Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET
27 października 2020
Ze względu na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) czujników opartych na transferze energii rezonansu (FRET) Fӧrster, pomiar sygnałów cAMP był wyzwaniem, zwłaszcza w trzech wymiarach przestrzennych. W tym miejscu opisujemy metodologię obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, która umożliwia pomiar rozkładu cAMP w trzech wymiarach przestrzennych.
Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia metodę pomiaru i wizualizacji sygnałów FRET lub cyklicznych sygnałów AMP w trzech wymiarach przestrzennych w poszczególnych komórkach. Cykliczne rozkłady AMP mogą występować nie tylko osiowo, ale także bocznie, dlatego ważne jest, aby pozyskać dane obrazu cyklicznego AMP FRET w trzech wymiarach, aby próbkować te rozkłady. W dniu obrazowania ciepłe tyrody buforują się do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej i umieszczają szkiełko nakrywkowe osadzone z transfekowanymi komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania w komorze komórkowej.
Zabezpiecz górną część komory uszczelką montażową, aby zapobiec wyciekom i użyj delikatnej wycieraczki, aby usunąć nadmiar podłoża lub przylegających komórek z dna szkiełka nakrywkowego. Dodaj 800 mikrolitrów buforu roboczego i cztery mikrolitry pięciomilimolowej etykiety jądrowej do komory ogniwa i delikatnie kołysz komorą przez pięć do 10 sekund. Następnie przykryj komorę komórkową folią aluminiową na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Aby zobrazować komórki, wybierz obiektyw 60X zanurzony w wodzie w mikroskopie konfokalnym wyposażonym w detektor spektralny i dodaj kroplę wody do obiektywu. Umieść załadowaną komorę komórkową na mikroskopie stage i dostrój pokrętło filtra, aby wybrać odpowiedni zestaw filtrów. Wybierz tryb szerokokątnego pola fluorescencji i za pomocą okularów wybierz pole view zawierające komórki wyrażające cykliczny czujnik AMP FRET.
Otwórz oprogramowanie do obrazowania, wybierz tryb konfokalny i odblokuj przycisk blokady laserowej. Otwórz menu ustawień A1. Zaznacz pola odpowiadające liniom laserowym 405 i 561 nanometrów i ustaw te detekcje spektralne na SD, rozdzielczość na 10, a kanały na 32.
Wybierz początkową i końcową wartość długości fali, aby ustawić zakres długości fali. Otwórz menu Ustawienia A1, aby wybrać ikonę pomijania kategoryzacji. Zaznacz pole numer 15 i kliknij przycisk OK. Ustaw intensywność lasera na osiem procent dla lasera 405 nanometrów i na dwa procent dla lasera 561 nanometrów.
Ustaw wzmocnienie detektora na 149, a promień otworka na 2,4 jednostki dysku Airy. Ustaw szybkość skanowania na 25 klatek widmowych na sekundę i wybierz jednokierunkowy kierunek skanowania. Ustaw liczbę na cztery, a rozmiar skanowania na 1024 na 1024.
Aby zdefiniować parametry akwizycji stosu z, kliknij opcje Widok, Kontrola nabycia i Akwizycja ND, a następnie wprowadź miejsce docelowe i nazwę pliku w oknie podręcznym, aby zapisać plik ND. Kliknij pole Z-series, a następnie kliknij opcję Live (Na żywo) w oknie A1 Plus Settings (Ustawienia A1 Plus), aby otworzyć okno podglądu na żywo. Dostosuj pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość na komórkach podczas patrzenia w okno podglądu.
Wyreguluj pokrętło ostrości na mikroskopie, aby wybrać górną część komórki i kliknij przycisk Góra w oknie Akwizycja ND, aby ustawić bieżącą pozycję jako górę. Wyreguluj pokrętło ostrości na mikroskopie, aby wybrać dolną część komórki i kliknij przycisk Dół, aby ustawić bieżącą pozycję jako dolną. Wprowadź jeden mikrometr jako rozmiar kroku.
Wybierz opcję Top Bottom (Góra, dół) dla kierunku z-scan i kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać z-stack. Po zakończeniu akwizycji z-stack użyj pipety, aby delikatnie dodać interesujący odczynnik do komory, nie naruszając komórek. Po 10 minutach zmień nazwę pliku i uzyskaj drugi obraz z-stack.
