Name: Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę hiperspektralnego obrazowania FRET do pomiaru trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnałów cyklicznego AMP z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute and van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Holandia) za dostarczenie nam biosensora H188 cAMP FRET oraz Kenny'emu Trinhowi (College of Engineering, University of South Alabama) za pomoc techniczną w skróceniu czasu potrzebnego na uruchomienie naszych niestandardowych skryptów programistycznych.
Autorzy pragną podziękować za źródła finansowania: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

<ol><li>Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate+and+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-dependent+protein+kinase+in+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue.</a> The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).</li>
<li>Terrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE1+stimulation+of+HEK293+cells+generates+multiple+contiguous+domains+with+different+%5BcAMP%5D%3A+role+of+compartmentalized+phosphodiesterases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases.</a> The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+dynamics+of+cAMP+and+protein+kinase+A+subunits+in+Aplysia+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons.</a> Science. 260, 222-226 (1993).</li>
<li>Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+aspects+of+cAMP+signalling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).</li>
<li>Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+compartmentation+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cyclic+Nucleotide+Research%22%5BJournal%5D)">Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart.</a> Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).</li>
<li>Hohl, C. M., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+cAMP+in+adult+canine+ventricular+myocytes.+Relation+to+single-cell+free+Ca2%2B+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients.</a> Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).</li>
<li>Rich, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+extracellular+stimulus+triggers+distinct+cAMP+signals+in+different+compartments+of+a+simple+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).</li>
<li>Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+adenylyl+cyclase+reveals+the+significance+of+cAMP+compartmentation+on+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier.</a> Circulation Research. 98, 675-681 (2006).</li>
<li>Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+local+phosphodiesterase+activity+using+tailored+cyclic+nucleotide-gated+channels+as+cAMP+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors.</a> The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).</li>
<li>Blackman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+and+PDE4B+function+in+distinct+subcellular+compartments+in+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).</li>
<li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95, 196-203 (2004).</li>
<li>Klarenbeek, J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP+with+an+EPAC-based+FRET+sensor+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).</li>
<li>Surdo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+biosensor+uncovers+cAMP+nano-domains+at+%CE%B2-adrenergic+targets+that+dictate+precise+tuning+of+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility.</a> Nature Communications. 8, 15031(2017).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fanciful+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Fanciful FRET.</a> Science's STKE. 2006, (2006).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+History+of+FRET%3A+From+conception+through+the+labors+of+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">The History of FRET: From conception through the labors of birth.</a> Reviews in Fluorescence. 3, (2006).</li>
<li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li>
<li>Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+by+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).</li>
<li>Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclases+and+the+interaction+between+calcium+and+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling.</a> Nature. 374, 421-424 (1995).</li>
<li>Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+gene+expression+to+cAMP+signalling%3A+role+of+CREB+and+CREM%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).</li>
<li>Rebhun, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotides%2C+calcium%2C+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotides, calcium, and cell division.</a> International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).</li>
<li>Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourth-generation+Epac-based+FRET+sensors+for+cAMP+feature+exceptional+brightness%2C+photostability+and+dynamic+range%3A+characterization+of+dedicated+sensors+for+FLIM%2C+for+ratiometry+and+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity.</a> PLOS ONE. 10, 0122513(2015).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET%3A+signals+hidden+within+the+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">FRET: signals hidden within the noise.</a> Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).</li>
<li>Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+decipher+the+information+content+contained+within+cyclic+nucleotide+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals.</a> The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).</li>
<li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+of+FRET-based+sensors+reveals+sustained+cAMP+gradients+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions.</a> Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).</li>
<li>Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+FRET+using+spectral+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Assessing FRET using spectral techniques.</a> Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+limitations+of+FRET+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Overcoming limitations of FRET measurements.</a> Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).</li>
<li>Fink, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Earcths+Resources+from+Space%5BTitle%5D)+AND+%22Technology+Review%22%5BJournal%5D)">Monitoring Earcths Resources from Space.</a> Technology Review. 75, 32-41 (1973).</li>
<li>Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Spectrometry+for+Earth+Remote+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing.</a> Science. 228, 1147-1153 (1985).</li>
<li>Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-FLIM+applications+in+plant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">FRET-FLIM applications in plant systems.</a> Protoplasma. 251, 383-394 (2014).</li>
<li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+FRET+Efficiency+using+Excitation-Scanning+Hyperspectral+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging.</a> Biophysical Journal. 112, 586(2017).</li>
<li>Favreau, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-scanning+hyperspectral+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope.</a> Journal of Biomedical Optics. 19, 046010(2014).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).</li>
<li>Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+multiphoton+spectral+imaging+and+its+use+for+measuring+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer.</a> Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).</li>
<li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).</li>
<li>Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signaling+compartmentation%3A+Adenylyl+cyclases+as+anchors+of+dynamic+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes.</a> Mol Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+measurement+using+emission-spectral+unmixing+with+independent+excitation+crosstalk+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction.</a> Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).</li>
<li>Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IIem-spFRET%3A+improved+Iem-spFRET+method+for+robust+FRET+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).</li>
<li>Levy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRET%3A+highly+sensitive+and+reliable+spectral+measurement+of+absolute+FRET+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).</li>
<li>West, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+Measurements+Allow+Separation+of+FRET+Signals+from+Non-Uniform+Background+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence.</a> Biophysical Journal. 112, 453(2017).</li>
<li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+characterizing+and+comparing+hyperspectral+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems.</a> Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).</li>
</ol>

