredniego hipokampa, w zależności od tego, czy zastosowano kąt w dół, czy w górę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). To podejście jest koncepcyjnie podobne do tego zastosowanego przez Papatheodoropoulos i in., 2002, którzy rozcięli każdy hipokamp na wolności, a następnie użyli rozdrabniacza do tkanek, aby utworzyć poprzeczne plasterki wzdłuż całej osi grzbietowo-brzusznej21. W świetle wyżej wymienionych funkcjonalnych różnic między hipokampem brzusznym i grzbietowo-pośrednim, badacze powinni wziąć pod uwagę anatomiczne pochodzenie plastrów podczas projektowania eksperymentów lub interpretacji wyników. Użycie rampy agarowej podczas procedury krojenia jest prostym sposobem na preferencyjne wytwarzanie plastrów z pośredniego lub brzusznego hipokampa.
Plastry hipokampa mogą być przechowywane w komorze zanurzonej (z tkanką całkowicie zanurzoną w ACSF) lub komorze typu interface (np. komora Oslo lub Haas, z plastrami pokrytymi tylko cienką warstwą przepływającego medium). Utrzymanie interfejsu zwiększa dotlenienie tkanki, co sprzyja przetrwaniu neuronów i pozwala na utrzymanie wysokiego poziomu aktywności międzyneuronalnej. Tradycyjnie, warunki zapisu w zanurzeniu wykorzystują wolniejsze natężenie przepływu ACSF, które nie zapewnia odpowiedniego natlenienia tkanek dla stabilnej ekspresji oscylacji na poziomie sieci. W zanurzonych wycinkach hipokampa oscylacje gamma wywołane karbacholem są obserwowane tylko przejściowo46,47, podczas gdy mogą być stabilnie utrzymywane w komorach zapisu interfejsu10,48,49. W związku z tym wiele badań nad złożoną spontaniczną aktywnością in vitro opierało się na komorach rejestrujących interfejsy w celu zbadania kompleksów fal ostrych6,7,8,9,10,25,37, oscylacje gamma10,13, oraz aktywność epileptiformyczna16,38,45,47.
W komorze nagraniowej zanurzonej obiektyw mikroskopu immersyjnego może być używany do wizualizacji pojedynczych komórek i selektywnego kierowania do nagrań zdrowo wyglądających komórek. Zanurzony preparat pozwala również na precyzyjną kontrolę środowiska komórkowego, ponieważ zanurzenie ułatwia szybką dyfuzję leków lub innych związków do tkanki. Tak więc zmodyfikowana metodologia, w której stabilne oscylacje sieci są utrzymywane w warunkach zanurzenia, stanowi potężne podejście eksperymentalne. Przykładem tego podejścia jest praca Hájosa i wsp., w której wycinki hipokampa regenerują się w uproszczonej komorze przetrzymywania w stylu interfejsu przez kilka godzin przed przeniesieniem do zmodyfikowanej zanurzonej komory rejestracyjnej o wysokim natężeniu przepływu ACSF (~6 ml / min) w celu zwiększenia dopływu tlenu do tkanki12,48,49. W tych warunkach wysoki poziom aktywności interneuronów i stabilne spontaniczne oscylacje sieci mogą być utrzymywane w zanurzonej komorze rejestracyjnej. To zmodyfikowane podejście pozwala badaczom na wykonanie wizualnie kierowanych zapisów klamr łatek dla całych komórek i scharakteryzowanie udziału morfologicznie zidentyfikowanych typów komórek w oscylacjach gamma wywołanych karbacholem12. SWR mogą również występować spontanicznie w zanurzonych wycinkach hipokampa z szybkim natężeniem przepływu ACSF11,48,49. Maier i in. wykazali, że wycinki hipokampa, które odzyskały sprawność w komorze interfejsu przed przeniesieniem do zanurzonej komory zapisu, niezawodnie wykazywały spontaniczne SWR, podczas gdy plastry, które odzyskały się zanurzone w zlewce przed przeniesieniem do zanurzonej komory rejestracyjnej, wykazywały mniejsze reakcje pola wywołanego, niższe poziomy spontanicznych prądów synaptycznych i tylko bardzo rzadko wykazywały spontaniczne SWRs43. Schlingloff i in. wykorzystali tę ulepszoną metodologię, aby zademonstrować rolę komórek koszyczkowych wyrażających parwalbuminę w generowaniu spontanicznych SWR44.
Poniższy protokół przedstawia metodę krojenia, dzięki której spontanicznie aktywne neurony w poziomych wycinkach hipokampa mogą być odzyskiwane w warunkach interfejsu, a następnie utrzymywane w zanurzonej komorze rejestracyjnej, odpowiedniej do manipulacji farmakologicznych lub optogenetycznych i wizualnie sterowanych nagrań.

