Name: Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę produkcji cząstek wirusowych pszczół miodnych Apis mellifera do badań przesiewowych. Protokół wykorzystuje łatwe w hodowli poczwary zamiast kultur komórkowych, umożliwiając szybkie testowanie zakaźności wirusów i ich wpływu na zdrowie pszczół.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Julii Fine za jej pomysły i dyskusję podczas procesu tworzenia protokołu, a także dr Cassondrze Vernier za jej pomocne komentarze podczas edycji. Materiały te zostały wykorzystane w projektach, które były częściowo wspierane przez Fundację Badań nad Wyżywieniem i Rolnictwem w ramach grantu ID 549025.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiliśmy metody szczegółowo opisujące każdy etap procesu amplifikacji wirusa i przygotowania inokulum, w tym pobieranie larw i rozmnażanie wirusa, ekstrakcję i koncentrację, a także leczenie wirusów w formie eksperymentów z karmieniem w klatkach. Metody te pozwalają na wytwarzanie półczystych cząstek wirusa (ryc. 4), których skuteczność można konsekwentnie określić ilościowo za pomocą testów śmiertelności dawka-odpowiedź dla wirusów, które są śmiertelne dla dorosłych (<s...

Pszczoły miodne (Apis mellifera) odgrywają kluczową rolę we współczesnym globalnym krajobrazie rolniczym, ale obecnie cierpią z powodu kombinacji stresorów biotycznych i abiotycznych, w tym ekspozycji na pestycydy, niskiej jakości paszy, pasożytów i patogenów1,2. Jednym z najważniejszych patogenów budzących obawy są wirusy, z których wiele jest przenoszonych przez inny z głównych czynników stresogennych pszczół miodnych, pasożytniczy roztocz Varroa (Varroa destructor). Wirusy te mogą powodować szereg negatywnych skutków u pszczół miodnych, w tym zmniejszoną przeżywalność czerwiu, wady rozwojowe i paraliż, które mogą prowadzić do całkowitego zawalenia się ula zarówno przed, jak i po okresie zimowania3,4,5. Chociaż nastąpił obiecujący postęp w rozwoju technologii wykorzystywanych do zwalczania infekcji wirusowych6,7,8,9, dynamika, dzięki której wiele wirusów rozprzestrzenia się, rozprzestrzenia i oddziałuje w obrębie pszczoły miodnej lub kolonii, jest nadal słabo poznana5,10. Zrozumienie podstawowej biologii interakcji pszczół miodnych i wirusów oraz ich związków z innymi czynnikami środowiskowymi ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych technik zarządzania wirusami.
Jednak badanie interakcji między pszczołą miodną a wirusem stanowi wyzwanie z wieloma znanymi i nieznanymi czynnikami, które komplikują ten proces. Obejmują one interakcje z diet11,12, pestycydami exposure13 i tłem genetycznym pszczół14,15. Nawet jeśli skupiamy się wyłącznie na infekcji wirusowej, powikłania są powszechne, ponieważ populacje pszczół miodnych, zarówno kontrolowane, jak i dzikie, zawsze mają pewien stopień infekcji wirusem w tle, choć często bez objawów ostrych16,17, a skutki koinfekcji wirusem nie są dobrze poznane18. To sprawiło, że badania nad wpływem wirusa pszczół miodnych są trudne do rozwikłania.
Wiele badań nad wirusem pszczół miodnych wykorzystywało poszlakowe infekcje wirusowe do szukania interakcji z innymi czynnikami stresogennymi, obserwując, jak infekcje tła zmieniają się wraz z innymi metodami leczenia12,19,20,21. Chociaż podejście to odniosło sukces w identyfikacji ważnych efektów, zwłaszcza w odkrywaniu, w jaki sposób pestycydy lub zabiegi dietetyczne wpływają na poziom i replikację wirusa, inokulacja wirusem o znanej zawartości i stężeniu ma kluczowe znaczenie dla eksperymentalnego testowania dynamiki infekcji wirusowych. Mimo to oddzielenie leczenia eksperymentalnego od infekcji tła może również stanowić wyzwanie. W badaniach terenowych naukowcy zróżnicowali szczepy wirusa zdeformowanych skrzydeł (DWV), aby dostarczyć dowodów na przenoszenie wirusa z pszczół miodnych na trzmiele22, ale zastosowanie tego podejścia byłoby trudne w przypadku samych pszczół miodnych. Zakaźne klony wirusów są potężnym narzędziem, nie tylko do śledzenia infekcji23,24,25, ale także do badań genetyki odwrotnej wirusów pszczoły miodnej oraz do badań interakcji wirus-gospodarz26,27,28. Jednak w większości przypadków zakaźne klony są nadal wymagane do wypełnienia cyklu infekcji wewnątrz komórek w celu wytworzenia cząstek. Takie cząstki są preferowane jako inokulatory do eksperymentalnych terapii, ponieważ ich zakaźność jest wyższa niż nagiego wirusowego RNA, a inokulacja zamkniętymi genomami naśladuje naturalną infekcję.