Po zobrazowaniu utwórz nowe foldery o tych samych nazwach plików, co obrazy spektralne z-stack i otwórz interesujący Cię plik obrazu spektralnego. Kliknij Plik, Importuj/Eksportuj i Eksportuj dokument ND. W wyskakującym okienku wybierz nowo utworzony folder, TIFF jako typ pliku, obraz Mono dla każdego kanału i zachowaj głębię bitową.
Kliknij przycisk eksportuj, aby wyeksportować poszczególne pliki do folderu i otworzyć oprogramowanie do liniowego rozmieszania spektralnego. Otwórz okno Liniowe mieszanie. m i kliknij przycisk Uruchom.
Przeglądaj i wybierz folder zawierający wyeksportowaną sekwencję plików TIFF, a następnie kliknij przycisk OK, aby otworzyć okno długości fali i przekroju z. Skopiuj nazwę pierwszego pliku bez plasterka z i numeru kanału z folderu i wklej go w pierwszym kroku Wprowadź pole nazwy obrazu, wprowadź liczbę kanałów w polu Wprowadź liczbę pasm długości fali oraz liczbę plasterków z w polu Wprowadź liczbę plasterków Z i kliknij przycisk OK. Następnie w wyskakującym okienku przeglądaj i wybierz długość fali. mat i kliknij przycisk Otwórz.
Przeglądaj i wybierz plik Biblioteka. mat w nowym oknie podręcznym i ponownie kliknij przycisk Otwórz, aby rozpocząć wymieszanie plasterka. Aby obliczyć wydajność FRET, otwórz multiFRRCF.
m skrypt programowania i wprowadź liczbę prób eksperymentalnych do przeanalizowania w polu Ile folderów należy ponownie pociąć. Kliknij przycisk OK. Przejdź do wybranych folderów i ponownie kliknij przycisk OK. W nowym oknie podręcznym ustaw współczynnik skalowania na 12,4, próg na 56, częstotliwość X, Y i Z odpowiednio na pięć, pięć i jeden, a algorytm wygładzania na gaussowski
.Następnie kliknij Uruchom, aby wykonać pomiary FRET i ponowne krojenie. Aby odwzorować wydajność FRET na cykliczne poziomy AMP, otwórz Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m i kliknij przycisk Uruchom.
Przejdź do pierwszego obrazu FRET w skali szarości i wybierz go, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie otwórz obrazy cyklicznego wzmacniacza FRET, aby sprawdzić rozkład cyklicznych sygnałów AMP w trzech wymiarach. Na tych obrazach można zaobserwować trójwymiarowe widoki fałszywych kolorowych surowych obrazów hiperspektralnych uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej na początku badania i 10 minut po leczeniu forskoliną. W tej analizie fluorofor akceptorowy został całkowicie fotozniszczony, co pozwoliło na uzyskanie sygnatur spektralnych dawcy i akceptora za pomocą stechiometrii jeden do jednego.
Nietransfekowane komórki znakowane barwnikiem jądrowym wykorzystano do uzyskania czystego spektrum barwnika fluoroforu. Połączenie widm donora, akceptora i fluoroforów barwnika jądrowego pozwala na stworzenie biblioteki trójskładnikowej. W tym miejscu można zaobserwować źródła trzech sygnatur widmowych tła.
Chociaż sygnały te są rozprowadzane nierównomiernie w próbce i nie można ich po prostu odjąć, dodanie sygnatur spektralnych tych sygnałów do biblioteki widmowej i zastosowanie liniowego rozmieszania do rozdzielenia sygnałów zapewnia podejście do usuwania tych zakłócających sygnałów z sygnałów donorowych i akceptorowych przed obliczeniem ich wydajności FRET. Sześcioskładnikowa biblioteka spektralna może być następnie wykorzystana do wykonania liniowego rozmieszania widmowego dla każdego wycinka na obrazie osiowym. W tym przypadku można zaobserwować zmiany w wydajności FRET i cyklicznych poziomach AMP w różnych wycinkach płaszczyzny XY, co pozwala na porównanie warunków wyjściowych i warunków 10 minut po leczeniu forskoliną.
