Name: Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj mikroskopię sił atomowych ze spektroskopią w podczerwieni do badania chemii bakterii na poziomie nanometrycznym. Ta metoda pozwala analizować zmiany chemiczne związane z opornością na antybiotyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować firmie Bruker za wsparcie. Prace te były wspierane przez Monash University Advancing Women's Success Grant (K. Kochan). A.Y.P dziękuje za wsparcie ze strony australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Practitioner Fellowship (APP1117940). Praca ta została sfinansowana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych Discovery Project DP180103484. Chcielibyśmy podziękować Panu Finlayowi Shanksowi za jego instrumentalne wsparcie oraz Pani Xenii Kostoulias za jej pomoc techniczną przy próbkach.

Wszystkie prace prowadzone z bakteriami chorobotwórczymi powinny być podejmowane z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa. Należą do nich praca w laboratorium o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego oraz w kabinie bezpieczeństwa biologicznego (PC2), a także staranne odkażanie miejsca pracy odpowiednim środkiem dezynfekującym, np. 80% roztworem etanolu. Przez cały czas należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej.
1. Przygotowanie rozpuszczalników i materiałów
<ol>
	<li>Rozpuszczalniki: Użyj ultraczystej wody jako rozpuszczalnika. Używaj oczyszczonej wody, autoklawizowanej przed eksperymentem, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Podłoże: Użyj dowolnego z tych podłoży dla AFM-IR, np. ZnSe, CaF2, BaF2 itp. Ponieważ AFM-IR jest w zasadzie techniką nieniszczącą, po analizie AFM-IR można zastosować wiele innych narzędzi badawczych do tej samej próbki. Na przykład korelację wyników ze spektroskopią Ramana można przeprowadzić, jeśli stosuje się szkiełka CaF2 lub BaF2 stopnia Ramanowskiego.</li>
	<li>Używaj szklanych fiolek zamiast plastikowych probówek, ponieważ plastik może zanieczyścić próbkę.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do AFM-IR
<ol>
	<li>Wzrost/inkubacja próbki
	<ol>
		<li>Hoduj bakterie w płynnych podłożach lub na solidnych płytkach. Należy wybrać rodzaj pożywki, warunki wzrostu (np. temperatura, dostępność tlenu) i czas wzrostu zgodnie ze specyficznymi wymaganiami badanych gatunków bakterii. Na przykład w przypadku S. aureus Heart Infusion (HI) można użyć płytek agarowych, ze wzrostem przez 16 godzin w 37 °C w warunkach tlenowych. 
		UWAGA: Aby osiągnąć najlepsze wyniki, wzrost/inkubacja powinna dać wystarczającą ilość bakterii, która pozwoliłaby na pobranie mikrogranulki próbki. Określona liczba jednostek tworzących kolonie lub komórek bakteryjnych zależy od rodzaju i wielkości bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie próbki
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej pętli ostrożnie zbierz bakterie z kolonii na płytce agarowej i przenieś je do szklanej probówki. Zbieraj bakterie tylko z wierzchu kolonii. W przypadku pobierania próbek z płynnej kultury za pomocą pipety przenieść około 1 ml zawiesiny bakteryjnej do szklanej probówki. Objętość można modyfikować w zależności od obciążenia bakteryjnego. 
		UWAGA: Ważne jest, aby starać się nie zbierać (lub w miarę możliwości minimalizować zbieranie) żadnego podłoża spod kolonii. Kolejne etapy przygotowania próbki mają na celu usunięcie wszelkich potencjalnych pozostałości pożywki. Minimalizacja potencjalnej pozostałości pożywki od początku umożliwia spektralne pozyskiwanie danych z oczyszczonych komórek bakteryjnych. Kroki 2.2.2 i 2.2.3 stosuje się do próbek przygotowanych z płytek agarowych. W przypadku próbek przygotowanych z pożywki ciekłej należy przejść do kroku 2.2.4.</li>
		<li>Dodaj 1 ml ultraczystej wody do probówki. Wiruj, aż zebrane osady bakteryjne przestaną być widoczne na dnie probówki (zwykle 1-2 min).</li>
		<li>Oszacuj przybliżoną mętność roztworu za pomocą np. wzorców McFarlanda przez wizualne porównanie30 między przygotowanym roztworem a wzorcami McFarlanda. Jeśli zmętnienie zawiesiny bakteryjnej wydaje się być bardzo niskie, dodaj więcej bakterii z płytki za pomocą sterylnej pętli i ponownie odwiruj. Powtarzaj tę czynność, aż szorstkie zmętnienie roztworu będzie porównywalne z normami McFarlanda 0,5 i 1. Na ogół daje to dużą ilość osadów bakteryjnych.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę bakteryjną o sile 3 000 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad. 
		UWAGA: Parametry wirowania można modyfikować w celu uzyskania osadu bakteryjnego. Należy zachować ostrożność przy zwiększaniu siły g, aby nie wywołać pękania bakterii (szczególnie w przypadku bakterii Gram-ujemnych).</li>
		<li>Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant znad osadu. Dodaj 1 ml ultraczystej wody do probówki i przekręć wir, aby ponownie zawiesić granulkę. Następnie odwirować próbkę, tak jak to zrobiono w kroku 2.2.4.</li>
		<li>Powtórzyć procedurę prania (kroki 2.2.2 i 2.2.4) co najmniej trzy razy. W przypadku pobierania próbki początkowej z podłoża płynnego należy powtórzyć procedurę co najmniej cztery razy (usunięcie pożywki, a następnie trzy przemycia).</li>
		<li>Po ostatnim umyciu usuń supernatant, dodaj ultraczystą wodę i wiruj przez co najmniej 2 minuty. Następnie należy umieścić 5 μl próbki na podłożu (np. CaF2 klasy ramanowskiej).</li>
		<li>Jeśli pożądana grubość próbki to wielowarstwowa warstwa bakterii, pozostaw próbkę do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Jeśli pożądana grubość to monowarstwa lub pojedyncze bakterie, natychmiast po osadzeniu próbki (krok 2.2.7) dodaj od 20 do 100 μl ultraczystej wody i delikatnie wymieszaj końcówką pipety. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. 
		UWAGA: Dokładna objętość wody może się różnić w zależności od eksperymentów, ponieważ zależy od wielu czynników (np. wielkości organizmu, gęstości osadu itp.) i dlatego najlepiej określić ją empirycznie. Przygotowanie serii próbek z dodatkiem różnej objętości wody ultraczystej pozwala na wybór próbki o pożądanej grubości/gęstości bakterii. Grubość/gęstość bakterii można łatwo zobrazować za pomocą AFM w kolejnych etapach. Przykłady obrazów AFM z próbek jednowarstwowych i pojedynczych komórek są pokazane w Rysunek 1A–H.</li>
		<li>Zamontuj podłoże na metalowym krążku próbki AFM za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie instrumentu
UWAGA: Opisane tutaj procedury instrumentalne dotyczą instrumentu wymienionego w Tabeli Materiałów. Szczegółowa procedura instrumentalna może nieznacznie różnić się od opisanej tutaj w przypadku korzystania z nowszego modelu instrumentu AFM-IR.
<ol>
	<li>Włącz i zainicjuj instrument, naciskając przycisk Inicjalizuj. Upewnij się, że migawka lasera znajduje się w pozycji otwartej dla testu laserowego.</li>
	<li>Jeśli skonfigurowany jest system przedmuchiwania, przepłucz przyrząd za pomocą N2, włączając przepływ N2. Dostosuj przedmuchiwanie azotem, aby osiągnąć stabilny poziom wilgotności (na przykład 20%). Upewnij się, że wilgotność nie ulega wahaniom podczas pomiarów oraz między tłem a zbieraniem danych próbki. Zaleca się odczekanie około 20 minut, aby poziom wilgotności się ustabilizował.</li>
	<li>Załaduj próbkę do komory na próbkę, naciskając przycisk Załaduj. Wczytywanie próbki odbywa się za pomocą kreatora oprogramowania. Podczas obsługi kreatora oprogramowania najpierw skup się na końcówce, używając strzałek, aby przesunąć stolik mikroskopu w kierunku Z i kliknij Dalej. Po drugie, wyreguluj miejsce zbierania danych za pomocą strzałek kierujących ruchem w płaszczyźnie i wyrównaj laser AFM i detektor AFM za pomocą pokręteł na górze głowicy AFM. Następnie skoncentruj się na powierzchni próbki, przesuwając stolik mikroskopu w kierunku Z. 