Produkcja czystej, nieskażonej inokulacji wirusa pszczoły miodnej (szczepy wirusa dzikiego typu lub pochodzące z zakaźnych klonów) również stanowi wyzwanie. Wynika to przede wszystkim z trudności w uzyskaniu niezawodnej, stale replikującej, wolnej od wirusów linii komórkowej pszczoły miodnej w celu produkcji czystych wirusów 29,30. Chociaż wyprodukowano już pewne linie komórkowe, systemy te pozostają niedoskonałe; Mimo to istnieje nadzieja, że uda się wyprodukować realną linię komórkową29, co pozwoliłoby na dokładniejszą kontrolę produkcji i badań nad wirusem. Dopóki taka linia nie stanie się powszechnie dostępna, większość protokołów produkcji wirusów będzie nadal opierać się na produkcji i oczyszczaniu wirusów in vivo18,31,32,33,34. Podejścia te polegają na identyfikacji i oczyszczaniu interesujących nas cząsteczek wirusa (lub produkcji zakaźnego klonu) i wykorzystywaniu ich do infekowania pszczół miodnych, zwykle jako poczwarek. Poczwarkom wstrzykuje się docelowego wirusa, a następnie uśmierca, a dalsze cząstki są ekstrahowane i oczyszczane. Ponieważ jednak żadna pszczoła nie jest wolna od wirusów, zawsze występuje pewien stopień zanieczyszczenia śladami innych wirusów w każdym takim koncentracie, dlatego należy zachować dużą ostrożność przy wyborze pszczół o niskim prawdopodobieństwie infekcji tła. Co więcej, metody usuwania poczwarek z komórek grzebienia do użycia w tych protokołach33 są bardzo pracochłonne i mogą wywoływać stres u pszczół, ograniczając produkcję w ten sposób18,32. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną metodę, która pozwala na usuwanie larw na dużą skalę przy niewielkim nakładzie pracy i mniejszym obciążeniu mechanicznym pszczół.
Po uzyskaniu poczwarek i wstrzyknięciu im początkowego inokulum wirusa, muszą one zostać poddane inkubacji, aby dać wirusowi czas na replikację. Następnie wytworzone cząsteczki wirusa mogą zostać przetworzone na formę nadającą się do zainfekowania eksperymentalnych pszczół. Istnieje kilka prostych metod, aby to osiągnąć, w tym użycie prymitywnego homogenatu35,36 lub hemolimfy generowanej przez wirusowe pszczoły jako źródło infekcji37. Metody te są skuteczne, ale napotykają na większą szansę na wprowadzenie nieznanych zmiennych z podłoża tła (np. innych czynników w homogenatach martwych pszczół). Dodatkowo pożądane jest zagęszczenie cząstek, jeśli eksperyment wymaga podania dużej, znanej dawki wirusa w krótkim czasie. Dlatego, aby uzyskać lepszą kontrolę, lepiej jest stosować metody, które pozwalają na pewien poziom oczyszczenia i koncentracji cząsteczek wirusa. Ogólnie rzecz biorąc, seria etapów wytrącania i wirowania spowoduje usunięcie prawie wszystkich możliwych materiałów wirusowych niebędących docelowymi wirusami33.
Po wyprodukowaniu tego skoncentrowanego inokulum, korzystne jest ilościowe określenie mian wirusa (qPCR) i scharakteryzowanie go za pomocą testów biologicznych in vivo, aby przetestować jego żywotność i zdolność do powodowania śmiertelności, a także potwierdzić, że zwiększone miana wirusa są uzyskiwane po infekcji. Można to osiągnąć poprzez eksperymenty z wstrzykiwaniem (zarówno do poczwarek, jak i osobników dorosłych) lub eksperymenty z karmieniem (do larw lub osobników dorosłych). Chociaż wszystkie te podejścia są możliwe, karmienie grup dorosłych pszczół w klatce jest często najszybsze i najprostsze. Metoda oznaczania klatkowego jest również szeroko stosowana do testowania różnych innych metod leczenia pszczół, w tym toksyczności pestycydów38, rozwoju jajników39 i wpływu odżywiania na zachowanie40,41 i dlatego może stanowić dobrą podstawę do eksperymentów łączących infekcję wirusową z innymi czynnikami42.
Tutaj opisujemy niezawodną metodę produkcji dużych ilości półczystych, wysoko wzbogaconych cząsteczek wirusa bez użycia drogiej ultrawirówki, w tym metodę usuwania poczwarek, która zmniejsza obciążenie pszczół i pracę i mechaniczne oraz wysoce powtarzalny, wysokoprzepustowy test biologiczny do testowania infekcji wirusowych i efektów. Poprzez ścisłą kontrolę czystości inokulacji wirusa, badacze są w stanie zmniejszyć zmienność odpowiedzi wirusa pszczoły miodnej w porównaniu z innymi metodami inokulacji wirusa. Co więcej, test biologiczny może badać skutki wirusowe na poziomie małych grup przy użyciu wysoce powtarzalnych jednostek eksperymentalnych przed skalowaniem do realistycznych warunków w terenie, co jest znacznie bardziej pracochłonne. W połączeniu te dwie metody zapewniają niezbędne narzędzia do badań, które mogą pomóc w lepszym zrozumieniu fizjologicznych interakcji między pszczołą miodną a wirusem pszczoły miodnej.

