Name: Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metody oceny transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka, w tym hodowlę 3D i wzrost niezależny od podłoża. Protokół umożliwia badanie proliferacji i dystrybucji linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium AG jest finansowane przez Hiszpańską Radę Bezpieczeństwa Jądrowego. T.A. i A.G. są członkami grupy badawczej uznanej przez Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT jest beneficjentem kontraktu finansowanego przez Fundację Naukową Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Kontrakt G.F. jest finansowany z grantu Fundacji Cellex.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li>
<li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).</li>
<li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Ince, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+different+human+breast+epithelial+cell+types+leads+to+distinct+tumor+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes.</a> Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).</li>
<li>Repullés, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+malignant+transformation+of+preneoplastic+and+normal+breast+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells.</a> Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brocher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioVoxxel+Image+Processing+and+Analysis+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22European+BioImage+Analysis+Symposium%22%5BJournal%5D)">The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox.</a> European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).</li>
<li>Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+random+close+packing+of+spheres+well+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Is random close packing of spheres well defined.</a> Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokoły eksperymentalne opisane w tym artykule dostarczają użytecznych narzędzi do oceny transformacji onkogennej komórek hodowanych in vitro. Każda technika ocenia określone aspekty procesu transformacji, a co za tym idzie, należy zwrócić szczególną uwagę przy wyciąganiu wniosków z pojedynczej analizy. Tworzenie krzywych wzrostu to podejście, które wymaga informacji już dostępnych podczas hodowli komórek do innych celów. To sprawia, że technika ta jest tańsza i łatwiejsza do zastosowania w porównaniu z innymi testami ...