	UWAGA: Szczegółowe ilustracje każdego etapu ładowania próbki znajdują się w instrukcji oprogramowania31. Skupienie się na próbce powinno być przeprowadzone ostrożnie. Zbliżając się do powierzchni próbki w kierunku Z, należy używać niskiej prędkości silnika.</li>
	<li>Podejdź do próbki bez angażowania się, klikając przycisk Podejdź.</li>
</ol>
4. Zbieranie danych
<ol>
	<li>tło
	<ol>
		<li>Przed pozyskaniem danych zbierz tło. W celu zbierania tła upewnij się, że migawka lasera jest w pozycji otwartej. Wybierz zakres spektralny i rozdzielczość (w zależności od celu analizy) oraz liczbę skanów i liczbę współśrednich tła. Ogólnie zaleca się, aby były one wysokie (np. 1024 skany i 3 współśrednie). 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zalecana jest rozdzielczość spektralna 4 cm-1 lub 8 cm-1 oraz zakresy spektralne 3,200 cm-1–2,800 cm-1 i 1,800 cm-1–900 cm-1.</li>
		<li>Po uzyskaniu tła zapisz plik tła. Plik nie jest zapisywany automatycznie. Zmień położenie migawki lasera na Zamknij.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbka – pojedyncze widma
	<ol>
		<li>Naciśnij przycisk Engage, aby połączyć się z sample. System zacznie zbliżać się do powierzchni próbki, aż do wykrycia bezpośredniego kontaktu. 
		UWAGA: Nastawa używana w tej pracy mieściła się w zakresie 0,15–2 V, a wzmocnienia sprzężenia zwrotnego (wzmocnienie I i wzmocnienie P) były zwykle ustawione na 3 i 10. Sondy kontaktowe NIR2 są powszechnie stosowane w układzie nanoIR2 (model: PR-EX-nIR2-10, częstotliwość rezonansowa (kHz): 13 +/−4 kHz, stała sprężystości (N/m): 0,07−0,4 Nm-1).</li>
		<li>Zbierz obraz AFM, aby zobrazować powierzchnię. W pierwszej kolejności zeskanuj większy obszar (np. 50 x 50 μm) z niższą rozdzielczością przestrzenną (np. 200 x 200 punktów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I). 
		UWAGA: Dane AFM-IR są zawsze zbierane w trybie kontaktowym, jednak dane AFM mogą być zbierane w trybie kontaktowym lub stukania.</li>
		<li>Z obrazu wysokości/odchylenia AFM wybierz konkretny obszar zainteresowania i ponownie zobrazuj go z wyższą rozdzielczością przestrzenną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J–K). Upewnij się, że szybkość zbierania danych jest odpowiednia, z powolnymi ruchami końcówki (np. częstotliwość skanowania 0,2–0,4 Hz).</li>
		<li>Wybierz miejsce pomiaru (np. pojedynczą bakterię) i przesuń końcówkę do tego miejsca.</li>
		<li>Wyrównaj laser IR. W tym celu należy użyć liczby falowej, przy której próbka będzie się wchłaniać. W przypadku materiałów biologicznych może to być np. amid I (1655 cm-1). Upewnij się, że filtr pasma przepustowego jest wyłączony i kliknij Start IR. Prawy wykres w mierniku nanoIR (FFT ugięcia wyświetlanego jako amplituda w funkcji częstotliwości) powinien pokazywać co najmniej jeden wyraźny pik, a lewy wykres (ugięcie w funkcji czasu) powinien mieć przebieg okresowy. Jeśli tak nie jest, przystąp do optymalizacji punktów IR. 
		UWAGA: Nawet jeśli szybka transformata Fouriera (FFT) i ugięcie wykazują oczekiwany profil, zaleca się przeprowadzenie optymalizacji miejsc IR dla co najmniej kilku liczb falowych, w których spodziewane są pasma.</li>
		<li>Zoptymalizuj hot spoty do zbierania danych w podczerwieni, używając wybranych wartości liczby falowej. Pomocne może być użycie konwencjonalnego widma podczerwieni bakterii (np. widma ATR osadu bakteryjnego) w celu zidentyfikowania pozycji pasm i wykorzystania ich do optymalizacji gorących punktów. Wybierz różne wartości liczb falowych (np. 8–10) z różnych obszarów widmowych. 
		UWAGA: Jeśli konwencjonalne widmo podczerwone badanych bakterii nie mogło zostać zebrane przed zebraniem danych AFM-IR, widma bakteryjne dostępne w literaturze mogą być wykorzystane jako przybliżone wskazówki. Wynikiem optymalizacji plamki w podczerwieni jest obraz, który przedstawia mapę sygnału FFT w każdym miejscu x i y. Lokalizacja z największym sygnałem jest wybierana automatycznie. Przykłady takich obrazów są podane w software manual31.</li>
		<li>Po zoptymalizowaniu plamek IR dla wybranych wartości liczb falowych, zdefiniuj parametry zbierania danych spektralnych: obszar spektralny, rozdzielczość spektralną, liczbę skanów i przyłożoną moc i wprowadź je do odpowiednich okien w oprogramowaniu. Rozdzielczość spektralna powinna być zgodna z rozdzielczością tła, a obszar widmowy powinien mieścić się w obszarze spektralnym, dla którego zebrano tło. 
		UWAGA: Ogólny początkowy zestaw parametrów może być następujący: zakres spektralny: 3200 cm-1–2800 cm-1 i 1800 cm-1–900 cm-1, rozdzielczość spektralna: 4 cm-1 lub 8 cm-1, liczba skanów: 512–2048.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj moc lasera w zależności od sygnału. Ogólnie rzecz biorąc, wartości między 8% a 10% mocy lasera powinny być wystarczające dla dobrej jakości sygnału. Wyższych wartości należy używać ostrożnie, ponieważ mogą one spowodować uszkodzenie próbki. 
		UWAGA: Procentowa moc lasera może się różnić w zależności od typu lasera IR. Podane tutaj wartości procentowe dotyczą lasera OPO.</li>
		<li>Kliknij Acquire, aby zebrać widmo AFM-IR.</li>
		<li>Ponownie zbierz dane AFM z tego samego obszaru po zebraniu widma AFM-IR. Jest to wysoce zalecane, ponieważ ujawni potencjalny dryft i/lub destrukcyjny wpływ na próbkę.</li>
		<li>Jeśli widmo AFM-IR jest zadowalające i nie obserwuje się destrukcyjnego wpływu na próbkę, należy przystąpić do zbierania danych. W razie potrzeby zdefiniuj serię punktów do zbierania danych za pomocą opcji Szyk i zebrany obraz wysokości lub odchylenia AFM. Opcja ta pozwala na zbieranie widm kolejno z każdego punktu o tych samych parametrach spektralnych, jakie są zdefiniowane dla pojedynczego widma.</li>
		<li>Jeśli obraz AFM pobrany po pobraniu widma AFM-IR wykaże destrukcyjny wpływ na próbkę (zwykle spaloną plamę), zmniejsz moc; wybierz inny punkt i powtórz kroki 4.3.8–4.3.11.</li>
		<li>Jeśli sygnał w widmie AFM-IR nie jest zadowalający, sprawdź poprawność optymalizacji punktów IR (krok 4.3.6). Jeśli jest poprawny, nieznacznie zwiększ moc lasera i powtórz kroki 4.3.7–4.3.11. Można to powtarzać aż do uzyskania zadowalającego sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbka – podejście do obrazowania 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się zarejestrowanie pojedynczego widma AFM-IR bakterii przed zebraniem obrazu rozkładu intensywności dla wybranej wartości liczby falowej.