Doktorzy Leavesley i Rich ujawniają udziały finansowe w start-upie SpectraCyte, LLC, który został utworzony w celu komercjalizacji technologii obrazowania spektralnego. Jednak wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu dostępnych na rynku produktów niezwiązanych ze SpectraCyte, LLC.

Rozwój bioczujników FRET umożliwił pomiar i wizualizację cyklicznych sygnałów nukleotydowych w pojedynczych komórkach i jest bardzo obiecujący w wizualizacji subkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych 13,22,37,38. Jednak zastosowanie bioczujników FRET ma kilka ograniczeń, w tym niską charakterystykę sygnału do szumu wielu reporterów FRET opartych na białkach fluorescencyjnych oraz słabą wydajność ...

Cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP) jest drugim przekaźnikiem zaangażowanym w kluczowe procesy komórkowe i fizjologiczne, w tym podział komórek, napływ wapnia, transkrypcję genów i transdukcję sygnału. Coraz więcej dowodów sugeruje istnienie przedziałów cAMP w komórce, dzięki którym osiągana jest specyficzność sygnalizacji1,2,3,4,5,6,7. Do niedawna podział na przedziały cAMP był wnioskowany na podstawie różnych efektów fizjologicznych lub komórkowych indukowanych przez różnych agonistów receptora sprzężonego z G8,9,10,11. Niedawno sondy do obrazowania fluorescencyjnego oparte na FRET dostarczyły nowych podejść do bezpośredniego pomiaru i obserwacji sygnałów cAMP w komórce12,13,14.
Rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) to zjawisko fizyczne, w którym transfer energii zachodzi między cząsteczkami donorowymi i akceptorowymi w sposób nieradiacyjny, gdy cząsteczki znajdują się w bliskiej odległości15,16. Wraz z rozwojem wskaźników fluorescencyjnych opartych na FRET, to zjawisko fizyczne zostało wykorzystane w zastosowaniach biologicznych do badania interakcji białko-białko17, kolokalizacja białek18, sygnalizacja Ca+219, ekspresja genów20, podział komórek21 i cykliczna sygnalizacja nukleotydowa. Wskaźniki cAMP oparte na FRET zazwyczaj składają się z domeny wiążącej cAMP, fluoroforu donorowego i akceptora fluoroforu22. Na przykład czujnik cAMP H188 12,22 używany w tej metodologii składa się z domeny wiążącej cAMP uzyskanej z Epac, umieszczonej pomiędzy fluoroforami turkusowymi (donorowymi) i Venus (akceptorowymi). W warunkach podstawowych (niezwiązanych) turkus i Wenus są w takiej orientacji, że między fluoroforami występuje FRET. Po związaniu cAMP z domeną wiążącą zachodzi zmiana konformacyjna, w wyniku której turkus i Wenus oddalają się od siebie, co powoduje spadek FRET.
