Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy
25 czerwca 2021
Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.
Protokół ten łączy fluorescencyjną hybrydyzację in situ RNAscope i immunohistochemię przy użyciu świeżo mrożonych lub utrwalonych preparatów mózgu. Technika ta zapewnia elastyczność dzięki zademonstrowaniu kombinacji wysoce czułych metod hybrydyzacji in situ i immunohistochemii do przestrzennej wizualizacji celów RNA i białek w tej samej próbce tkanki. Metoda ta ma zastosowanie do znakowania multipleksowego w sekcji tkanki mózgowej, pomagając w badaniu organizacji przestrzennej i funkcjonalnego znaczenia mRNA i białek w heterogenicznych populacjach neuronów w neurobiologii.
Protokół ten koncentruje się głównie na etapach przetwarzania świeżo mrożonych tkanek i tkanek utrwalonych paraformaldehydem. Aby rozpocząć cięcie świeżo zamrożonej tkanki mózgowej, przymocuj ją do wstępnie schłodzonego uchwytu kriostatu i wytnij odcinki koronalne o grubości 14 mikrometrów. Zamontuj sekcję na naładowanym szklanym szkiełku mikroskopowym.
Przenieś zamontowaną prowadnicę do skrzynki na prowadnice. Następnie przetransportuj pudełko do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na suchym lodzie. W celu utrwalenia tkanek przefiltruj przygotowany roztwór paraformaldehydu.
Schłodzić do 4 stopni Celsjusza. Przenieś zamontowaną szkiełko z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na suchy lód i natychmiast zanurz je we wstępnie schłodzonym roztworze paraformaldehydu na 15 minut, Wykonaj odwodnienie świeżo zamrożonej tkanki, aby upewnić się, że szkiełko jest całkowicie suche. Po usunięciu mózgu ze stałego mocowania z profuzją przezsercową, za pomocą mikrotomu wibracyjnego należy wyciąć skrawki tkanek o grubości 30 mikrometrów.
Przechowuj pocięte fragmenty w roztworze krioprotekcyjnego. W dniu testu FISH przenieść swobodnie pływającą sekcję do 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej 0,1 molowego PBS i mieszać ją z prędkością od 90 do 100 obr./min na wytrząsarce z obrotową platformą w celu zmycia krioprotektantu. Następnie za pomocą pędzla zamontuj wycinek płasko na szklanym szkiełku mikroskopowym, aby zapobiec odklejaniu się podczas prania, i schnij na powietrzu przez co najmniej dwie godziny.
Za pomocą pisaka z barierą hydrofobową narysuj barierę hydrofobową wokół sekcji, w której znajdują się odczynniki FISH. Po wstępnym przetworzeniu tkanka jest inkubowana w roztworze proteazy i hybrydyzowana z sondami RNAscope przez dwie godziny zgodnie z wytycznymi producenta. Następnie wykonywane są sekwencyjne etapy amplifikacji i immunohistochemia fluorescencji.
Zacznij od przygotowania nawilżonej, chronionej przed światłem komory do inkubacji szkiełek. W łaźni wodnej podgrzej 50X bufor do płukania i sonduj do 40 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej przygotuj jeden litr buforu do mycia 1X z 50-krotnego stężenia zapasów.
Przygotować mieszaninę sondy zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. W przypadku leczenia proteinazą dodaj proteinazę 3 do sekcji tkanki i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aby zmyć proteinazę, delikatnie zanurz szkiełko w 0,1 molowym PBS w temperaturze pokojowej, unikając przemieszczenia sekcji.
W celu hybrydyzacji dodaj mieszaninę sondy do sekcji tkanki. Umieść go w nawilżonej, wstępnie ogrzanej komorze. Następnie inkubuj go przez dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Przepłukać część tkanki buforem do płukania dwa razy przez dwie minuty. W celu wzmocnienia sygnału, za pomocą butelki z zakraplaczem, dodaj roztwór wzmacniający, aby pokryć sekcję tkanki i inkubować zgodnie z opisem w tekście. Dodać roztwór blokujący do sekcji tkanki i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
Przesuń szkiełko, aby usunąć nadmiar bufora blokującego po inkubacji. Teraz inkubuj sekcję z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj szkiełko trzykrotnie 1X TBS.
Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować skrawki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Zbadaj szkiełko pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w kamerę. Uzyskuj reprezentatywne obrazy w 20-krotnym powiększeniu i zapisuj je jako pliki TIF.