<table><tbody><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot TAZ 6</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do inkubacji ostrych plastrów mózgu</td><td>NIH Wymiana druku 3D</td><td>3DPX-001623</td><td>Zaprojektowany przez ChiaMing Lee, dostępny pod adresem https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td></tr><tr><td>Sól magnezowa 5&trifosforanu adenozyny</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9187-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Ag-Cl mielone granulki</td><td>Warner</td><td>64-1309, (E205)</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Becton, Dickinson</td><td>214530-500g</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>36237</td><td></td></tr><tr><td>zlewka (250 ml)</td><td>Kimax</td><td>14000-250</td><td></td></tr><tr><td>zlewka (400 ml)</td><td>Kimax</td><td>14000-400</td><td></td></tr><tr><td>biocytyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>blender</td><td>Oster</td><td>BRLY07-B00-NP0</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Bonn, małe</td><td>becton, Dickinson</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>kapilary ze szkła borokrzemianowego z włóknem (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm, długość 10 cm)</td><td>Preferowane są kapilary polerowane</td> <td>ogniowo Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10HP</td>.</tr><tr><td>roztwór chlorku wapnia (1 M)</td><td>Aparat fotograficzny G-Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>sprężony gaz karbogeniczny (95% tlenu / 5% dwutlenku węgla)</td><td>Gaz powietrzny</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>sprężony tlen</td> Stymulator izolowany stałym napięciem <td>Airgas</td><td>OX 200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Digitimer Ltd.</td>Szkiełka nakrywkowe <td>DS2A-Mk.II</td><td></td></tr><tr><td>(22x50 mm)</td><td>VWR</td><td>16004-314</td><td></td></tr><tr><td>klej cyjanoakrylowy</td><td>Krazy Glue</td><td>KG925</td><td>Najlepiej użyć formy pędzla do precyzyjnego</td></tr><tr><td>akwizycji danych oprogramowanie</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td>Każde równoważne oprogramowanie (np. pClamp) będzie działać.</td></tr><tr><td>Stacja robocza Dell Precision T1500 w obudowie typu tower Komputer stacjonarny</td><td>Dell</td><td>N/A</td><td>Numer katalogowy zależy od konkretnego komputera — każdy komputer będzie działał tak długo, jak długo będzie mógł obsługiwać oprogramowanie do akwizycji elektrofizjologii.</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2950-0367</td><td></td></tr><tr><td>zegar cyfrowy</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>4-kanałowy jednorazowy wkładek chłonnych z timerem śledzonym</td></tr> Nożyczki do dysparowania <tr><td></td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>dwusieczne żyletki</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>podwójny automatyczny regulator temperatury</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>komora zapisu zoptymalizowana pod kątem przepływu dwupowierzchniowego lub laminarnego</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Komora przedstawiona w tym protokole jest wykonana na zamówienie. Komercyjnym odpowiednikiem byłby RC-27L firmy Warner Instruments.</td></tr><tr><td>stojak na sprzęt</td><td>Automate Scientific</td><td>FR-EQ70"</td><td>Stojak nie jest bezwzględnie niezbędny, ale przydatny do organizacji elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoethyiether)-N,N,N',N'--teetraoctowy kwas (EGTA)</td>Bibuła filtracyjna <td>Sigma Aldrich</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Waga drobnoziarnista</td><td></td> <td>Whatman</td> 1004 070 Mettler Toledo XS204DR <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>szklana szalka Petriego (100 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Guanosino-5&prime;-trifosforan sól sodowa hydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>wiadra na lód</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAM168072002-1EA</td><td></td></tr><tr><td>waporyzator izofluranowy</td><td>Usługi znieczulenia ogólnego</td><td>Taśma laboratoryjna Tec 3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>papier do soczewek</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-996</td><td></td></tr><tr><td>źródło światła</td><td>Olympus</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chlorku magnezu (1 M)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-033-721EA</td><td></td></tr><tr><td>magnetyczna Mieszadło</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-56</td><td>Numer katalogowy będzie zależał od wielkości mieszadła.</td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Luigs & Mikromanipulator Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>(ręczny)</td><td>Mikroskop Scientifica</td><td>LBM-2000-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>monitor</td><td>Dell</td><td>2007FPb</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B Wzmacniacz mikroelektrod</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>MultiClamp 700B powinien zawierać stopnie główne, uchwyty na pipety i modelową celę.</td></tr><tr><td>Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N&prime;-(2-etanosulfonowy), (HEPES)</td><td>Igła Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>(20 gauge, 1,5 długości)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>nylonowe włókno</td><td>YLI Wonder Invisible Thread</td><td>212-15-004</td><td>rozmiar 0,004. Ten kot. # pochodzi z Amazon.com</td></tr><tr><td>siatka nylonowa</td><td>Warner Instruments Corporation</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>pompa perstaltyczna</td><td>Aparat Harvarda</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>Sól fosfokreatyny di(tris) Sigma</td><td>Aldrich</td><td>P1937-1G</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do pipet</td><td>Urządzenia molekularne</td> Drut platynowy <td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision</td><td>PT0203</td><td></td></tr><tr><td>filament kwasu polimlekowego (PLA)</td><td>Ultimaker</td><td>RAL 9010</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>glukonian potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1550001-200MG</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr> Zacisk rolkowy <tr><td></td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Świat Precision Instruments</td><td>14041</td><td></td></tr><tr><td>skala</td> Rękojeść skalpela <td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>harfa kropelkowa</td><td>Warner</td><td>SHD-26GH/2</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu jednozasadowy bezwodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>szpatułka</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>szpatułka/łyżka, duża</td><td>VWR</td><td>470149-442</td><td></td></tr><tr><td>sterylne ostrza skalpela</td><td>Feather</td><td>72044-10</td><td></td></tr><tr><td>mieszadło / płyta grzejna</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td></td></tr><tr><td>zawory odcinające, 1-drogowe</td><td>World Precision Instruments</td><td>14054</td><td></td></tr><tr><td>zawory odcinające, 3-drogowe</td><td>World Precision Instruments</td><td>14036</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Acros Organics</td><td>AC177142500</td><td></td></tr><tr><td>wspornik do zacisków obrotowych</td> Nożyczki chirurgiczne <td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q</td><td></td></tr><tr><td>, ostre/</td><td>Fine Science Tools</td>Strzykawka <td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>(1 ml)</td>Strzykawka <td>Becton, Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>(60 ml z końcówką Luer-Lok)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>zacisk trójzębny</td><td>Kleszczyki do tkanek Fisher Scientific</td><td>05-769-8Q</td><td></td></tr><tr><td>, duże</td><td>Kleszczyki</td> do tkanek Fine Science Tools <td>11021-15</td><td></td></tr><tr><td>, małe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>rurka</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>ID 1/16 cala, średnica zewnętrzna 3/16 cala</td></tr><tr><td>rurka</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td>ID 1/8 cala, średnica zewnętrzna 1/4 cala</td></tr><tr><td>smar próżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom z ostrzem wibracyjnym</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Stół tłumiący drgania z klatką Faradaya</td><td>Micro-G / TMC-ametek</td><td>2536-516-4-30PE</td><td></td></tr><tr><td>kolba miarowa (1 L)</td><td>Kimax</td><td>KIM-28014-1000</td><td></td></tr><tr><td>kolba miarowa (2 L)</td><td>PYREX</td><td>65640-2000</td><td></td></tr><tr><td>ciepła kąpiel wodna</td><td>VWR</td><td>1209 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Ostre cięcie mózgu gryzoni oferuje łatwe do opanowania eksperymentalne podejście do uzyskania wglądu w organizację i funkcję obwodów nerwowych z rozdzielczością pojedynczej komórki za pomocą elektrofizjologii, mikroskopii i farmakologii. Jednak głównym czynnikiem branym pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów in vitro jest stopień, w jakim różne preparaty plastrów podsumowują naturalistyczne wzorce aktywności neuronalnej obserwowane in vivo. W nienaruszonym mózgu sieć hipokampa generuje wysoce zsynchronizowaną aktywność populacji odzwierciedlającą stan behawioralny zwierzęcia, czego przykładem są kompleksy fal ostrych (SWR), które występują podczas czuwania w stanie konsumpcji lub snu innego niż REM. SWR i inne formy aktywności sieciowej mogą pojawiać się spontanicznie w izolowanych wycinkach hipokampa w odpowiednich warunkach. Aby zastosować potężny zestaw narzędzi Brain Slice do badania aktywności sieci hipokampa, konieczne jest zastosowanie podejścia, które optymalizuje zdrowie tkanek i zachowanie funkcjonalnej łączności w sieci hipokampa. Myszy są perfundowane przezsercowo sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym na bazie zimnej sacharozy. Poziome plastry zawierające hipokamp są cięte na grubość 450 μm, aby zachować łączność synaptyczną. Plastry są odzyskiwane w komorze interfejsu i przenoszone do zanurzonej komory w celu nagrań. Komora rejestracyjna jest przeznaczona do podwójnej powierzchniowej superfuzji sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego przy dużym natężeniu przepływu w celu poprawy natlenienia warstwy. Protokół ten pozwala uzyskać zdrową tkankę odpowiednią do badania złożonej i spontanicznej aktywności sieci in vitro.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne rejestracje z plastrów HEC przygotowanych zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Po regeneracji w komorze utrzymującej typu interface (Rycina 1C), plastry są przenoszone pojedynczo do zanurzonej komory rejestracyjnej (Rycina 2B). Do komory rejestracyjnej doprowadzany jest nasycony karbogenem roztwór ACSF za pomocą pompy perystaltycznej (Rycina 2A). Pompa najpierw pobiera ACSF z zlewki zbiorczej ...