Metody obrazowania oparte na FRET oferują obiecujące narzędzie do badania i wizualizacji sygnałów cAMP w komórce. Jednak obecne techniki obrazowania mikroskopowego oparte na FRET są często tylko częściowo skuteczne w osiąganiu wystarczającej siły sygnału do pomiaru FRET z subkomórkową przejrzystością przestrzenną. Wynika to z kilku czynników, w tym ograniczonej siły sygnału wielu reporterów FRET, wysokiego poziomu precyzji wymaganego do dokładnego ilościowego określenia zmian wydajności FRET oraz obecności czynników zakłócających, takich jak autofluorescencja komórkowa23,24. Rezultatem jest często obraz FRET, który jest nękany przez słaby SNR, co bardzo utrudnia wizualizację zmian subkomórkowych w FRET. Ponadto, badania przestrzennie zlokalizowanych sygnałów cAMP były prowadzone prawie wyłącznie w dwóch wymiarach przestrzennych, a osiowy rozkład cAMP był rzadko brany pod uwagę25. Jest to prawdopodobne, ponieważ niski SNR utrudniał pomiar i wizualizację gradientów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z używaniem czujników FRET o niskim SNR, wdrożyliśmy metody obrazowania i analizy hiperspektralnej do pomiaru FRET w pojedynczych komórkach25,26,27.
Metody obrazowania hiperspektralnego zostały opracowane przez NASA w celu rozróżnienia obiektów naziemnych obecnych na zdjęciach satelitarnych28,29. Od tego czasu techniki te zostały przetłumaczone na pole mikroskopii fluorescencyjnej30, z kilkoma komercyjnymi systemami mikroskopów konfokalnych oferującymi detektory spektralne. W tradycyjnym (niespektralnym) obrazowaniu fluorescencyjnym próbka jest wzbudzana za pomocą filtra pasmowo-przepustowego lub linii laserowej, a emisja jest zbierana za pomocą drugiego filtra pasmowo-przepustowego, często dobieranego tak, aby pasował do szczytowej długości fali emisji fluoroforu (fluoroforów). Z kolei podejścia do obrazowania hiperspektralnego mają na celu pobranie pełnego profilu spektralnego emisji fluorescencji26,31,32 lub excitation33,34 w określonych odstępach długości fali. W naszych poprzednich badaniach wykazaliśmy, że metody obrazowania i analizy hiperspektralnej mogą oferować lepszą kwantyfikację sygnałów FRET w komórkach w porównaniu z tradycyjnymi technikami obrazowania FRET opartymi na filtrach26. W tym miejscu przedstawiamy metodologię wykonywania 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET w celu pomiaru i wizualizacji rozkładów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych. Podejścia te umożliwiły wizualizację gradientów przestrzennych cAMP indukowanych przez agonistów w pojedynczych komórkach25. Co ciekawe, w zależności od agonisty, gradienty cAMP mogą być widoczne w komórkach. Przedstawiona tutaj metodologia wykorzystuje spektralne mieszanie niejednorodnego tła i autofluorescencji komórkowej w celu poprawy dokładności pomiarów FRET. Chociaż metodologia ta została zademonstrowana na komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc (PMVEC) przy użyciu biosensora cAMP FRET, metodologię tę można łatwo zmodyfikować do użytku z alternatywnymi reporterami FRET lub alternatywnymi liniami komórkowymi.