<table><tbody><tr><td>10% roztwór</td><td></td><td></td><td></td>wybielacza</tr><tr><td>24:1 chloroform: alkohol izoamylowy</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% roztwór</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanolu Klatki do testów</td><td></td><td></td> biologicznych <td>W zależności od konfiguracji eksperymentalnej</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0,1 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Opcjonalnie (jeśli nie jest dostępny aparat do wstrzykiwania)</td></tr><tr><td>Pojemniki do samodzielnego usuwania</td><td></td><td></td> larw <td>Powinny mieć wymiary około 19 "x 9-1/8" (wymiary głębokiej ramy Langstrotha)</td></tr> <tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td>, miękkie kleszcze do separacji larw;, twarde kleszcze do wycinania poczwarek</td></tr><tr><td>Inkubator</td> pod wyciągiem <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Zdolny do utrzymania 34 &ordm;<td></td><td></td><td> C i 50% wilgotności względnej</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Każda chusteczka chłonna będzie działać</td></tr><tr><td>Średniej wielkości łodzie</td><td></td><td></td> wagowe <td>Służą jako tacki na inokulum</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa z membraną Biomax</td><td>MiliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td>nitrylowe</tr><tr><td>Fosforan buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td> stołowa z chłodzeniem <td>Możliwość 15 000 x g</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td> z chłodzeniem <td>Możliwość 21 000 x g</td></tr><tr><td>Multipipeta Repeater M4</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Opcjonalnie (jeśli nie ma wtryskiwacza dostępny)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNAse</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (apis mellifera)