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Korzystając z tego protokołu, naukowcy mogą badać mechanizmy leżące u podstaw oscylacji sieci hipokampa w preparatach do wycinków mózgu myszy w ostrych odstępach czasu. W tym preparacie nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych w warstwach generujących spontaniczne oscylacje sieci, co pozwala na wykonanie technik farmakologicznych i optogenetycznych oraz wizualizację zapisów jednokomórkowych. W przypadku perfuzji przezsercowej, bezpośrednio przed wyjęciem myszy z komory izofluranu, należy napełnić pokrywkę szalki Petriego trzema do pięciu milimetrów schłodzonego roztworu sacharozy i napełnić dno szalki Petriego około jednym centymetrem schłodzonego roztworu sacharozy.Szybko przenieś znieczuloną mysz do lewej wkładki chłonnej i użyj trzech kawałków taśmy, aby zabezpieczyć przednie kończyny i ogon. Za pomocą dużych kleszczy do tkanek i nożyczek chirurgicznych rozłóż skórę i wykonaj podłużne nacięcie od dołu mostka do górnej części klatki piersiowej. Użyj kleszczy, aby podciągnąć się na mostku i użyj nożyczek, aby przeciąć przeponę.Użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową z każdej strony jednym dużym ruchem w kierunku punktu, w którym kończyna przednia styka się z ciałem, i u