	<ol>
		<li>Nagraj obraz AFM wybranego obszaru próbki. Aby to zrobić, najpierw zbierz obraz AFM większego obszaru o niższej rozdzielczości przestrzennej (np. 50 x 50 μm, 200 x 200 punktów), a następnie wybierz obszar zainteresowania i zbierz obraz AFM o zwiększonej rozdzielczości przestrzennej (jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1I–K).</li>
		<li>Wybierz wartości liczby falowej dla obrazowania AFM-IR.</li>
		<li>Upewnij się, że plamka IR lasera jest zoptymalizowana dla wybranych wartości liczby falowej (krok 4.3.6). Jeśli plamka IR nie jest zoptymalizowana dla niektórych liczb falowych (brak wyraźnego maksimum), zoptymalizuj ją dla nich.</li>
		<li>Zdefiniuj parametry obrazowanego obszaru: szerokość i wysokość, liczbę punktów danych w kierunku X i Y. 
		UWAGA: Jeśli zostanie zastosowany kolejny wybór punktów z poprzednich obrazów AFM (jak pokazano na rysunku Rysunek 1I–K), pola szerokości i wysokości zostaną automatycznie wypełnione po zaznaczeniu obszaru.</li>
		<li>Zdefiniuj parametry akwizycji sygnału spektralnego: długość fali, liczbę skanów i moc lasera. 
		UWAGA: Liczba skanów musi mieścić się w granicach rozsądku. 64 lub 32 skany zazwyczaj pozwalają na wystarczającą ilość sygnału.</li>
		<li>Zdefiniuj parametry ruchu końcówki AFM, klikając na Szybkość skanowania. Im większa liczba skanów w poprzednim kroku i liczba punktów danych w kierunku X, tym wolniejsze będą ruchy końcówki. Brak regulacji pomiędzy tymi parametrami będzie skutkował zbyt szybkim ruchem końcówki, uniemożliwiającym faktyczne pobranie określonej liczby skanów z każdego punktu. 
		UWAGA: Na przykład, aby uzyskać odpowiednią kolekcję sygnału IR z 64 współdodaniami i 200 punktami, ustaw szybkość skanowania na 0,07 kHz.</li>
		<li>Upewnij się, że pole Włącz obrazowanie w podczerwieni jest zaznaczone.</li>
		<li>Rozpocznij obrazowanie. AFM-IR natężenia sygnału o wybranej liczbie falowej będzie zbierany jednocześnie z danymi AFM z tego obszaru. 
		UWAGA: W przypadku korzystania z lasera OPO możliwe jest dodatkowe zbieranie jednocześnie obrazu o szczytowej częstotliwości rezonansu kontaktowego. Można to wykorzystać do uzyskania informacji o względnej sztywności próbki w różnych miejscach.</li>
		<li>Użyj okna Sekwencja przechwytywania, aby ustawić kolejne zbieranie danych AFM-IR z tego samego obszaru o tych samych parametrach, ale dla różnych wartości liczb falowych. Aby to zrobić, otwórz okno Sekwencja przechwytywania, wpisz każdą liczbę falową i zdefiniuj zastosowaną moc lasera (dla każdej liczby falowej).</li>
		<li>Eksport zebranych danych (AFM i AFM-IR, pojedyncze widma i obrazowanie) do różnych formatów i analiza przy użyciu metod adekwatnych do konkretnych celów badawczych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sears, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+partnership%3A+celebrating+our+gut+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A dynamic partnership: celebrating our gut flora.</a> Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).</li>
<li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990-2017%3A+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), London, England. 200-211 (2020).</li>
<li>Seymour, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+treatment+and+mortality+during+mandated+emergency+care+for+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).</li>
<li>Weiss, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+antimicrobial+therapy+increases+mortality+and+organ+dysfunction+duration+in+pediatric+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis.</a> Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).</li>
<li>Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+bloodstream+infections+from+positive+blood+cultures+and+directly+from+blood+samples%3A+recent+developments+in+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%3A+The+Official+Publication+of+the+European+Society+of+Clinical+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).</li>
<li>Aminov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotics+and+antibiotic+resistance+in+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature.</a> Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).</li>
<li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+resistance+worldwide%3A+causes%2C+challenges+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses.</a> Nature Medicine. 10 (12), Suppl 122-129 (2004).</li>
<li>Roca, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+threat+of+antimicrobial+resistance%3A+science+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbes+and+New+Infections%22%5BJournal%5D)">The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention.</a> New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).</li>
<li>O'Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+review+on+antimicrobial+resistance.+Tackling+drug-resistant+infections+globally%3A+final+report+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Trust%22%5BJournal%5D)">The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations.</a> Wellcome Trust. , (2016).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Piddock, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assess+drug-resistance+phenotypes%2C+not+just+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes.</a> Nature Microbiology. 1 (8), 16120(2016).</li>
<li>Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+characterizations+by+FT-IR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy.</a> Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).</li>
<li>Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourier+Transform+Infrared+Spectroscopy+%28FTIR%29+as+a+tool+for+the+identification+and+differentiation+of+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).</li>
<li>Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+evolution+of+infrared+spectroscopy+applied+to+bacterial+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449(2018).</li>
<li>San-Blas, E., Cubillán, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+xenorhabdus+and+photorhabdus+bacteria+by+Fourier+transform+mid-infrared+spectroscopy+with+attenuated+total+reflection+%28FT-IR%2FATR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta.+Part+A%2C+Molecular+and+Biomolecular+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR).</a> Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).</li>
<li>Sousa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+the+acinetobacter+calcoaceticus-acinetobacter+baumannii+complex+species+by+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+identification+of+bacterial+strains+by+Fourier+transform+near-infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).</li>
<li>Dawson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+Fourier+transform+infrared+spectroscopy+for+the+rapid+typing+of+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).</li>
<li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Antimicrobial+Resistance-Related+Changes+in+Biochemical+Composition+of+Staphylococcus+aureus+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).</li>
<li>Dazzi, A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-IR%3A+Technology+and+Applications+in+Nanoscale+Infrared+Spectroscopy+and+Chemical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging.</a> Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).</li>
<li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-IR%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+infrared+spectroscopy+for+nanoscale+chemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization.</a> Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).</li>
<li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).</li>
<li>Katzenmeyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+spectroscopy+beyond+the+diffraction+limit+via+direct+measurement+of+the+photothermal+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect.</a> Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).</li>
<li>Bruker Life Science Applications. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html">https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html</a> (2020).</li>
<li>Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+and+imaging+of+bacterial+polymer+nanogranules+by+infrared+nanospectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy.</a> Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).</li>
<li>Baldassarre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+amide+I+absorption+in+single+bacteria+and+mammalian+cells+with+resonant+infrared+nanospectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy.</a> Nanotechnology. 27 (7), 075101(2016).</li>
<li>Vitry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+infrared+and+mode+synthesizing+atomic+force+microscopy%3A+Application+to+the+study+of+lipid+vesicles+inside+Streptomyces+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria.</a> Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).</li>
<li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mapping+of+the+distribution+of+viruses+into+infected+bacteria+with+a+photothermal+method%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method.</a> Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).</li>
<li>Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daptomycin%3A+a+lipopeptide+antibiotic+for+the+treatment+of+serious+Gram-positive+infections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).</li>
<li>Garcia, L. S. MacFarlan Standards. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia%2C+LS+%22Clinical+Microbiology+Procedures+Handbook%2C+3rd+Edition%22">Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition</a>. , American Society of Microbiology. (2010).</li>
<li>NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf">https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf</a> (2020).</li>
<li>Whelan, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+an+en+masse+and+reversible+B-+to+A-DNA+conformational+transition+in+prokaryotes+in+response+to+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454(2014).</li>
<li>McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vancomycin+Resistance+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+Journal+of+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (2), 269-281 (2017).</li>
<li>Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+vancomycin+intermediate+Staphylococcus+aureus+%28VISA%29+and+heterogenous-VISA%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%3A+Journal+of+Molecular+Epidemiology+and+Evolutionary+Genetics+in+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA.</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).</li>
<li>Perez-Guaita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Nano-Imaging+of+Malaria+Infected+Red+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).</li>
</ol>

Zwracamy się do firmy Bruker z prośbą o uiszczenie opłaty za publikację. KK, BRW, AP i PH są wynalazcami na podstawie międzynarodowego patentu (PCTIB2020/052339), który opisuje niektóre z podstawowych aspektów tego podejścia.