W niniejszym badaniu jakość tkanek, integralność i brak zanieczyszczenia bakteryjnego zostały potwierdzone przez brak oznakowania DAPI. Znakowanie za pomocą sond kontroli pozytywnej ukierunkowanych na ubikwitynę C, izomerazę peptydyloprolilu B i mRNA polimerazę IIA potwierdziło integralność RNA. W świeżo mrożonych preparatach w celu rozróżnienia neuronów mRNA GalR1 w obrębie NTS zastosowano dodatkowe markery neurochemiczne.
Transporter pęcherzykowy związany błoną był wyraźnie oznakowany. W przeciwieństwie do tego, białka cytoplazmatyczne, takie jak hydroksylaza tyrozynowa i GFP ulegające ekspresji pod kontrolą promotora PHOX2B, były słabo obserwowane i opisywane jako kłaczkowate, ponieważ brakuje im wyraźnego konturu. Znakowanie cytoplazmatycznego mRNA GalR1 za pomocą sondy GalR1 metodą FISH było punktowe i wyraźnie obserwowane.
Aby potwierdzić, że jakość immunohistochemii zależy od lokalizacji subkomórkowej białka, różne białka jądrowe i cytoplazmatyczne znakowano równolegle z FISH w tych samych sekcjach tkanki. Cytoplazmatyczny PHOX2B GFP miał kłaczkowaty wygląd. Natomiast sygnał jądrowego białka PHOX2B był wyraźny, co potwierdziło wyższą jakość znakowania immunologicznego w połączeniu z FISH.
W przypadku wykonywania na nieruchomych zamrożonych skrawkach w połączeniu z FISH, immunohistochemia była wiarygodna niezależnie od lokalizacji subkomórkowej. Neurony mRNA GlyT2 były zlokalizowane brzusznie w stosunku do NTS, a nie w obrębie NTS. Neurony GlyT2 mRNA dodatnie i mRNA PHOX2B nie kolokalizowały się.
Subpopulacja neuronów PHOX2B mRNA dodatnich NTS była immunoreaktywna hydroksylaza tyrozynowa i żadna z nich nie zawierała mRNA GlyT2. RNAscope umożliwia wizualizację i analizę rozkładu RNA w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki w komórkach i tkankach. Umożliwia badania nad nowymi gatunkami RNA, mechanizmami chorobowymi, wzorcami ekspresji genów, różnorodnością neuronów i interakcjami komórkowymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz fluorescencyjnej immunohistochemii (IHC) na świeżych mrożonych i utrwalonych skrawkach mózgu myszy. Technika ta umożliwia jednoczesną wizualizację przestrzenną celów RNA i białek, co wspomaga badania populacji neuronalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia molekularna
- Immunohistochemia
Wstęp
- Badanie analizuje organizację przestrzenną mRNA i białek w heterogenicznych populacjach neuronów.
- Połączenie metod FISH i IHC umożliwia znakowanie multipleksowe w przekrojach tkanki mózgowej.
- Celem jest poprawa zrozumienia ekspresji genów i lokalizacji białek w mózgu.
- Protokół ma zastosowanie zarówno do tkanek świeżo zamrożonych, jak i utrwalonych w paraformaldehydzie.
Cel badania
- Zaprezentowanie niezawodnej i elastycznej metody jednoczesnej detekcji RNA i białek.
- Udoskonalenie badań nad rozkładem mRNA i lokalizacją białek w komórkach neuronalnych.
- Walidacja jakości znakowania immunohistochemicznego w połączeniu z metodą FISH.
Zastosowane metody
- Jako główna platforma wykorzystane zostały świeżo zamrożone oraz utrwalone paraformaldehydem skrawki mózgu.
- Model biologiczny obejmował tkankę mózgową myszy, z koncentracją na sygnałach RNA i białek w neuronach.
- Metoda obejmuje kluczowe etapy, takie jak krojenie, utrwalanie, hybrydyzację i amplifikację sygnału.
- W celu uzyskania wyraźnych wyników zastosowano szczegółowe protokoły inkubacji i przemywania.
Główne wyniki
- Sondy kontroli pozytywnej potwierdziły integralność RNA, podczas gdy w przypadku białek zaobserwowano różny stopień klarowności sygnału.
- Badanie wykazało możliwość rozróżnienia sygnałów cytoplazmatycznych i jądrowych w neuronach.
- Odnotowano wskazania na obecność odrębnych populacji neuronów oraz ich ekspresję RNA/białek.
- Połączenie metod FISH i IHC okazało się niezawodne w wizualizacji wielu celów w obrębie tych samych przekrojów.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia zaawansowaną analizę różnorodności i oddziaływań neuronów w obrębie tkanki mózgowej.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych analiz mechanizmów neuronalnych oraz potencjalnych modeli chorób.
