Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)
August 26th, 2020
Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.
Nasz protokół pokazuje, w jaki sposób masowo wytwarzać cząsteczki wirusa pszczół miodnych w celu ich wykorzystania w kontrolowanych, wysokoprzepustowych testach biologicznych w celu szybkiego badania przesiewowego skuteczności leczenia wirusów. W teście wykorzystuje się łatwe do hodowli poczwarki pszczele, a nie hodowlę komórkową, co zmniejsza nakład pracy związany z pozyskiwaniem obiektów eksperymentalnych. Wirus może być następnie wykorzystany do uzyskania przewidywalnych krzywych śmiertelności i powtarzalnych testów biologicznych.
Pojawiło się duże zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób tak zwane wirusy pszczół miodnych wpływają na większy zakres żywicieli. Ta technika produkcji wirusa może być połączona z innymi systemami zapylaczy w celu zbadania zakaźności. W celu masowej ekstrakcji pszczół poprzez samodzielne usunięcie larw, należy umieścić królową pszczół miodnych w klatce na pustej, rozciągniętej ramie Langstrotha i zwrócić ją do jej kolonii.
Po umożliwieniu królowej złożenia jaj na ramie przez 24 godziny, sprawdź ramkę, aby upewnić się, że większość komórek grzebienia zawiera nowo złożone jaja i uwolnij królową. Dokładnie 192 godziny po umieszczeniu królowej w klatce usuń ramkę z kolonii i zetrzyj dorosłe pszczoły. Po powrocie do laboratorium umieść ramkę w inkubatorze ustawionym na warunki wewnętrzne ula i dokładnie wyczyść pojemniki o tej samej wysokości i szerokości co ramka wypełniona larwami sekwencyjnym mydłem i wodą, wybielaczem i płukaniem etanolem.
Wyłóż dno pojemników kilkoma warstwami ręczników papierowych i dodaj kilka nakładających się na siebie warstw cieńszego materiału chłonnego. Gdy pojemniki będą gotowe, umieść ramkę na ogniskowej stronie larw pojemnika do dołu i użyj kawałka folii aluminiowej do przykrycia pojemnika i ramy. Po całonocnej inkubacji ostrożnie wyjmij pojedyncze chusteczki z górnej warstwy każdego pojemnika, aby umożliwić delikatne wylanie larw na tackę transferową.
Następnie za pomocą, miękkich kleszczy rozprowadź larwy po powierzchni tac bez dotykania i umieść tacę pokrytą folią namiotową w inkubatorze, aż larwy przepoczwarzą się i dojrzeją do stadium szeroko otwartych oczu. W celu wstrzyknięcia wirusa poczwarkom, należy zmieszać interesujące cząstki wirusa w odpowiednim stężeniu w sterylnym PBS w 15-mililitrowej probówce i podłączyć aparat nastrzykujący do ręcznej multipipety. Aby przetestować skuteczność wtryskiwacza, załaduj wtryskiwacz 100 mikrolitrami wody i dozuj wodę w dawkach po jednym mikrolitrze.
Jeśli zastrzyki są dokładne, załaduj 100 mikrolitrów roztworu cząstek wirusa do wstrzykiwacza i delikatnie chwyć jedną poczwarkę wzdłuż klatki piersiowej, wywierając tylko taki nacisk, aby wepchnąć płyny wewnętrzne do brzucha, aby podziały tergitów były bardziej widoczne. Stabilizując ramię trzymające strzykawkę przy stole laboratoryjnym w celu podparcia, włóż igłę tuż do naskórka między trzecim a czwartym tergitem brzusznym i wstrzyknij jeden mikrolitr roztworu wirusa. Po wstrzyknięciu wszystkich poczwarek należy ponownie przykryć tacę folią namiotową przed powrotem poczwarek do inkubatora na kolejne trzy do pięciu dni.
Pod koniec inkubacji zebrać poczwarki według źródła kolonii w indywidualnych 50-mililitrowych stożkowych probówkach wirówkowych i wirować w celu homogenizacji zawartości. Aby przeprowadzić test biologiczny karmienia wirusów, zatkaj otwory zasilające czystych klatek rurką wirówkową o odpowiedniej wielkości i częściowo napełnij 15-mililitrowe probówki wirówkowe świeżo przygotowanym roztworem do karmienia. Następnie odwróć rurki i użyj pinezki, aby zrobić jeden lub dwa otwory wokół końcówek.
Następnie wyszczotkuj wszystkie nowo powstałe pszczoły z ich skrzynek do pojemnika zbiorczego lekko pokrytego na brzegach olejem roślinnym i delikatnie wymieszaj pszczoły ręcznie. Przenieś 35 pojedynczych pszczół do pojedynczego, wysmarowanego tłuszczem kubka i umieść zawartość kubka w akrylowej klatce. Aby przygotować inokulum wirusa, należy wymieszać odpowiednią ilość rozmrożonych, skoncentrowanych cząstek wirusa z 30% roztworem sacharozy w jednym sterylnym pojemniku na każdy rodzaj leczenia i dodać 600 mikrolitrów roztworu wirusa na poszczególne tace inokulum.
Następnie ostrożnie włóż każdą tackę z inokulum do odpowiednich klatek, uważając, aby przypadkowo nie wypuścić żadnych pszczół. Po spożyciu wszystkich inokulantów, należy wymienić probówki wirówkowe z górnego otworu podajnika na przygotowane probówki i zapisywać śmiertelność w każdej klatce w odstępach 12-godzinnych przez pierwsze 72 godziny eksperymentu, a następnie co 24 godziny. Aby usunąć martwe pszczoły, przesuń drzwi klatki na tyle daleko, aby umożliwić włożenie pary kleszczy wysterylizowanych alkoholem w celu zgarnięcia martwych pszczół.