Przydatność spektroskopii w podczerwieni do charakteryzowania szerokiego zakresu próbek biologicznych w kontekście ich składu chemicznego jest dobrze znana. W ciągu ostatniej dekady spektroskopia w podczerwieni stała się obiecującym narzędziem do badań nad bakteriami 12,13,14,15,16,17. Nadal cieszy się dużym zainteresowaniem w dziedzinie mikrobiologii, jako jedna z niewielu technik umożliwiających charakterystykę fenotypową na podstawie składu chemicznego. W tym kontekście, główną wadą konwencjonalnej mikroskopii FTIR jest ograniczona rozdzielczość przestrzenna, uniemożliwiająca badania pojedynczych komórek i subkomórkowych bakterii. W rzeczywistości mały rozmiar bakterii stanowi przeszkodę nie tylko dla podczerwieni, ale dla zdecydowanej większości technik. W związku z tym dostępne narzędzia badawcze do badań jednokomórkowych i subkomórkowych bakterii są znacznie ograniczone. Połączenie AFM z podczerwienią umożliwia przezwyciężenie ograniczeń rozdzielczości przestrzennej spektroskopii w podczerwieni, zapewniając nowatorskie narzędzie do badań nad bakteriami, zdolne do sondowania składu chemicznego w nanoskali.
Technika ta nie ogranicza się do badań pojedynczych komórek i pozwala na badanie różnych próbek o różnej grubości. Niewątpliwie czyste i staranne przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości obrazów. Niniejszy protokół przedstawia metodę przygotowania wielowarstwowych, jednowarstwowych i/lub jednokomórkowych próbek różnych bakterii (ryc. 1). Przygotowana próbka zależy od kilku czynników, w tym początkowego obciążenia bakteryjnego, rozcieńczenia po myciu, a także dalszego rozcieńczenia na podłożu. Ilość próbki uzyskanej po rozcieńczeniu przemytych granulek i przed osadzeniem na podłożu zazwyczaj pozwala na przygotowanie wielu próbek. Dlatego, aby uzyskać pożądany rozkład próbki na podłożu, często korzystne jest przygotowanie serii próbek, różniących się rozcieńczeniem. W przypadku badań mających na celu zbieranie widm AFM-IR, a nie obrazowanie subkomórkowe, modyfikacja ilości próbki (np. z jednowarstwowej na wielowarstwową) może być korzystna w celu zwiększenia intensywności sygnału.
Kolejnym krytycznym aspektem w przygotowaniu próbki jest odpowiednie usunięcie pozostałości pożywki. W zależności od wybranych metod hodowli próbek, próbkę pobiera się albo z płynnego podłoża, albo z płytki agarowej. W obu przypadkach pozostałość pożywki może być obecna w próbce, chociaż w znacznie mniejszym stopniu po pobraniu z płytek agarowych. Ponieważ pożywki bakteryjne zawierają dużą ilość różnych składników biologicznych, bardzo ważne jest zapewnienie odpowiedniego usunięcia pożywki. Zalecamy trzy przemycia ultraczystą wodą w przypadku próbek z płytek agarowych i co najmniej cztery przemycia w przypadku próbek pobranych z pożywki. W razie potrzeby liczbę prań można zwiększyć; Jednak w przypadku porównania różnych próbek ważne jest, aby zachować spójność między próbkami. Zademonstrowany protokół wykorzystuje wodę, a nie rozpuszczalniki, takie jak bufor fosforanowy (PBS) lub sól fizjologiczna. Zarówno PBS, jak i sól fizjologiczna prowadzą do tworzenia się kryształów po wysuszeniu na powietrzu, które mogą uszkodzić bakterie. Ponadto oba są źródłem intensywnych pasm podczerwieni, przy czym w szczególności PBS zawiera wiele pasm w obszarze odcisków palców. Brak możliwości stosowania soli fizjologicznej lub PBS stanowi obecnie poważne ograniczenie dla tej techniki. Zazwyczaj użycie wody do mycia nie powoduje żadnego destrukcyjnego wpływu na bakterie; Należy jednak zachować ostrożność i jeśli to możliwe, czas ekspozycji na wodę powinien być ograniczony. Jeżeli protokół przygotowania próbki musi zostać wstrzymany na etapie mycia, zaleca się pozostawienie próbki w postaci granulatu po usunięciu wody. Ma to szczególne znaczenie w przypadku bakterii Gram-ujemnych, zawierających cieńszą ścianę komórkową, ponieważ są one bardziej podatne na pękanie.
Aby zapewnić prawidłowe i wysokiej jakości dane AFM-IR, kilka aspektów protokołu gromadzenia danych ma kluczowe znaczenie. Po pierwsze, prawidłowe zebranie tła jest niezbędne do pozyskania danych. W szczególności konieczne jest utrzymanie stabilnego poziomu wilgotności podczas zbierania tła, jak również między tłem a pobieraniem próbek. Aby to zapewnić, zalecamy przepłukanie instrumentu azotem i utrzymanie poziomu wilgotności nie wyższego niż 25%. Brak oczyszczania może stanowić znaczne ograniczenie, szczególnie w miejscach o dużej wilgotności. Po drugie, należy podkreślić znaczenie właściwej optymalizacji punktów IR. Aby uzyskać najlepsze wyniki, korzystna może być wiedza a priori na temat położenia maksimów pasma. Na przykład konwencjonalne widmo podczerwieni osadu bakteryjnego można wykorzystać do określenia pozycji prążków oczekiwanych od próbki. Jeśli nie jest to możliwe do uzyskania, jako alternatywne podejście, użytkownik może wykorzystać widma IR dostępne w literaturze lub rozpocząć optymalizację przy użyciu pozycji pasma, której można się spodziewać w bakterii (np. amid I i amid II). Po trzecie, przy zbieraniu danych ważne jest, aby podkreślić znaczenie starannego doboru mocy (pozwalającego osiągnąć dobry stosunek sygnału do szumu), ponieważ może to mieć destrukcyjny skutek. Zalecana moc zależy od grubości próbki, przy czym przybliżone wskazówki są dostępne w instrukcji przyrządu31. Zalecamy empiryczne przetestowanie stanu próbki po pomiarze poprzez pobranie obrazu AFM, ponieważ ujawni to wszelkie destrukcyjne wpływy. Co więcej, zebranie obrazów AFM z tego samego obszaru przed i po zebraniu widm AFM-IR służy jako dobre potwierdzenie, że nie wystąpił dryf i widma rzeczywiście pochodzą z wybranego punktu w komórce. Możliwość dryftu jest szczególnie istotna przy zastosowaniu metody obrazowania, poprzez sekwencyjne obrazowanie natężenia podczerwieni przy wybranych wartościach liczb falowych. Przykład tego zilustrowano na rysunku 5. Obrazowany obszar został zdefiniowany na początku eksperymentu i ma być spójny dla wszystkich wartości liczb falowych. Widoczny jest jednak wyraźny dryf pomiędzy każdym obrazem o wysokości AFM (i odpowiadającym mu natężeniu liczby falowej w podczerwieni), a czas akwizycji każdej mapy wynosi około 40 minut. Z tego powodu dla użytkowników zbierających dane obrazowe zalecamy, aby zawsze wybierać obszar nieco większy niż próbka będąca przedmiotem zainteresowania, aby mieć pewność, że nawet w przypadku wystąpienia dryfu, próbka będąca przedmiotem zainteresowania pozostanie w obrazowanym obszarze.