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Ten film demonstruje szczegółowy protokół przygotowania poziomych wycinków mózgu hipokampa od myszy, skupiając się na zachowaniu integralności szlaków włókien hipokampa. Proces ten polega na starannym przecięciu i zabezpieczeniu mózgu, użyciu wibratomu do krojenia i utrzymaniu optymalnych warunków tkanek za pomocą płynu karbogenicznego, w wyniku czego powstają wycinki mózgu hipokampa gotowe do dalszych eksperymentów.

Uzyskiwanie poziomych wycinków mózgu hipokampa myszy

Film demonstruje procedurę rejestrowania potencjału pola lokalnego (LFP) w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy. Stymulacja elektryczna jest zapewniona w warstwie promieniowej CA3 hipokampa, co powoduje zmiany potencjału postsynaptycznego w warstwie piramidalnej CA1. Rejestrowana jest łączna zmiana potencjału błonowego neuronów CA1, zwana potencjałem pola lokalnego.

Rejestracja potencjału pola lokalnego w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy

Opracowaliśmy in vitro rozkładany hipokamp, który zachowuje układ neuronów CA1-CA3. W połączeniu z penetrującym układem mikroelektrod, aktywność neuronalna może być monitorowana zarówno w orientacji podłużnej, jak i poprzecznej. Ta metoda ma przewagę nad preparatami plastrów hipokampa, ponieważ rozmnażanie w całym hipokampie może być rejestrowane jednocześnie.

Propagacja aktywności neuronalnej w rozłożonym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Poznaj metodę przygotowania ostrych plastrów mózgu myszy do badania spontanicznej aktywności sieci hipokampa. Technika umożliwia rejestrację oscylacji neuronalnych i analizę potencjałów polowych w kontrolowanych warunkach in vitro.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Przeglądaj więcej filmów