W zależności od projektu eksperymentu, żywe próbki z każdej klatki należy umieścić w oddzielnych probówkach wirówkowych na suchym lodzie, aby umożliwić pobranie próbek do pomiaru miana wirusa. W tym reprezentatywnym wysiłku zbierania większych wirusów, każdej poczwarce początkowo wstrzyknięto około 95% izraelskiego inokulum wirusa ostrego paraliżu. Chociaż 10 z 16 próbek kolonii biorących udział w tych ekstrakcjach zawierało wysoce czysty wirus, inne próbki różniły się proporcjami wirusa, a niektóre były nawet zdominowane przez inne wirusy, takie jak wirus zdeformowanych skrzydeł.
Jak pokazano w tabeli, wartości progowe cyklu mogą być używane jako predyktor proporcji. Porównanie krzywych dawka-odpowiedź i przeżycie pszczół miodnych karmionych tymi samymi cząsteczkami wirusa w ciągu dwóch różnych lat pokazuje, że pomimo identycznych parametrów testowych, badania przeprowadzone w 2018 i 2019 r. dały zauważalnie różne odpowiedzi na przeżycie we wszystkich grupach z wyjątkiem kontrolnych, które nie otrzymały wirusa w swoim inokulum sacharozy. Reakcje pszczół miodnych na infekcję wirusową mogą się znacznie różnić w zależności od pory roku, ula, a nawet rozmieszczenia inokulum w poszczególnych klatkach.
Dlatego duże rozmiary próbek mają kluczowe znaczenie dla potwierdzenia efektów leczenia. Wykorzystując zapasy cząsteczek wirusa, eksperyment można rozszerzyć o zastrzyki dorosłym robotnicom pszczół miodnych, królowym lub trutniom, a także innym gatunkom zapylaczy w celu oceny zasięgu żywiciela. Zakaźne zapasy wirusa można wykorzystać do przetestowania, w jaki sposób infekcja wchodzi w interakcje z innymi czynnikami, takimi jak dieta, narażenie chemiczne lub środowisko społeczne.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół masowej produkcji nieopłaszczonych cząstek wirusów pszczół miodnych do zastosowania w wysokowydajnych biotestach. Celem jest zrozumienie wpływu infekcji wirusowej na pszczoły miodne poprzez wykorzystanie łatwo hodowanych poczwarek, co upraszcza proces eksperymentalny.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Wirusologia
- Zdrowie i choroby pszczół miodnych
- Rozwój biotestów
Tło
- Rośnie obawka dotycząca wirusów pszczół miodnych i ich wpływu na populacje pszczół.
- Tradycyjnie, badania nad wirusami polegały na złożonych hodowlach komórkowych.
- Ta metoda ma na celu usprawnienie biotestów poprzez użycie larw jako podmiotów badań.
Stosowane metody
- Produkcja cząstek wirusowych z poczwarek pszczół miodnych
- Nieopłaszczone wirusy z wykorzystaniem modeli pszczół miodnych
- Wysokowydajne biotesty przeżywalności
Główne wyniki
- Wykazano skuteczną produkcję cząstek wirusowych i zastosowanie w biotestach.
- Ujawniono zmienność reakcji pszczół miodnych na infekcję wirusową.
- Ustalono metodę testowania zakaźności wirusów u różnych gatunków zapylaczy.
Wnioski
- Badanie zapewnia niezawodną metodę produkcji wirusów pszczół miodnych do badań.
- To podejście poprawia rozumienie interakcji wirus-gospodarz i ich wpływu ekologicznego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable production of virus-enriched inoculum using honey bee pupae enables controlled, high-throughput infection studies critical for understanding pathogen dynamics in pollinator health. This approach addresses the challenge of background contamination and supports reproducible, quantitative assessment of viral effects, informing both mechanistic de-risking and translational research. The method provides a scalable platform for evaluating virus-host interactions and environmental co-factors, supporting risk-adjusted decisions in agricultural and ecological R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of viral pathogenicity and host response in a controlled biological system.
- Supports functional validation of virus-host interactions relevant to pollinator health.
- Facilitates mechanistic de-risking by minimizing confounding background infections.
- Provides quantitative data for predictive confidence in downstream studies.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput bioassays for rapid screening of viral infectivity and treatment effects.
- Ensures reproducibility and comparability across experimental runs by controlling inoculum purity and dose.
- Prepares validated biological systems for scalable compound or environmental factor evaluation.
- Enables reliable measurement of mortality curves and infection dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling real-world viral exposures in honey bees.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of interventions affecting pollinator health.
- Allows assessment of virus interactions with nutrition, pesticides, and other stressors.
- Provides a foundation for risk-adjusted advancement of candidate interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through assay development to translational research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in pollinator virology.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of viral pathogenicity and host susceptibility.
- Screening: Provides reproducible, quantitative mortality and infection readouts for assay standardization.
- Analytics: Enables statistical comparison of dose-response and survival curves across conditions and years.
- Translational Research: Facilitates evaluation of environmental and nutritional co-factors in disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse virus-host and intervention studies in pollinator systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in virus-host studies.
- Operational Value: Standardizes inoculum preparation and bioassay execution for scalability and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for intervention development and ecological risk management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of research investments in pollinator health and pathogen mitigation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in honey bee handling, virology, and quantitative bioassay design.
- Needs access to controlled incubators, sterile injection equipment, and analytical tools for viral quantification.
- Demands rigorous cross-team standardization to minimize background contamination and ensure data integrity.
- Adaptable to other pollinator species but may require protocol optimization for species-specific biology.
- Large sample sizes are essential to confirm treatment effects due to biological variability.