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Pszczoły miodne mają ogromne znaczenie ekologiczne i rolnicze na całym świecie, ale są również poddawane różnorodnym presjom, które negatywnie wpływają na zdrowie pszczół, w tym narażeniu na patogeny wirusowe. Takie wirusy mogą powodować wiele różnych niszczycielskich skutków i często mogą być trudne do zbadania ze względu na wiele czynników, które utrudniają oddzielenie efektów eksperymentalnych terapii od istniejącej wcześniej infekcji tła. W tym miejscu przedstawiamy metodę masowej produkcji dużych ilości cząstek wirusa wraz z wysokoprzepustowym testem biologicznym do testowania infekcji wirusowej i skutków. Ze względu na obecny brak ciągłej, wolnej od wirusów linii komórkowej pszczoły miodnej, cząsteczki wirusa są amplifikowane in vivo przy użyciu poczwarek pszczół miodnych, które są ekstrahowane z ula w dużych ilościach przy użyciu minimalnie stresującej metodologii. Te cząsteczki wirusa mogą być następnie wykorzystane w testach biologicznych klatek pszczół miodnych do testowania żywotności inokulantów, a także różnych innych dynamik infekcji wirusowych, w tym interakcji z odżywianiem, pestycydami i innymi patogenami. Główną zaletą stosowania takich cząstek jest to, że znacznie zmniejsza to szanse na wprowadzenie nieznanych zmiennych w późniejszych eksperymentach w porównaniu z obecnymi alternatywami, takimi jak zakażenie przez zakażoną hemolimfę pszczelą lub homogenat, chociaż nadal należy zachować ostrożność przy pozyskiwaniu pszczół, aby zminimalizować zanieczyszczenie wirusem tła. Testy klatkowe nie zastępują zakrojonych na szeroką skalę, realistycznych eksperymentów testujących skutki infekcji wirusem na poziomie kolonii, ale zamiast tego funkcjonują jako metoda ustalania podstawowych odpowiedzi wirusa, które w połączeniu z półczystymi cząsteczkami wirusa mogą służyć jako ważne narzędzia do badania różnych wymiarów fizjologicznych interakcji wirusa pszczoły miodnej.

Prawidłowe zastosowanie protokołów (Rysunki 1) dotyczących iniekcji poczek oraz ekstrakcji wirusowej powinno pozwolić na uzyskanie dużych ilości cząsteczek wirusa. Jednakże pobieranie próbek i przeprowadzanie iniekcji u poczek pochodzących z różnych kolonii w wielu punktach czasowych maksymalizuje szanse na pozyskanie docelowego wirusa przy niskim poziomie zanieczyszczeń. Dynamika replikacji wirusów i ich wzajemnych interakcji w organizmie pszczoły miodowej nie jest dobrze poznana; w połączeniu z prawdop...

Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Nasz protokół pokazuje, w jaki sposób masowo wytwarzać cząsteczki wirusa pszczół miodnych w celu ich wykorzystania w kontrolowanych, wysokoprzepustowych testach biologicznych w celu szybkiego badania przesiewowego skuteczności leczenia wirusów. W teście wykorzystuje się łatwe do hodowli poczwarki pszczele, a nie hodowlę komórkową, co zmniejsza nakład pracy związany z pozyskiwaniem obiektów eksperymentalnych. Wirus może być następnie wykorzystany do uzyskania przewidywalnych krzywych śmiertelności i powtarzalnych testów biologicznych.Pojawiło się duże zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób tak zwane wirusy pszczół miodnych wpływają na większy zakres żywicieli. Ta technika produkcji wirusa może być połączona z innymi systemami zapylaczy w celu zbadania zakaźności. W celu masowej ekstrakcji pszczół poprzez samodzielne usunięcie larw, należy umieścić królową pszczół miodnych w klatce na pustej, rozciągniętej ramie Langstrotha i zwrócić ją do jej kolonii.Po umożliwieniu królowej złożenia jaj na ramie przez 24 godziny, sprawdź ramkę, aby upewnić się, że większość komórek grzebienia zawiera nowo złożone jaja i uwolnij królową. Dokładnie 192 godziny po umieszczeniu królowej w klatce u

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Niniejszym przedstawiamy metodę karmienia skażoną pestycydami żywnością zarówno pojedynczej pszczoły miodnej, jak i kolonii ula. Procedura ocenia wpływ pestycydów na poszczególne pszczoły miodne poprzez dokarmianie in vivo podstawową dietą larw, a także na naturalny stan rodziny pszczelej.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

Subletalne dawki pestycydów mogą wpływać na kolonie w sposób, który jest trudny do wykrycia przy użyciu tylko metod okresowych lub wizualnych. Podano metody pomiaru całkowitej masy dorosłych pszczół, czerwiu i zasobów pokarmowych poprzez ważenie uli i części ula, fotografowanie ramek i instalowanie czujników. Poruszana jest również kwestia analizy danych.

Monitorowanie wpływu narażenia na subletalne pestycydy na pszczoły miodne na poziomie kolonii

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Poznaj metodę produkcji cząstek wirusowych pszczół miodnych Apis mellifera do badań przesiewowych. Protokół wykorzystuje łatwe w hodowli poczwary zamiast kultur komórkowych, umożliwiając szybkie testowanie zakaźności wirusów i ich wpływu na zdrowie pszczół.

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Przeglądaj więcej filmów