Do potencjalnych ograniczeń protokołu należy brak możliwości zbierania danych w stanie uwodnionym w roztworach fizjologicznych (np. soli fizjologicznej lub PBS) opisanych powyżej. Ponadto, szczególnie w obszarach o wysokiej wilgotności, często zachodzi potrzeba przedmuchiwania azotem. Ponadto protokół umożliwia badanie organizmów o wielkości do 100 nm, co wyklucza możliwość jego wykorzystania do mniejszych struktur. Choć można temu zaradzić za pomocą innego lasera (np. kwantowego lasera kaskadowego pozwalającego osiągnąć rozdzielczość przestrzenną 20 nm), wiąże się to również z ograniczonym zakresem spektralnym, a także trudnościami w uzyskaniu dobrego stosunku sygnału do szumu. Wreszcie, sondowanie miękkich powierzchni może stanowić wyzwanie, ponieważ końcówka nie wykrywa prawidłowo powierzchni i wykracza poza punkt kontaktu, aż do pęknięcia. Chociaż zazwyczaj nie stanowi to problemu w przypadku próbek bakteryjnych, może wystąpić po pomiarach bardziej miękkich próbek. W takich przypadkach zaleca się próbę zaczepienia o czystą powierzchnię podłoża w pobliżu próbki.
Opisany protokół może być wykorzystany do wielu rodzajów badań bakteryjnych, w tym do badań porównawczych między różnymi próbkami, a także do badań subkomórkowych. Dane mogą być analizowane przy użyciu podejść chemometrycznych dla pojedynczych widm i modalności obrazowania35, w zależności od celu badań. Co więcej, protokół może być również zmodyfikowany w celu zastosowania do innego materiału biologicznego (takiego jak grzyby, drożdże, komórki itp.), poprzez dodanie utrwalenia.

Bakterie to jednokomórkowe organizmy prokariotyczne, występujące w różnych kształtach i rozmiarach, zazwyczaj w zakresie od kilkuset nanometrów do mikrometrów. Występują w różnych siedliskach i są niezbędne do istnienia życia. W ludzkim ciele większość bakterii obecnych w jelitach jest nieszkodliwa, a wiele z nich jest w rzeczywistości korzystnych1. Jednak kilka gatunków bakterii jest chorobotwórczych i powoduje szereg chorób zakaźnych. Infekcje bakteryjne mogą prowadzić do rozwoju sepsy i wstrząsu septycznego: stanu zagrażającego życiu, wynikającego z reakcji organizmu na infekcję2. Sepsa jest poważnym globalnym zagrożeniem dla zdrowia, z wysoką częstością występowania na całym świecie i poważnymi wskaźnikami śmiertelności. Szacuje się, że tylko w 2017 roku na całym świecie zarejestrowano 50 milionów przypadków sepsy, z czego 11 milionów zakończyło się śmiercią (około 20%)2. Ponadto wykazano, że zmniejszenie szans pacjenta na przeżycie, spowodowane opóźnioną terapią, występuje w ujęciu godzinowym3,4.
Infekcje bakteryjne są leczone antybiotykami. Nasilenie potencjalnych konsekwencji bakteryjnych zakażeń krwi (BSI) wraz z wyraźnym znaczeniem szybkiego rozpoczęcia terapii przeciwbakteryjnej skłania do natychmiastowego podania antybiotyków. Jednakże, ponieważ obecne podejścia diagnostyczne stosowane w praktyce klinicznej (np. hodowla krwi) wymagają stosunkowo długiego czasu, podawanie antybiotyków często następuje przed pozytywnym rozpoznaniem BSI5. Czynnik ten prowadzi do nadmiernego stosowania antybiotyków, co – wraz z nadmiernym stosowaniem antybiotyków w innych sektorach, takich jak rolnictwo – stwarza poważną presję ewolucyjną w kierunku rozwoju oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR)6,7. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe jest obecnie jednym z najpilniejszych globalnych problemów zdrowotnych7,8 i przewiduje się, że do 2050 roku stanie się główną przyczyną zgonów9. Rozwój oporności, wraz z rozprzestrzenianiem się szczepów AMR, zachodzi w zastraszającym tempie7,8,9 i zdecydowanie przewyższa tempo odkrywania nowych antybiotyków10. Na całym świecie stale pojawiają się nowe odporne fenotypy, podczas gdy 
Badania mające na celu zrozumienie zmian związanych z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe są często powolne i ograniczone dostępnymi podejściami11. Ponadto powszechnie stosowane metody, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i sekwencjonowanie całego genu (WGS), koncentrują się wyłącznie na zmianach genotypowych. Nie są one wystarczające do ujawnienia mechanizmów oporności11, co powoduje pilną potrzebę opracowania narzędzia badawczego umożliwiającego zrozumienie składu chemicznego bakterii.
Spektroskopia w podczerwieni (IR) dostarcza molekularnej charakterystyki próbki i dlatego jest obiecującym kandydatem do fenotypowych badań bakteryjnych. Od wczesnych zastosowań12, w literaturze zademonstrowano ogromną ilość przykładów jego użycia13,14. Obejmują one opartą na fenotypach identyfikację bakterii na poziomie genus15, species16 i strain17,18. Jednak rozdzielczość przestrzenna konwencjonalnej podczerwieni jest ograniczona do kilku mikronów ze względu na limit rozdzielczości przestrzennej dyfrakcji długości fali19. Ponieważ wielkość większości bakterii leży poniżej tej granicy (np. Staphylococcus aureus ≈ średnicy 400 nm), konwencjonalne IR nie ma zastosowania do sondowania na poziomie pojedynczej komórki lub wewnątrzkomórkowym.
Ograniczenie rozdzielczości przestrzennej zostało niedawno przezwyciężone przez połączenie spektroskopii IR z mikroskopią sił atomowych (AFM-IR). W tym przypadku absorpcja podczerwieni jest wykrywana pośrednio, poprzez rozszerzalność cieplną materiału19,20,21,22. Krótko mówiąc, absorpcja promieniowania podczerwonego powoduje miejscowy wzrost temperatury. Można to zmierzyć bezpośrednio23 lub poprzez pomiar oscylacji sondy wspornikowej AFM, wynikającej z impulsu siły wytworzonego przez absorpcję podczerwieni20,21. Kombinowana technika AFM-IR pozwala na osiągnięcie rozdzielczości przestrzennej zbliżonej do 20 nm, dostarczając jednocześnie informacji o lokalnych właściwościach fizycznych próbki (AFM) i jej składzie chemicznym (AFM-IR). Możliwe jest zarówno zbieranie pojedynczych widm z wybranych miejsc, jak i mapowanie natężenia wybranych wartości liczb falowych w obrębie wybranego obszaru.
Biorąc pod uwagę osiągalną rozdzielczość przestrzenną AFM-IR, oczywiste jest, że technika ta otwiera możliwość chemicznego/fenotypowego badania pojedynczej komórki bakterium i jej składu wewnątrzkomórkowego24. Do tej pory w literaturze przedstawiono kilka przykładów zastosowania AFM-IR dla pojedynczych bakterii19,20,21,22,25,26,27,28. Obejmują one pojedynczą analizę spektralną19,21,22 i mapowanie na poziomie subkomórkowym19,22,25,26,27,28. Na przykład, opisano zdolność do wykrywania wewnątrzkomórkowych pęcherzyków lipidowych27 i wirusów28 w obrębie pojedynczej bakterii. Wyniki te pokazują przydatność AFM-IR do badań w nanoskali pojedynczych bakterii i klinicznie istotnych patogenów19.