Technika ta może być również wykorzystana do ilościowego określenia skuteczności FRET innych reporterów w trzech wymiarach zarówno w komórkach, jak i tkankach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie odnosi się do problemów związanych z pomiarem sygnałów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych przy użyciu sensorów opartych na transferze energii rezonansowej Fӧrstera (FRET). Przedstawia ono nowatorską metodologię obrazowania hiperspektralnego FRET, która umożliwia wizualizację i pomiar rozkładu cAMP w obrębie pojedynczych komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Sygnalizacja cyklicznym AMP
- Technologia obrazowania FRET
- Dynamika komórkowa w trzech wymiarach
Wstęp
- Niski stosunek sygnału do szumu (SNR) w tradycyjnych czujnikach FRET
- Znaczenie trójwymiarowych pomiarów cAMP
- Zastosowania w komórkowych szlakach sygnalizacyjnych
Zastosowane metody
- Obrazowanie hiperspektralne do analizy FRET
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania
- Techniki liniowego rozdzielania widm
Główne wyniki
- Skuteczny pomiar rozkładu cAMP w trzech wymiarach
- Wizualizacja odpowiedzi komórkowych na traktowanie forskoliną
- Wykazana użyteczność liniowego rozdzielania sygnałów (linear unmixing) w separacji sygnałów
Wnioski
- Niniejsza metodologia stanowi solidne ramy dla badania dynamiki cAMP z wysoką rozdzielczością.
- Usprawnia ona zrozumienie szlaków sygnalizacyjnych w biologii komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładne mapowanie przestrzenne dynamiki drugich posłańców jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w szlakach GPCR i cyklazy adenylowej. To hiperspektralne podejście FRET umożliwia trójwymiarową rozdzielczość sygnałów cAMP, redukując niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad kompartymentacją subkomórkową. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych fazach odkrywania leków poprzez powiązanie przestrzennych wzorców cAMP z funkcjonalnymi odpowiedziami komórkowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez obrazowanie kompartmentacji cAMP w trzech wymiarach przestrzennych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celu poprzez wizualizację specyficznych dla danej ścieżki wzorców sygnalizacji w żywych komórkach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez korelację przestrzennego rozkładu cAMP z efektami fenotypowymi po perturbacji farmakologicznej.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe, rozdzielcze przestrzennie odczyty wydajności FRET, odpowiednie dla formatów wysokoprzepustowych badań wysokotreściowych (high-content screening).
- Powtarzalność: Wykorzystuje liniowe rozdzielanie widm (spectral unmixing) w celu zminimalizowania autofluorescencji i przesłuchów spektralnych, co zwiększa niezawodność sygnału w powtórzeniach.
- Skalowalność: Kompatybilne z adaptacją do płytek wielodołkowych w celu badania wpływu związków na subkomórkową dynamikę cAMP.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Metoda ma zastosowanie do komórek śródbłonka mikrokrążenia płucnego, wspierając badania translacyjne w zakresie szlaków sygnalizacji naczyniowej.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane zmiany cAMP wynikają z rzeczywistej modulacji szlaku, czy są artefaktami obrazowania spowodowanymi nakładaniem się widm.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia długoterminowe śledzenie dynamiki cAMP od etapu odkrycia po funkcjonalną walidację w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po optymalizację związków wiodących – zapewniając ilościowe odczyty aktywności drugich posłańców z rozdzielczością przestrzenną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez mapowanie dynamiki cAMP w odpowiedzi na agoniści GPCR lub modulatory cyklazy adenylowej.
- Przesiewy: Dostarcza gotowe do analizy trójwymiarowe dane cAMP z ograniczoną liczbą wyników fałszywie dodatnich wynikających z interferencji widmowej.
- Analityka: Generuje mapy wydajności FRET i stężenia cAMP, które umożliwiają porównanie różnych warunków traktowania oraz perturbacji genetycznych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi dzięki zastosowaniu w pierwotnych komórkach śródbłonka oraz możliwości adaptacji do modeli chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną bazę możliwości obrazowania do badania sygnalizacji przestrzennej w wielu systemach drugich posłańców.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w sygnalizacji cAMP poprzez rozstrzygnięcie rozkładów osiowych i bocznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiary FRET dzięki rozdzielaniu sygnałów (unmixing) w oparciu o bibliotekę widm oraz powtarzalne parametry akwizycji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez dostarczenie danych o angażowaniu celu w kontekście przestrzennym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wierność sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obrazowania hiperspektralnego, rozplatania widmowego (spectral unmixing) oraz walidacji biosensorów FRET.
- Metoda jest zależna od użycia mikroskopii konfokalnej z detektorem widmowym i możliwości detekcji 32 kanałów.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie generowania bibliotek widmowych oraz parametrów rozplatania.
- Adaptacja do innych typów komórek może wymagać optymalizacji gęstości znakowania oraz parametrów stosu z (z-stack).
- Ograniczenia praktyczne obejmują ryzyko fotobielenia podczas rozszerzonej akwizycji stosów z oraz wymagania obliczeniowe związane z przetwarzaniem widmowym.