<table><tbody><tr><td>Komora komórkowa Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td>Attofluor zawiera stalowe komory ogniw oraz gumowy O-ring. Komora komórkowa utrzymuje szkiełko nakrywkowe, a O-ring zapewnia mechanizm blokujący do utrzymywania buforu w komorze komórkowej bez wycieku</td></tr><tr><td>Siarcotlenek dimetylu (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Rozpuszczalnik używany do przygotowania roztworu podstawowego dla skoliny.</td></tr><tr><td>DRAQ5 Roztwór sondy fluoroscencyjnej</td><td>Thermo Scientific</td><td>62252</td><td>Etykieta jądrowa</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Zawiera składniki odżywcze i czynniki wzrostu, dzięki którym komórki mogą rosnąć i dzielić się w naczyniach hodowlanych.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F6178</td><td>Suplement czynnika wzrostu, który jest dodawany do pożywki hodowlanej, DMEM</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td>Aktywator cyklazy Adenyly.</td></tr><tr><td>H188 Cykliczny bioczujnik AMP FRET</td><td>Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink</td><td>Prezent</td><td>Plazmid kodujący turkus (fluorofor donorowy), Venus (fluorofor akceptorowy) i domenę wiążącą uzyskaną z Epac.</td></tr><tr><td>Image J</td><td>image.net</td><td>Do pobrania za darmo</td><td>Kolejna platforma przetwarzania obrazu służąca do ekstrakcji informacji spektralnych i przetwarzania obrazu.</td></tr><tr><td>Integracja Sphere</td><td>Ocean Optics</td><td>FOIS-1</td><td>Służy do pomiaru intensywności oświetlenia linii laserowej przy różnych natężeniach lasera (?).</td></tr><tr><td>Białko myszy Laminin, naturalny</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Szkiełka nakrywkowe są pokryte lamininą, co pomaga w przyczepianiu komórek, wzroście i ruchliwości komórki.</td></tr><tr><td>Zestaw do transfekcji Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>Odczynnik do transfekcji stosowany do transfekcji komórek za pomocą biosensora H188 FRET</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2019a</td><td>Operacje przetwarzania obrazu (liniowe rozmieszanie i obliczenia wydajności FRET) są wykonywane poprzez pisanie niestandardowych programów w środowisku programistycznym MATLAB</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Nikon A1R</td><td>Instrumenty Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Akwizycja obrazu spektralnego odbywa się za pomocą mikroskopu konfokalnego.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nikon Elements</td><td>Klucz sprzętowy oprogramowania</td><td>Nikon Instruments</td><td>służący do eksportowania i obsługi plików obrazów nd2 (wielowymiarowych plików obrazów), które są pozyskiwane za pomocą lampy kalibracyjnej Nikon A1R</td></tr><tr><td>NIST-Traceable</td> Ocean <td>Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>Lampa o znanym widmie do użytku jako standard</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>coomonly używany bufor do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (PMVEC)</td><td>W domu - rdzeń hodowli komórkowej, Uniwersytet Południowej Alabamy</td><td>Wyizolowane z mikrokrążenia płucnego szczura</td><td>PMVEC tworzą wewnętrzną wyściółkę naczynia krwionośnego.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td>Antybiotyki <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>są dodawane do culture medum, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek.</td></tr><tr><td>Wstępnie oczyszczone mikroszkiełka Gold Seal</td><td>Clay Adams</td><td>3010</td><td>Szkiełka mikroskopowe używane do mocowania komórek</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mounting Media</td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>Jeśli próbki są utrwalane za pomocą mocowania zapobiegającego blaknięciu, to ten ostatni chroni barwniki fluorescencyjne i chromofory przed blaknięciem.</td></tr><tr><td>Spektrometr</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65000</td><td>Służy do pomiaru odpowiedzi spektralnej źródła światła (?)</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trawi wiązanie białko-białko między komórką a macierzą komórkową i pomaga w dyscypacji i podnoszeniu komórek podczas powlekania komórek.</td></tr><tr><td>Bufor Tyrodes</td><td>Wykonany we własnym</td><td></td><td>zakresie Bufor Tyrodes służy do wytwarzania roztworów roboczych i utrzymywania komórek w roztworze wodnym podczas akwizycji obrazu.</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Szkiełka nakrywkowe pokryte laminą umieszcza się w 6-dołkowym naczyniu hodowlanym (jedna pokrywa / studzienka). Komórki wraz z pożywką dodaje się do każdej studzienki.</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe mikroskopu 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td>Komórki hodowano na okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych</td></tr><tr><td>60X Ojective</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>zanurzenie w wodzie i powszechnie stosowany obiektyw do komórek</td></tr></tbody></table>

pomiar trójwymiarowych rozkładów camp w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy fret

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and &lambda;) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