Dlatego przedstawiamy metodę przygotowania i zbierania próbek dla danych AFM-IR z wielowarstwowych, jednowarstwowych i jednokomórkowych próbek bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół został zastosowany do badania różnych gatunków bakterii22 i zmian w ich składzie chemicznym. W szczególności badano in vivo rozwój oporności na wankomycynę i niewrażliwości na daptomycynę w parach klinicznych S. aureus19. Zarówno okresowa oporność na wankomycynę, jak i niewrażliwość na daptomycynę u S. aureus (VISA i DpR) pojawiły się stosunkowo niedawno, w następstwie zwiększonego stosowania i wprowadzenia tych antybiotyków do klinik, stanowiąc poważny problem medyczny. Ponadto, w szczególności, mechanizm braku wrażliwości na daptomycynę nadal pozostaje nieuchwytny, co utrudnia opracowywanie alternatywnych leków19,29. Prezentowany protokół koncentruje się na zapewnieniu wiarygodnych widm AFM-IR pojedynczych bakterii, które mogą być dalej analizowane przy użyciu różnych podejść chemometrycznych, zgodnie z celami eksperymentalnymi. Dodatkowo obejmuje podejście mapowania, które ma zastosowanie w badaniach wewnątrzkomórkowych.

<table><tbody><tr><td>Metalowy dysk na próbki AFM</td><td>PST ProSciTech Pty Ltd</td><td>GA530-15</td><td>Zalecane 15 mm</td></tr><tr><td>Anasys AFM-IR nanoIR2</td><td>Anaysys Instruments</td><td></td><td>model: nanoIR2</td></tr><tr><td>Tryb kontaktowy Sondy NIR2 dla nanoIR 2</td><td>Bruker / Anasys</td><td></td> <td>Instruments-Model: Model: PR-EX-NIR2</td></tr><tr><td>Mikrowirówka Heraeus Pico 17</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td> <td>Inc-Oprogramowanie</td> <td>do analizy danych wielowymiarowych</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Heathrow Scientific&nbsp;</td><td>HEA4323</td><td>Może być zastąpiony dowolnym innym mikroprobówką wirówkową</td></tr><tr><td>NanoIR 2 Przyrząd</td><td>Bruker / Anasys Instruments</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Skrzynka narzędziowa PLS</td><td>Mathworks</td> <td>Inc-GUI</td> <td>dla Matlab</td></tr><tr><td>Wybrane podłoże bakteryjne (np. HBA Columbia Plates)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PP2001</td><td>Podany rodzaj podłoża jest przykładowy i może być zastąpiony innymi, w zależności od rodzaju eksperymentu</td></tr><tr><td>Wybrany szczep bakteryjny</td> <td>-</td><td></td> <td>źródło zależy od celu badań (izolaty pacjenta, szczepy ATCC itp.)</td></tr><tr><td>Podłoże (np. klasa ramanowska CaF2)</td><td>Crystran</td><td>CAFP13-2R</td><td>Zalecany rozmiar: 13 mm i Oslash; x 2,0 mm</td></tr><tr><td>Pipeta z końcówką 1000 &micro; l</td><td>Pipeta Axygen</td><td>T-1000-B-Tip</td><td></td></tr> <tr><td>200 i mikro; l</td><td>Pipeta Axygen</td><td>T-200-C-Tip</td><td></td></tr> <tr><td>0,5-10 i mikro; l</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-Ultraczysta</td><td></td></tr> <tr><td>woda</td> <td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Mikroskopia sił atomowych - Spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) to nowatorska technika kombinacyjna, umożliwiająca jednoczesną charakterystykę właściwości fizycznych i składu chemicznego próbki z rozdzielczością nanoskali. Dzięki połączeniu AFM z IR przezwyciężono ograniczenia rozdzielczości przestrzennej konwencjonalnej IR, co umożliwiło osiągnięcie rozdzielczości 20–100 nm. Otwiera to drzwi do szerokiego wachlarza nowych zastosowań podczerwieni w kierunku sondowania próbek mniejszych niż kilka mikrometrów, co wcześniej było nieosiągalne za pomocą konwencjonalnej mikroskopii w podczerwieni. AFM-IR doskonale nadaje się do badań nad bakteriami, dostarczając zarówno informacji spektralnych, jak i przestrzennych na poziomie pojedynczej komórki i wewnątrzkomórkowym. Rosnące globalne obawy zdrowotne i niekorzystne prognozy dotyczące infekcji bakteryjnych, a zwłaszcza szybki rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, stworzyły pilne zapotrzebowanie na narzędzie badawcze zdolne do sondowania fenotypowego na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki. AFM-IR oferuje potencjał, aby zaspokoić tę potrzebę, umożliwiając szczegółową charakterystykę składu chemicznego pojedynczej bakterii. W tym miejscu udostępniamy kompletny protokół przygotowania próbek i pozyskiwania danych o pojedynczych widmach i modalności mapowania, w celu zastosowania AFM-IR w badaniach bakteryjnych.

Opisany protokół umożliwia uzyskanie różnych typów rozkładu komórek bakterii na podłożu, w zależności od początkowego stężenia próbki oraz ilości dodanej wody. Rysunek 1 przedstawia przykłady obrazów AFM (wysokości i ugięcia), zarejestrowanych z próbek単warstwowych i pojedynczych komórek przygotowanych zgodnie z opisanym protokołem z bakterii Gram-dodatnich (S. aureus) oraz Gram-ujemnych (Escherichia coli).
Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do obrazowania AFM-IR struktur wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych pojedynczych bakterii. Przykład takiego zastosowania przedstawiono na Rysunku 2, który demonstruje wyniki monitorowania lokalnych zmian chemicznych zachodzących podczas podziału komórki S. aureus. Chociaż suszenie na powietrzu jest powszechnie uważane za metodę utrwalania preparatów bakteryjnych, bakterie z natury wykazują bardzo wysoką odporność na czynniki zewnętrzne, takie jak temperatura, i zgłaszano ich przeżycie po dehydratacji32. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano z próbki suszonej na powietrzu. Formowanie się przegrody, zachodzące przed podziałem komórki, było obserwowane i monitorowane za pomocą obrazowania AFM (Rysunek 2A–D) poprzez następczą akwizycję 12 obrazów tego samego obszaru (pozyskanie jednego obrazu ≈ 20 min). Rysunek 2A–D przedstawia 4 wybrane obrazy AFM, z odstępem czasu między akwizycjami poszczególnych obrazów wynoszącym około 40 min. Utworzona struktura (przegroda) ma wysokość 45 nm. Sformowana przegroda jest wyraźnie widoczna na obrazach wysokości i ugięcia AFM (Rysunek 2E–F). Widma AFM-IR zarejestrowane z obszaru komórki i przegrody (Rysunek 2G, punkty pochodzenia zaznaczone na Rysunku 2F) zostały przed porównaniem znormalizowane do pasma amidowego I, aby zminimalizować wpływ zmiennej grubości próbki między punktami zbierania danych. Widmo AFM-IR przegrody charakteryzuje się wyższą intensywnością względną pasm przy 1240 i 1090 cm-1 w porównaniu do widma AFM-IR pobranego z obszaru komórki. Przypisuje się je grupom węglowodanowym i fosfodiestrowym składników ściany komórkowej (w tym np. peptydoglikanu i kwasów teichoowych)22.
Opisany protokół można również wykorzystać do porównania pojedynczego widma pomiędzy wieloma różnymi próbkami. Przykład takiego zastosowania wraz z wynikami przedstawiono na Ryc. 3 oraz Ryc. 4. Celem badania jest określenie zmian chemicznych zachodzących w wyniku rozwoju in vivo przerywanej oporności na wankomycynę u S. aureus (VISA). W tym celu od pacjentów pobrano kliniczne pary próbek, w których szczep rodzicielski wyizolowano przy przyjęciu do szpitala i przed terapią antybiotykową (wrażliwy na wankomycynę S. aureus, VSSA), a szczep potomny wyizolowano od tego samego pacjenta po podaniu antybiotyków i niepowodzeniu klinicznym. Próbki następnie hodowano na podłożu agarowym i przygotowano zgodnie z protokołem (Ryc. 3A–B). Widma AFM-IR zarejestrowano dla wielu pojedynczych bakterii (oraz wielu próbek) dla VSSA i VISA, a następnie przeanalizowano przy użyciu kilku podejść chemometrycznych (Ryc. 3C).