- Metoda ta pogłębia naszą wiedzę na temat dynamiki molekularnej i komórkowej w neuronauce.
Często zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Połączenie multipleksowej metody FISH z fluorescencyjnym IHC umożliwia działom B+R w branży biofarmaceutycznej analizę przestrzennej koekspresji celów RNA i białkowych w heterogenicznych populacjach neuronów, co wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w neurologii. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie sygnatur molekularnych z fenotypami komórkowymi, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go we wczesnej fazie odkrywania. Możliwość zastosowania tej metody w tkankach świeżo zamrożonych oraz utrwalonych zapewnia elastyczność procesu badawczego podczas analizy celów w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie rzadkich mRNA (np. receptora galaninowego 1) oraz transcripts wysokiej obfitości w obrębie jąder mózgu zdefiniowanych immunohistochemicznie.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki jednoczesnemu znakowaniu RNA i białek, co pozwala na wyjaśnienie zaangażowania celu i modulacji szlaków w obwodach neuronalnych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez rozróżnianie subpopulacji neuronalnych na podstawie sygnatur neurochemicznych, co zmniejsza niejednoznaczność w wyborze celu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez potwierdzenie integralności RNA za pomocą sond kontroli pozytywnej (ubikwityna C, peptydyloprolyloizomeraza B, polimeraza RNA IIA).
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu dzięki zoptymalizowanym warunkom inkubacji proteazą i hybrydyzacji, co poprawia powtarzalność w preparatach tkanek świeżo zamrożonych i utrwalonych.
- Wartość skalowalności: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy do multipleksowej detekcji RNA-białko, pomagając w niezawodnej ocenie związków w kampaniach fenotypowych badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Poprawia dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez wizualizację organizacji przestrzennej ekspresji mRNA i białek w istotnych dla choroby jądrach pnia mózgu (np. NTS).
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez utrzymanie jakości IHC po wykonaniu FISH, szczególnie w przypadku celów związanych z błoną komórkową.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji poprzez wykazanie braku kolokalizacji między neuronami pozytywnymi pod kątem mRNA GlyT2 a neuronami pozytywnymi pod kątem mRNA PHOX2B, co pozwala na doprecyzowanie modeli mechanistycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od identyfikacji celu po optymalizację związku wiodącego, umożliwiając przestrzenną walidację celów molekularnych w populacjach neuronów przed przeprowadzeniem przesiewu fenotypowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez określanie rozkładu RNA w neuronach zidentyfikowanych immunohistochemicznie, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analiz dzięki zestandaryzowanym przepływom pracy FISH-IHC, gwarantując odtwarzalne odczyty przestrzenne do oceny odpowiedzi na badane związki.
- Analityka: Generuje ilościowe dane przestrzenne za pomocą detekcji sygnału fluorescencyjnego, umożliwiając porównanie poziomów ekspresji RNA i białek w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez walidację ekspresji celu w utrwalonych preparatach tkankowych, co wspiera modelowanie chorób w oparciu o biomarkery.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako reużywalna metoda profilowania przestrzennego w programach odkryć neurobiologicznych, maksymalizując zwrot z inwestycji w infrastrukturę.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną dzięki bezpośredniej wizualizacji koekspresji RNA-białko, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki optymalizacji etapów proteazy i hybrydyzacji, minimalizując zmienność w znakowaniu multipleksowym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów dzięki rozdzielczości subkomórkowej, co zmniejsza liczbę niepowodzeń w późnych fazach z powodu niedopasowania biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka poprzez identyfikację subpopulacji neuronalnych o odrębnych profilach RNA-białko, co dostarcza informacji niezbędnych do wyboru wskazań.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej, pracy z sondami RNA oraz optymalizacji przeciwciał w celu zapewnienia specyficzności sygnału.
- Zależne od środowiska wolnego od RNaz, narzędzi do cięcia w kriosztacie lub mikrotomie oraz systemów obrazowania fluorescencyjnego z odpowiednimi zestawami filtrów.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji czasu inkubacji proteaz oraz protokołów walidacji przeciwciał, aby zapewnić spójną jakość IHC po wykonaniu FISH.
- Wymaga adaptacji w zależności od subkomórkowej lokalizacji białka, ponieważ cele cytoplazmatyczne mogą wymagać szeroko zakrojonego rozwiązywania problemów, podczas gdy białka związane z błoną wykazują zachowaną specyficzność.
- Ograniczone przez problemy z obróbką tkanek w preparatach utrwalonych i zamrożonych, choć jakość IHC jest wyższa po optymalizacji z użyciem RNAscope.