Cykliczny AMP to drugi komunikator, który bierze udział w szerokim zakresie aktywności komórkowych i fizjologicznych. Kilka badań sugeruje, że sygnały cAMP są podzielone na przedziały, a podział na przedziały przyczynia się do specyficzności sygnalizacyjnej w szlaku sygnałowym cAMP. Opracowanie biosensorów opartych na rezonansowym transferze energii (FRET) Fӧrster zwiększyło możliwości pomiaru i wizualizacji sygnałów cAMP w komórkach. Jednak pomiary te są często ograniczone do dwóch wymiarów przestrzennych, co może skutkować błędną interpretacją danych. Do tej pory pomiary sygnałów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych (x, y i z) były bardzo ograniczone ze względu na ograniczenia techniczne w stosowaniu czujników FRET, które z natury wykazują niski stosunek sygnału do szumu (SNR). Ponadto tradycyjne podejścia do obrazowania oparte na filtrach są często nieskuteczne w dokładnym pomiarze sygnałów cAMP w zlokalizowanych regionach subkomórkowych ze względu na szereg czynników, w tym przesłuchy spektralne, ograniczoną siłę sygnału i autofluorescencję. Aby przezwyciężyć te ograniczenia i umożliwić stosowanie bioczujników opartych na FRET z wieloma fluoroforami, opracowaliśmy podejścia do obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, które zapewniają swoistość spektralną do obliczania wydajności FRET i możliwość spektralnego oddzielania sygnałów FRET od zakłócającej autofluorescencji i / lub sygnałów z dodatkowych znaczników fluorescencyjnych. W tym miejscu przedstawiono metodologię realizacji obrazowania hiperspektralnego FRET, a także konieczność skonstruowania odpowiedniej biblioteki spektralnej, która nie jest ani niedostatecznie próbkowana, ani nadmiernie próbkowana w celu przeprowadzenia demiksowania spektralnego. Chociaż przedstawiamy tę metodologię pomiaru trójwymiarowych rozkładów cAMP w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc (PMVEC), metodologia ta może być wykorzystana do badania rozkładów przestrzennych cAMP w różnych typach komórek.

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie obrazowania hiperspektralnego FRET oraz metod analizy w celu pomiaru gradientów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych w żywych komórkach. Wygenerowanie tych wyników wiąże się z kilkoma kluczowymi etapami, które wymagają szczególnej uwagi podczas analizy i kwantyfikacji danych. Do kluczowych kroków należą: stworzenie odpowiedniej biblioteki spektralnej, odejmowanie tła metodą unmixingu spektralnego, progowanie w celu identyfikacji granic komórek oraz obliczenia wydajności FRET. <st...

Ze względu na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) czujników opartych na transferze energii rezonansu (FRET) Fӧrster, pomiar sygnałów cAMP był wyzwaniem, zwłaszcza w trzech wymiarach przestrzennych. W tym miejscu opisujemy metodologię obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, która umożliwia pomiar rozkładu cAMP w trzech wymiarach przestrzennych.

Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET

Cyclic AMP is a second messenger that is involved in a wide range of cellular and physiological activities. Several studies suggest that cAMP signals are ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia metodę pomiaru i wizualizacji sygnałów FRET lub cyklicznych sygnałów AMP w trzech wymiarach przestrzennych w poszczególnych komórkach. Cykliczne rozkłady AMP mogą występować nie tylko osiowo, ale także bocznie, dlatego ważne jest, aby pozyskać dane obrazu cyklicznego AMP FRET w trzech wymiarach, aby próbkować te rozkłady. W dniu obrazowania ciepłe tyrody buforują się do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej i umieszczają szkiełko nakrywkowe osadzone z transfekowanymi komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania w komorze komórkowej.Zabezpiecz górną część komory uszczelką montażową, aby zapobiec wyciekom i użyj delikatnej wycieraczki, aby usunąć nadmiar podłoża lub przylegających komórek z dna szkiełka nakrywkowego. Dodaj 800 mikrolitrów buforu roboczego i cztery mikrolitry pięciomilimolowej etykiety jądrowej do komory ogniwa i delikatnie kołysz komorą przez pięć do 10 sekund. Następnie przykryj komorę komórkową folią aluminiową na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Aby zobrazować komórki, wybierz obiektyw 60X zanurzony w wodzie w mikroskopie konfokalnym wyposażonym w detektor spektralny i dodaj kroplę wody do obiektywu. Umieść załadowaną komorę komórkową na mikroskopie stage i dostrój pokrętło filtra, aby wybrać odpowiedni zestaw filtrów. Wybierz tryb szerokokątnego pola fluorescencji i za pomocą okularów wybierz pole view zawierające komórki wyrażające cykliczny czujnik AMP FRET.Otwórz oprogramowanie do obrazowania, wybierz tryb konfokalny i odblokuj przycisk blokady laserowej. Otwórz menu ustawień A1. Zaznacz pola odpowiadające liniom laserowym 405 i 561 nanometrów i ustaw te detekcje spektralne na SD, rozdzielczość na 10, a kanały na 32.Wybierz początkową i końcową wartość długości fali, aby ustawić zakres długości fali. Otwórz menu Ustawienia A1, aby wybrać ikonę pomijania kategoryzacji. Zaznacz pole numer 15 i kliknij przycisk OK. Ustaw intensywność lasera na osiem procent dla lasera 405 nanometrów i na dwa procent dla lasera 561 nanometrów.Ustaw wzmocnienie detektora na 149, a promień otworka na 2,4 jednostki dysku Airy. Ustaw szybkość skanowania na 25 klatek widmowych na sekundę i wybierz jednokierunkowy kierunek skanowania. Ustaw liczbę na cztery, a rozmiar skanowania na 1024 na 1024.Aby zdefiniować parametry akwizycji stosu z, kliknij opcje Widok, Kontrola nabycia i Akwizycja ND, a następnie wprowadź miejsce docelowe i nazwę pliku w oknie podręcznym, aby zapisać plik ND. Kliknij pole Z-series, a następnie kliknij opcję Live (Na żywo) w oknie A1 Plus Settings (Ustawienia A1 Plus), aby otworzyć okno podglądu na żywo. Dostosuj pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość na komórkach podczas patrzenia w okno podglądu.Wyreguluj pokrętło ostrości na mikroskopie, aby wybrać górną część komórki i kliknij przycisk Góra w oknie Akwizycja ND, aby ustawić bieżącą pozycję jako górę. Wyreguluj pokrętło ostrości na mikroskopie, aby wybrać dolną część komórki i kliknij przycisk Dół, aby ustawić bieżącą pozycję jako dolną. Wprowadź jeden mikrometr jako rozmiar kroku.Wybierz opcję Top Bottom (Góra, dół) dla kierunku z-scan i kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać z-stack. Po zakończeniu akwizycji z-stack użyj pipety, aby delikatnie dodać interesujący odczynnik do komory, nie naruszając komórek. Po 10 minutach zmień nazwę pliku i uzyskaj drugi obraz z-stack.Po zobrazowaniu utwórz nowe foldery o tych samych nazwach plików, co obrazy spektralne z-stack i otwórz interesujący Cię plik obrazu spektralnego. Kliknij Plik, Importuj/Eksportuj i Eksportuj dokument ND. W wyskakującym okienku wybierz nowo utworzony folder, TIFF jako typ pliku, obraz Mono dla każdego kanału i zachowaj głębię bitową.Kliknij przycisk eksportuj, aby wyeksportować poszczególne pliki do folderu i otworzyć oprogramowanie do liniowego rozmieszania spektralnego. Otwórz okno Liniowe mieszanie. m i kliknij przycisk Uruchom.Przeglądaj i wybierz folder zawierający wyeksportowaną sekwencję plików TIFF, a następnie kliknij przycisk OK, aby otworzyć