Nie zaobserwowano różnic morfologicznych między komórkami VSSA i VISA (Rysunek 4A–C). Jednak widma AFM-IR (Rysunek 4D,F) oraz ich drugie pochodne (Rysunek 4E,G) wykazały wyraźną różnicę w składzie chemicznym między szczepami opornymi a podatnymi. Względna intensywność pasm związanych z grupami węglowodanowymi i fosfodiestrowymi z komponentów ściany komórkowej (w szczególności pasma przy 1088 cm-1) wyraźnie wzrosła w szczepie opornym w porównaniu z odpowiednikiem podatnym. Warto zauważyć, że wszystkie zarejestrowane widma (VISA: 81, VSSA: 88) wykazują małe odchylenie standardowe. Świadczy to o dobrej powtarzalności danych zarejestrowanych z różnych próbek przygotowanych z tego samego szczepu, ponieważ nie było możliwe rozróżnienie między widmami zarejestrowanymi z różnych próbek tego samego szczepu. Zaobserwowane różnice wskazały na zwiększoną grubość ściany komórkowej w szczepach opornych w porównaniu z odpowiednikiem podatnym, co pozostaje w zgodzie z innymi doniesieniami literaturowymi33,34.
<img alt="Obrazy AFM bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych; analiza struktury powierzchni; porównanie mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy AFM różnych próbek bakterii do pomiarów AFM-IR. W zależności od rozcieńczenia na podłożu, protokół pozwala na uzyskanie wielowarstw i monowarstw bakterii, a także próbek pojedynczych komórek. Reprezentatywne obrazy AFM dla: (A–D) monowarstwy i (E–H) pojedynczej komórki dla bakterii (A,B,E,F) Gram-dodatnich (S. aureus) oraz (C,D,G,H) Gram-ujemnych (E. coli). (A,C,E,G) przedstawiają obrazy wysokości, a (B,D,F,H) odpowiadające im obrazy ugięcia. Rozmiar obrazowanych obszarów: (A-D,G,H) 20 x 20 µm, (E,F) 50 x 50 µm. (I–K) kolejny etap wyboru obszaru do mapowania AFM-IR. Jest to realizowane za pomocą obrazowania AFM z coraz większą rozdzielczością przestrzenną na przykładzie pojedynczej komórki S. aureus. Każdy obraz jest zbierany poprzez próbkowanie 200 x 200 punktów, przy czym rozdzielczość przestrzenna rośnie wraz ze zmniejszeniem rozmiaru obrazowanego obszaru. Rozmiar obrazowanych obszarów: (I) 40 x 40 µm, (J) 20 x 20 µm oraz (K) 2,24 x 2,24 µm. Czarny kwadrat na obrazie (I) zaznacza obszar obrazowany na (J). Czarny kwadrat na obrazie (J) zaznacza obszar obrazowany na (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii sił atomowych, analiza topografii powierzchni; skala 500 nm; porównanie danych spektralnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Monitorowanie podziału komórek S. aureus za pomocą AFM-IR. (A–D) Obrazy AFM komórki S. aureus pokazujące tworzenie się przegrody poprzedzające podział komórki. Rozmiar obrazowanego obszaru: 2 x 2 µm. Obrazy zostały wybrane z większej serii (12 obrazów rejestrowanych co 20 min) i reprezentują dane zarejestrowane co 40 min. (E–F) Obraz wysokości i ugięcia AFM zarejestrowany pod koniec tworzenia się przegrody komórkowej z zaznaczonymi punktami pomiaru widm AFM-IR. Rozmiar obrazowanego obszaru 1,17 x 1,15 µm. Wysokość nowo powstałej struktury wynosi 45 nm. (G) Widma AFM-IR zarejestrowane z obszaru komórki (czarny) i obszaru przegrody (czerwony) (zaznaczone na (F)), w zakresie 1400–900 cm-1. Oba widma zostały znormalizowane do pasma amidu I i wykazują wzrost względnej intensywności komponentów ściany komórkowej w obrębie przegrody. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy K. Kochan et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozwój oporności na antybiotyki; schemat eksperymentalny; spektroskopia, analiza, dendrogram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przegląd projektu eksperymentalnego dla badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe przy użyciu AFM-IR. (A) Pochodzenie i wstępne przygotowanie próbek: wrażliwy szczep rodzicielski pobrano od pacjenta przed antybiotykoterapią, a oporny szczep potomny pozyskano od tego samego pacjenta po antybiotykoterapii i niepowodzeniu klinicznym (rozwój oporności in vivo). Bakterie wyizolowano i hodowano na agarze Heart Infusion (HI) przez 16 h w 37 ˚C. (B) Następne przygotowanie próbki do AFM-IR, obejmujące pobranie próbki, a następnie płukanie osadu bakteryjnego (3×) i osadzanie próbki. (C) Gromadzenie i analiza danych AFM-IR: wysokość AFM i widmo AFM-IR (1800–900 cm-1). Rozmiar obszaru obrazowania AFM: 1,7 x 1,4 µm. Widmo AFM-IR zostało zarejestrowane z centrum komórki. Dane następnie przeanalizowano za pomocą metod chemometrycznych, w tym hierarchicznej analizy skupień. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia sił atomowych i analiza spektralna; mapy topograficzne (A-C) i widma Ramana (D-G)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki AFM i AFM-IR badania zmian chemicznych w szczepach S. aureus o pośredniej wrażliwości na wankomycynę (VISA) w porównaniu do szczepów S. aureus wrażliwych na wankomycynę (VSSA) w parach klinicznych.Obrazy AFM próbek pojedynczych komórek (A–B) VISA oraz (C) VSSA. Rozmiar obrazowanych obszarów: (A,C) 40 x 40 µm, (B) 2,56 x 2,45 µm. (D–E) Średnie widma AFM-IR oraz ich (F–G) drugie pochodne dla: (D,F) komórek VISA i (E,G) komórek VSSA, w zakresie spektralnym 1800–900 cm-1. Przedstawione widma są średnią z 81 (VISA) i 88 (VSSA) pojedynczych widm i są zaprezentowane wraz z odchyleniem standardowym (SD). Uśrednianie przeprowadzono po wspólnej normalizacji wszystkich pojedynczych widm. Główne pasma są zaznaczone w (F–G). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki spektroskopii w podczerwieni pokazujące zmienność absorpcji w nm, obrazowanie spektralne, analiza naukowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Dryft obrazu podczas następujących po sobie rejestracji map AFM-IR przy wybranych wartościach liczby falowej dla komórki S. aureus.(Górny rząd): Obrazy AFM rejestrowano jednocześnie z odpowiadającymi im (dolny rząd) mapami AFM-IR, opartymi na intensywności sygnału IR przy wybranych wartościach liczby falowej. Wartości liczby falowej (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm-1) są naniesione nad dolnym rzędem. Każdy zestaw (obraz AFM i mapa AFM-IR) rejestrowano bezpośrednio po poprzednim obrazie (około 40 min na zestaw). Rozmiar obrazowanego/mapowanego obszaru: 1,54 x 1,57 µm. Między obrazami widoczny jest wyraźny dryft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Metoda ta pozwala na prowadzenie badań bakterii w skali nano. Dostarcza nam szczegółowych informacji na temat zmian chemicznych w oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W związku z tym może przyczynić się do lepszego zrozumienia oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i opracowywania leków.Rozmiary bakterii w skali nano znacznie ograniczają dostępne narzędzia badawcze zdolne do badania ich składu chemicznego. AFM-IR pozwala nam robić to w sposób nieniszczący, niezależny od obserwatora, nawet na poziomie subkomórkowym. Dostarczając informacji na temat oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, metoda ta może pomóc w identyfikacji i testowaniu celów molekularnych dla nowych środków przeciwdrobnoustrojowych.Oprócz bakterii, AFM-IR może badać szereg komórek, tkanek, a nawet wirusów. Aby przygotować próbkę do obrazowania w podczerwieni AFM-IR, po wyhodowaniu interesujących bakterii na odpowiedniej pożywce w