Do rozwoju nowotworu wymagane jest wiele następujących po sobie zdarzeń. W 2011 roku Hanahan i Weinberg opisali 10 możliwości, które umożliwiają wzrost, przetrwanie i rozprzestrzenianie się transformowanych komórek: tak zwane "cechy charakterystyczne raka"1. Opisana tutaj metodologia kompiluje trzy różne narzędzia do oceny transformacji komórkowej in vitro, koncentrując się na niektórych charakterystycznych cechach komórek nowotworowych. Techniki te oceniają tempo proliferacji komórek, zachowanie komórek podczas hodowli w 3D oraz ich zdolność do tworzenia kolonii z niezakotwiczeniem.
Modele komórkowe są kluczowe do testowania hipotez in vitro. Opracowano różne podejścia do generowania eksperymentalnych modeli transformacji komórkowej na potrzeby badania raka2,3,4. Ponieważ rak piersi jest najczęstszym nowotworem wśród kobiet na całym świecie i jest odpowiedzialny za około 15% zgonów z powodu raka wśród kobiet5, dostarczenie odpowiednich modeli komórkowych komórek nabłonka sutka ma ogromne znaczenie dla dalszych badań. W tym artykule zilustrowaliśmy potencjał trzech technik oceny transformacji komórkowej za pomocą eksperymentalnego modelu transformacji pierwotnych komórek nabłonkowych piersi (BPECs) pierwotnie opisanego przez Ince i współpracowników w 2007 roku6, a następnie wdrożonego w naszym laboratorium7. Ten eksperymentalny model opiera się na sekwencyjnej zmianie trzech docelowych genów (antygenów SV40 Large T i Small T, zwanych tutaj jako Ttag, hTERT i HRAS) w genomie nieprzekształconych BPEC. Co więcej, metoda zastosowana do wyprowadzenia BPEC sprzyja utrzymaniu komórek nabłonka sutka z markerami luminalnymi lub mioepitelialnymi, co skutkuje niejednorodną hodowlą komórek, która zachowuje niektóre cechy fizjologiczne gruczołu sutkowego.
W gruczole sutkowym, komórki nabłonka sutka świetlnego, które są odpowiedzialne za produkcję mleka, znajdują się blisko światła, podczas gdy komórki mioepitelialne są rozmieszczone wokół komórek luminalnych i zajmują się ruchami skurczowymi prowadzącymi mleko do brodawki. Utrata prawidłowej organizacji między tymi liniami komórkowymi jest cechą transformacji nowotworowej8, którą można ocenić in vitro po immunofluorescencyjnym wykryciu charakterystycznych markerów linii w hodowlach komórkowych 3D. Inną ważną cechą komórek nowotworowych jest ich zdolność do wzrostu bez przyłączania się do innych komórek i do macierzy zewnątrzkomórkowej1. Kiedy zdrowe komórki są zmuszone do wzrostu w zawiesinie, aktywowane są mechanizmy takie jak anoikis \u2012 rodzaj śmierci komórki indukowany w odpowiedzi na oderwanie od macierzy zewnątrzkomórkowej \u2012 9. Unikanie śmierci komórki jest jedną z charakterystycznych cech raka, a zatem przekształcone komórki są zdolne do dezaktywacji anoikis i przetrwania w sposób niezależny od kotwicy. Zdolność tę można ocenić in vitro za pomocą testu niezależnego od zakotwiczenia przy użyciu miękkiego agaru. Co więcej, nieodłączną cechą tkanek nowotworowych jest ich trwała proliferacyjna zdolność sygnalizacyjna, którą można łatwo monitorować w warunkach in vitro, mierząc wzrost liczby komórek w czasie, nie tylko w testach zawiesinowych, ale także poprzez monitorowanie tempa wzrostu jednowarstwowych kultur przylegających.
Pomimo tego, że najlepszym modelem do testowania potencjału rakotwórczego jest inokulacja komórek nowotworowych w modelach mysich i ocena rozwoju guza in situ, ważne jest, aby zminimalizować liczbę zwierząt wykorzystywanych w procedurach eksperymentalnych tak bardzo, jak to możliwe. W związku z tym posiadanie odpowiednich testów do oceny przemian in vitro jest najwyższym priorytetem. W tym miejscu udostępniamy zestaw narzędzi do oceny potencjału rakotwórczego częściowo i całkowicie przekształconych komórek nabłonka piersi, które można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów pracujących z modelami transformacji komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Pipety serologiczne 1 ml</td><td>Labclinics</td><td>PLC91001</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorfs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451</td><td>Ciemne eppendorfy są preferowane do długotrwałego przechowywania MTT</td></tr><tr><td>10 &mu; l Końcówki do pipet bez filtra</td><td>Biologix</td><td>20-0010</td><td></td></tr><tr><td>szklana butelka</td><td></td><td></td> 100 ml <td>Z nakrętką, autoklawowalne</td></tr><tr><td>1000 &mu; l Końcówki do pipet z filtrem</td><td>Labclinics</td><td>LAB1000ULFNL</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; l Końcówki do pipet bez filtra</td><td>Biologix</td><td>20-1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>VWR</td><td>525-0400</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 2 ml</td><td>Labclinics</td><td>PLC91002</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Końcówki do pipet z filtrem</td><td>Labclinics</td><td>FTR200-96</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipety serologiczne</td><td>Labclinics</td><td>PLC91005</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>VWR</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>PanReac AppliChem</td><td>211007</td><td>Służy do utrwalania struktury 3D przed znakowaniem immunofluorescencyjnym</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Służy do oznaczania zakotwiczenia</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Claudin 4</td><td>Abcam</td><td>15104, RRID:AB_301650</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:100, gospodarz: królik</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytokeratyny 14 [RCK107]</td><td>Abcam</td><td>9220, RRID:AB_307087</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:100, gospodarz: mysz</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie Cyjanina Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>115-165-146, RRID:AB_2338690</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:500, gospodarz: koza</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw królikowi Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034, RRID:AB_2576217</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:500, gospodarz: koza</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox</td><td></td><td>RRID:SCR_015825</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa 24-dołkowa płytka</td><td>Labclinics</td><td>PLC30024</td><td>Używany do kultur 3D w Matrigel. Płaskie dno</td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa 6-dołkowa płytka</td><td>Labclinics</td><td>PLC30006</td><td>Służy do oznaczania zakotwiczenia</td></tr><tr><td>Inkubator komórkowy (37 &ordm; C i 5 % CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek</td><td>Fisherbrand</td><td>11587522</td><td>Rozmiar oczek: 40 &mu; m</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CellSense</td><td>Olympus</td><td></td><td>Służy do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toksyna z Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Klasa II Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego</td><td>Herasafe</td><td>HAEREUS HS12</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop odwrócony</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe</td><td>Witeg Labortechnik GmbH</td><td>4600122</td><td>22 X 22 mm, grubość 0,13 - 0,17 mm</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>2-(4-amidinofenyl)-1H -indolo-6-karboksyamidyna</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td>Służy do inaktywacji działania trypsyny</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fidżi (ImageJ)</td><td>National Institutes of Health</td><td>RRID:SCR_002285</td><td>Bezpłatne pobieranie, licencja nie jest wymagana</td></tr><tr><td>Szklane pipety</td><td></td><td></td><td></td>Pasteura</tr><tr><td>Szkiełka podstawowe</td><td>Fisherbrand</td><td>11844782</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Biowest</td><td>S2000</td><td>Służy do immunofluorescencji struktur 3D</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td> żaroodporne <td>Służy do manipulacji agarem po autoklawie</td></tr><tr><td>Kąpiel grzewcza (37 &ordm; C)</td><td></td><td></td> <td>Służy do hartowania roztworów przed subkulturą komórkową</td></tr><tr><td>Kąpiel grzewcza (42 &ordm; C)</td><td></td><td></td> <td>Służy do utrzymywania ciepła agaru</td></tr><tr>Płyta <td></td><td></td><td>grzewcza</td><td>Służy do odwadniania Matrigel</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> wilgotna <td>Służy do inkubacji przeciwciał podczas immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td>Używany podczas manipulacji Matrigelem</td></tr><tr>Odwrócony mikroskop optyczny<td>Ice-box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>354234</td><td>Sklep pod adresem -20 &ordm; C i przechowywać w chłodnym miejscu podczas użytkowania. Określany jako matryca membrany podstawnej</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131091</td><td>Służy do utrwalania struktury 3D przed znakowaniem immunofluorescencyjnym</td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td></td><td></td><td>p1000, p200 i p10</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td>RRID:SCR_016137</td><td>Służy do obliczania podwojenia populacji i uzyskiwania równania szybkości wzrostu</td></tr><tr><td>MiliQ wody</td><td></td><td></td><td>Określany jako ultraczysty lakier</td></tr><tr><td></td><td></td><td>do paznokci</td><td>Służy do uszczelniania próbek po zamontowaniu</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Służy do pokrywania roztworu przeciwciał podczas inkubacji</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (bez wapnia i magnezu)</td> <td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>Sterylny. Stosowany do subhodowli komórkowych</td></tr><tr><td>PBS tabletki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Rozcieńczyć w wodzie miliQ. Nie jest wymagana sterylność. Używany do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Pipeta Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaria T25 Kolby</td><td>Corning</td><td>353808</td><td>Używany do hodowli BPEC</td></tr><tr><td>Berło Automatyczny licznik komórek</td><td>Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Alternatywnie użyj hemocytometru</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td>Służy do cięcia końcówek pipet i parafilmu</td></tr><tr><td>Sterylne filtry 0,22 &mu; m</td><td>Milipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Służy do filtrowania roztworu MTT</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromek (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &ordm; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Służy do immunofluorescencji struktur 3D</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 10X</td><td>Biowest</td><td>X0930</td><td>Rozcieńczony w PBS w celu uzyskania roztworu 3X</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Podłoże montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>WIT-P-NC Culture Medium</td><td>Stemgent</td><td>00-0051</td><td>Używany do pierwotnej hodowli BPEC</td></tr><tr><td>WIT-T Pożywka hodowlana</td><td>Stemgent</td><td>00-0047</td><td>Używana do transformacji kultur BPEC</td></tr></tbody></table>

ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Nowotworzenie to wieloetapowy proces, w którym komórki nabywają zdolności pozwalające na ich wzrost, przetrwanie i rozprzestrzenianie się w nieprzyjaznych warunkach. Różne testy mają na celu identyfikację i ilościowe określenie tych cech charakterystycznych komórek rakowych; Jednak często koncentrują się one na jednym aspekcie transformacji komórkowej i w rzeczywistości do ich właściwej charakterystyki wymaganych jest wiele testów. Celem niniejszej pracy jest dostarczenie naukowcom zestawu narzędzi do oceny przemian komórkowych in vitro z szerokiej perspektywy, a tym samym umożliwienie wyciągnięcia rzetelnych wniosków.
Trwała aktywacja sygnalizacji proliferacyjnej jest główną cechą tkanek nowotworowych i może być łatwo monitorowana w warunkach in vitro, obliczając liczbę podwojeń populacji osiągniętych w czasie. Poza tym wzrost komórek w hodowlach 3D pozwala na ich interakcję z otaczającymi komórkami, przypominając to, co dzieje się in vivo. Umożliwia to ocenę agregacji komórkowej i, wraz z immunofluorescencyjnym znakowaniem charakterystycznych markerów komórkowych, uzyskanie informacji na temat innej istotnej cechy transformacji nowotworowej: utraty prawidłowej organizacji. Inną niezwykłą cechą transformowanych komórek jest ich zdolność do wzrostu bez przyłączania się do innych komórek i do macierzy zewnątrzkomórkowej, którą można ocenić za pomocą testu zakotwiczenia.
Szczegółowe procedury eksperymentalne do oceny tempa wzrostu komórek, przeprowadzania immunofluorescencyjnego znakowania markerów linii komórkowej w hodowlach 3D oraz testowania niezależnego od zakotwiczenia wzrostu komórek w miękkim agarze są zapewnione. Metodologie te są zoptymalizowane pod kątem pierwotnych komórek nabłonka piersi (BPEC) ze względu na ich znaczenie w raku piersi; Jednak po pewnych dostosowaniach procedury można zastosować do innych typów komórek.