okno długości fali i przekroju z. Skopiuj nazwę pierwszego pliku bez plasterka z i numeru kanału z folderu i wklej go w pierwszym kroku Wprowadź pole nazwy obrazu, wprowadź liczbę kanałów w polu Wprowadź liczbę pasm długości fali oraz liczbę plasterków z w polu Wprowadź liczbę plasterków Z i kliknij przycisk OK. Następnie w wyskakującym okienku przeglądaj i wybierz długość fali. mat i kliknij przycisk Otwórz.Przeglądaj i wybierz plik Biblioteka. mat w nowym oknie podręcznym i ponownie kliknij przycisk Otwórz, aby rozpocząć wymieszanie plasterka. Aby obliczyć wydajność FRET, otwórz multiFRRCF.m skrypt programowania i wprowadź liczbę prób eksperymentalnych do przeanalizowania w polu Ile folderów należy ponownie pociąć. Kliknij przycisk OK. Przejdź do wybranych folderów i ponownie kliknij przycisk OK. W nowym oknie podręcznym ustaw współczynnik skalowania na 12,4, próg na 56, częstotliwość X, Y i Z odpowiednio na pięć, pięć i jeden, a algorytm wygładzania na gaussowski.Następnie kliknij Uruchom, aby wykonać pomiary FRET i ponowne krojenie. Aby odwzorować wydajność FRET na cykliczne poziomy AMP, otwórz Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m i kliknij przycisk Uruchom.Przejdź do pierwszego obrazu FRET w skali szarości i wybierz go, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie otwórz obrazy cyklicznego wzmacniacza FRET, aby sprawdzić rozkład cyklicznych sygnałów AMP w trzech wymiarach. Na tych obrazach można zaobserwować trójwymiarowe widoki fałszywych kolorowych surowych obrazów hiperspektralnych uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej na początku badania i 10 minut po leczeniu forskoliną. W tej analizie fluorofor akceptorowy został całkowicie fotozniszczony, co pozwoliło na uzyskanie sygnatur spektralnych dawcy i akceptora za pomocą stechiometrii jeden do jednego.Nietransfekowane komórki znakowane barwnikiem jądrowym wykorzystano do uzyskania czystego spektrum barwnika fluoroforu. Połączenie widm donora, akceptora i fluoroforów barwnika jądrowego pozwala na stworzenie biblioteki trójskładnikowej. W tym miejscu można zaobserwować źródła trzech sygnatur widmowych tła.Chociaż sygnały te są rozprowadzane nierównomiernie w próbce i nie można ich po prostu odjąć, dodanie sygnatur spektralnych tych sygnałów do biblioteki widmowej i zastosowanie liniowego rozmieszania do rozdzielenia sygnałów zapewnia podejście do usuwania tych zakłócających sygnałów z sygnałów donorowych i akceptorowych przed obliczeniem ich wydajności FRET. Sześcioskładnikowa biblioteka spektralna może być następnie wykorzystana do wykonania liniowego rozmieszania widmowego dla każdego wycinka na obrazie osiowym. W tym przypadku można zaobserwować zmiany w wydajności FRET i cyklicznych poziomach AMP w różnych wycinkach płaszczyzny XY, co pozwala na porównanie warunków wyjściowych i warunków 10 minut po leczeniu forskoliną.Technika ta może być również wykorzystana do ilościowego określenia skuteczności FRET innych reporterów w trzech wymiarach zarówno w komórkach, jak i tkankach.

measurement-3-dimensional-camp-distributions-living-cells-using-4

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Opisujemy protokół do bezznacznikowej identyfikacji podtypów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego i algorytmu uczenia maszynowego. Pomiary tomogram 3D indeksu refrakcji limfocytów prezentują informacje morfologiczne i biochemiczne 3D dla poszczególnych komórek, które są następnie analizowane za pomocą algorytmu uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów komórek.

Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

Dokładna analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej wymaga złożonych procesów pracy. Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z oprogramowania Cell-ACDC. Wykorzystuje nowoczesne modele oparte na AI do segmentacji, śledzenia, analizy genetyki komórek oraz ilościowej analizy danych mikroskopowych. Co istotne, uzupełnia te modele innowacyjnym ramowym systemem półautomatycznej korekty wyników modeli.

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

Poznaj metodę hiperspektralnego obrazowania FRET do pomiaru trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnałów cyklicznego AMP z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET

Przeglądaj więcej filmów