W celu uzyskania reprezentatywnych wyników transformacji onkogennej wybrano eksperymentalny model transformacji komórkowej z wprowadzeniem trzech elementów genetycznych do BPEC6,7 (Rysunek 3). Nietransformowane BPEC (N) wyizolowano z wolnej od choroby tkanki piersi zgodnie z opisem Ince i współpracowników6 i hodowano według wskazanego tutaj protokołu. Po przejściu stanu STASIS (starze...

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Metodologia ta wykorzystuje integrację różnych wskaźników do oceny stopnia transformacji dowolnego modelu komórki. Technika ta zapewnia naukowcom zestaw czasochłonnych, ale prostych w użyciu narzędzi do oceny transformacji komórek in vitro. Dzięki temu metoda może być stosowana w większości laboratoriów.Procedurę zademonstrują Teresa Anglada, doktor habilitowany z mojego laboratorium, oraz Joan Repulles, specjalistka od mikroskopii. Gdy hodowla pierwotnych komórek nabłonka piersi osiągnie 90% zbieżności, przenieś supernatant z kolby hodowlanej do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry płodowej surowicy bydlęcej i przemyj komórki PBS. Traktuj komórki jednym mililitrem trypsyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Gdy komórki się odłączą, dezaktywuj trypsynę zarezerwowanym podłożem i zbierz komórki przez odwirowanie. Przesuń probówkę, aby ponownie zawiesić granulkę i dodaj od jednego do dwóch mililitrów świeżego podłoża do liczenia. Po określeniu stężenia komórek dodaj 300 000 komórek do nowej probówki i doprowadź końcową objętość do pięciu mililitrów za pomocą dodatkowej świeżej pożywki hodowlanej.Umieść komórki nasienne w nowej kolbie T25 i włóż je z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnie użyj wzoru, aby obliczyć liczbę skumulowanych podwojeń populacji. Aby ocenić tempo proliferacji komórek, wykreśl skumulowaną liczbę podwojeń populacji w określonym przedziale czasu.Zwiększone nachylenie wskazuje na zwiększone tempo proliferacji komórek. Aby skonfigurować hodowlę komórkową 3D, przepłucz studzienki o powierzchni 1,9 centymetra kwadratowego zimnym sterylnym PBS i pokryj dno każdej studzienki 100 mikrolitrami macierzy membrany podstawnej. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na około 20 minut, aby matryca zastygła.W międzyczasie zbierz komórki sutkowe, jak właśnie pokazano, i rozcieńcz komórki do 400 000 komórek na mililitr średniego stężenia. Wymieszaj komórki ze świeżą pożywką uzupełnioną 8% macierzą błony podstawnej w stosunku jeden do jednego i dodaj 500 mikrolitrów komórek do każdej studzienki zestalonej matrycy. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kilka minut, a następnie dodać 500 mikrolitrów pożywki uzupełnionej 4% macierzyą błony podstawnej do każdej studzienki.Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 14 dni. Wysiane komórki będą grupować się i namnażać, tworząc struktury podobne do acini. Do wykrywania białek immunofluorescencyjnych w hodowanych komórkach sutka 3D, użyj odciętej końcówki pipety P200, aby usunąć matrycę błony podstawnej z każdej studzienki i rozsmarować około 50 mikrolitrów zdezagregowanej matrycy z każdej studzienki na pojedynczych szkiełkach.Gdy próbki całkowicie wyschną, utrwal komórki roztworem metanolu i acetonu jeden do jednego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po utrwaleniu zablokuj próbki roztworem blokującym na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów podstawowego roztworu roboczego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania i przykryć szkiełka paskiem laboratoryjnej folii do owijania w celu inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.Następnego ranka przemyj szkiełka trzy razy PBS przez jedną godzinę na mycie i oznacz próbki odpowiednim roztworem przeciwciał drugorzędowych, jak właśnie pokazano. Pod koniec inkubacji umyć próbki dwa razy w PBS przez dwie godziny na przemycie, a następnie przeciwbarwić DAPI rozcieńczonym w podłożu zapobiegającym blaknięciu i przykryć każde szkiełko nakrywkowym. Następnie przeanalizuj rozkład sygnału fluorescencyjnego dla każdego acinusa pod mikroskopem konfokalnym.Aby przeprowadzić test niezależny od zakotwiczenia, najpierw przykryj dno odpowiedniej liczby studzienek płytki sześciodołkowej 1,5 mililitra 0,6% agaru w roztworze pożywki i pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr roztworu, jak pokazano, i przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Trzymając probówkę pod kątem 45 stopni, dodaj równą objętość 0,6% agaru w podżywce wzdłuż ścianki probówki.A po dokładnym wymieszaniu nałóż jeden mililitr komórek w zawiesinie agarowej do każdego dołka wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej. Użyj odwróconego mikroskopu, aby potwierdzić, że komórki zostały jednorodnie rozproszone w całym agarze. Gdy agar całkowicie zastygnie, ostrożnie dodaj jeden mililitr pożywki odświeżającej do każdej studzienki, nie naruszając agaru i inkubuj komórki przez trzy tygodnie, zmieniając pożywkę dwa razy w tygodniu.Pod koniec okresu tworzenia kolonii zastąp pożywkę jednym mililitrem jednego miligrama na mililitr MTT na studzienkę na 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia usuń MTT z każdej studzienki i uzyskaj obrazy każdej studzienki pod odwróconym mikroskopem. Gdy wszystkie obrazy zostaną pobrane, otwórz obrazy w ImageJ i kliknij obraz, dostosuj, próg i zastosuj, aby uzyskać maskę binarną poprzez progowanie oryginalnego obrazu.Po uzyskaniu dobrze oddzielonych kolonii wybierz wtyczki i biovoxxel, aby uruchomić rozszerzony analizator cząstek w celu identyfikacji kolonii MTT-dodatnich. W określonym przedziale czasu częściowo i całkowicie przekształcone komórki osiągają większą liczbę podwojeń populacji w porównaniu z komórkami nieprzekształconymi, co wskazuje, że szybkość podziału komórek zwiększa się wraz z procesem transformacji. W ciągu dwutygodniowego okresu hodowli komórek 3D komórki agregują się i namnażają, zwiększając rozmiar acini.Właściwa polaryzacja każdego acinusa może być dokładnie oceniona za pomocą detekcji immunofluorescencyjnej białek w połączeniu z trójwymiarową lokalizacją sygnału za pomocą mikroskopii konfokalnej. Podczas gdy wszystkie acini utworzone przez nieprzekształcone komórki piersi są prawidłowo zorganizowane, utratę polaryzacji obserwuje się w acini utworzonej przez częściowo i całkowicie przekształcone komórki. Po trzech tygodniach osadzonej hodowli agarowej komórki o zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia dają początek koloniom złożonym z wielu komórek.Tylko metabolicznie aktywne komórki są zdolne do rozszczepienia tetrazolowego pierścienia MTT, w wyniku czego po 24 godzinach powstają fioletowe kryształy formazanu MTT. Pomiar średnicy kolonii za pomocą automatycznej analizy obrazu pozwala na filtrowanie kolonii o niskiej proliferacji lub pojedynczych komórek. Liczba kolonii utworzonych przez komórki nieprzekształcone jest znikoma w porównaniu z tymi z komórek częściowo i całkowicie przekształconych.Wielkość kolonii może być również wykorzystana do rozróżnienia komórek o różnym stopniu transformacji. Testy te mogą być stosowane do badań przesiewowych linii komórkowych przed jakimkolwiek szczepieniem, ponieważ tylko te linie komórkowe, które uzyskały pozytywny wynik in vitro, powinny być inokulowane myszom.

in-vitro-evaluation-oncogenic-transformation-human-mammary-epithelial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym raporcie prezentujemy system izolacji i hodowli komórek donora z gruczołu mlekowego myszy oraz ich ortotopowego przeszczepienia do myszy biorców w celu analizy interakcji zrąb-nabłonek podczas rozwoju guza piersi.

Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Test Focus Formation dostarcza prostej metody oceny potencjału transformacyjnego kandydującego onkogenu.

Tworzenie ogniska: test komórkowy w celu określenia potencjału onkogennego genu

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Obecny protokół opisuje doprzewodową iniekcję wektorów wirusowych przez smoczek w celu dostarczenia interesujących genów do komórek nabłonka sutka.

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Poznaj metody oceny transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka, w tym hodowlę 3D i wzrost niezależny od podłoża. Protokół umożliwia badanie proliferacji i dystrybucji linii komórkowych.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Przeglądaj więcej filmów