odpowiednich warunkach hodowli, należy użyć sterylnej pętli, aby ostrożnie pobrać bakterie z wierzchu kolonii w celu przeniesienia do szklanej probówki. Dodaj jeden mililitr ultraczystej wody do probówki i wiruj przez jedną do dwóch minut, aż zebrane osady bakteryjne przestaną być widoczne na dnie probówki.Oszacuj przybliżone zmętnienie roztworu poprzez wizualne porównanie przygotowanego roztworu ze standardami McFarlanda. Jeśli zmętnienie zawiesiny bakteryjnej wydaje się być bardzo niskie, kontynuuj dodawanie większej ilości bakterii i wirowanie, aż szorstkie zmętnienie roztworu będzie porównywalne ze wzorcami McFarlanda 0,5 i 1. Bakterie osadzić przez odwirowanie i ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety.Ponownie zawiesić osad komórek bakteryjnych w jednym mililitrze ultraczystej wody z wirowaniem i osadnić bakterie za pomocą kolejnego wirowania. Po umyciu bakterii do trzech razy więcej, jak to właśnie pokazano, odessać supernatant i wirować osad przez co najmniej dwie minuty przed dodaniem pięciu mikrolitrów komórek do eksperymentalnego podłoża. Jeśli pożądana grubość to monowarstwa lub pojedyncze bakterie, natychmiast po osadzeniu dodaj do podłoża od 20 do 100 mikrolitrów ultraczystej wody i delikatnie wymieszaj roztwór końcówką pipety.Gdy próbka wyschnie na powietrzu, użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby zamontować podłoże na metalowym krążku próbki AFM. Aby przygotować przyrząd do spektroskopii AFM-IR do analizy, po włączeniu oprogramowania i lasera naciśnij przycisk Inicjalizuj i potwierdź, że migawka lasera jest w pozycji otwartej. Podczas tego procesu pojawi się okno Inicjalizacja etapu.Po zakończeniu procesu inicjalizacji kliknij przycisk Zainicjuj i OK. Jeśli to możliwe, włącz przepływ azotu, aby oczyścić przyrząd azotem i wyreguluj przedmuchiwanie azotem, aby osiągnąć stabilny poziom wilgotności. Ostrożnie umieść próbkę w komorze na próbkę, nie uszkadzając końcówki i kliknij przycisk Załaduj w oprogramowaniu. Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora, aby załadować próbkę, koncentrując się na końcówce i próbce w każdym kroku.Następnie kliknij przycisk Approach, aby podejść do próbki bez angażowania się. Przed włączeniem próbki wybierz Narzędzia, Kalibracja tła IR i Nowy. W wyskakującym oknie ustaw rozdzielczość i zakres spektralny zgodnie z celem analizy oraz ustaw współśrednie i tła na wartości średnie.Wybierz opcję Włącz. W wyskakującym okienku ustaw parametry początkowe i końcowe, a następnie kliknij przycisk Zaakceptuj i pobierz. Po pobraniu danych w tle kliknij przycisk Zapisz.Aby połączyć końcówkę z próbką, kliknij przycisk Włącz. System będzie zbliżał się do powierzchni próbki, dopóki nie zostanie wykryty bezpośredni kontakt. Kliknij przycisk Skanuj, aby zebrać początkowy obraz AFM o większym obszarze i niskiej rozdzielczości przestrzennej w celu wizualizacji powierzchni przed przesunięciem końcówki do interesującego miejsca pomiaru.Aby wyrównać laser na podczerwień do liczby fali, przy której próbka będzie absorbować, wprowadź numer fali, przy której próbka będzie absorbować w polu Numer fali, a następnie kliknij przycisk Start, IR.At na wykresie amplitudy w funkcji częstotliwości należy zaobserwować co najmniej jeden wyraźny pik. Wykres ugięcia w funkcji czasu powinien pokazywać okresową formę fali. Kliknij przycisk Optymalizuj, aby wybrać konwencjonalne widmo bakterii w podczerwieni w celu zidentyfikowania pozycji pasm i użyć widma do optymalizacji gorących punktów przy różnych wartościach liczby fal z różnych obszarów widma.Po zoptymalizowaniu plamek podczerwieni dla wybranych wartości liczby fal zdefiniuj rozdzielczość i zakres widma oraz liczbę współśrednich, a następnie kliknij przycisk Acquire, aby zebrać widmo AFM-IR. Aby zebrać obraz rozkładu intensywności dla wybranej wartości liczby falowej, po zarejestrowaniu pojedynczego widma AFM-IR nagraj obraz AFM wybranego obszaru próbki i wybierz wartości liczby fali dla obrazowania AFM-IR. Upewnij się, że plamka IR lasera została zoptymalizowana dla wybranych wartości liczby fali i ustaw liczbę punktów danych w kierunkach X i Y obszaru obrazu.W oknie Ogólne ustaw moc lasera. W oknie AFM Scan (Skanowanie AFM) zdefiniuj szybkość skanowania. Następnie zaznacz pole Włącz obrazowanie w podczerwieni i kliknij Skanuj, aby rozpocząć obrazowanie.AFM-IR intensywności sygnału o wybranej liczbie fali zostanie zebrany jednocześnie z danymi AFM z tego obszaru. Protokół ten umożliwia pozyskiwanie szeregu rodzajów rozmieszczenia komórek bakterii na podłożu, od pojedynczych komórek po monowarstwy i wielowarstwy. Protokół może być stosowany do monitorowania dynamicznych zmian w żywych bakteriach.Na przykład w tworzeniu przegrody podczas podziału komórek S.aureus. Widmo AFM-IR przegrody charakteryzowało się większą względną intensywnością pasm na wysokości 1, 240 i 1 090 centymetrów w porównaniu z widmami AFM-IR pobranymi z obszaru komórki, co sugeruje, że przegroda składa się z grup węglowodanowych i fosfodiestrowych składników ściany komórkowej. Protokół może być również wykorzystany do badania różnic w składzie chemicznym wynikających z rozwoju oporności.Jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie, nie zmierzono różnic morfologicznych między przerywaną opornością na wankomycynę a komórkami S.aureus wrażliwymi na wankomycynę. Ocena widm AFM-IR i ich drugich pochodnych wykazała jednak wyraźny wzrost względnej intensywności pasm związanych z grupami węglowodanowymi i fosfodiestrowymi ze składników ściany komórkowej w odpornym szczepie w porównaniu z podatnym odpowiednikiem. Ważne jest, aby przygotować czystą próbkę, dlatego należy zadbać o to, aby od samego początku zmniejszyć zawartość podłoża i całkowicie usunąć je z wielokrotnego mycia.Ponieważ AFM-IR jest techniką nieniszczącą, próbka może być później badana za pomocą innych technik, takich jak barwienie lub spektroskopia jonów konfokalnych, które mogą dostarczyć uzupełniających informacji na temat ich składu chemicznego.

atomic-force-microscopy-combined-with-infrared-spectroscopy-as-tool

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający użycie mikroskopii siły sondy Kelvina jako narzędzia do generowania wysokiej rozdzielczości nanoskalowych map potencjału powierzchniowego. Narzędzie to zastosowano do oceny wpływu potencjału powierzchniowego na zdolność wiązania mikroorganizmów z powierzchniami podłoża.

Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru siły oddziaływań między dobrze zdefiniowaną powierzchnią nieorganiczną a peptydami lub aminokwasami za pomocą pomiarów spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Informacje uzyskane z pomiaru są ważne dla lepszego zrozumienia interakcji peptyd-materiał nieorganiczny.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Tutaj prezentujemy zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) jako prostej i szybkiej metody charakteryzacji bakterii i analizujemy szczegóły, takie jak rozmiar i kształt bakterii, biofilmy kultur bakteryjnych oraz aktywność nanocząsteczek jako środków bakteriobójczych.

Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych

Poznaj mikroskopię sił atomowych ze spektroskopią w podczerwieni do badania chemii bakterii na poziomie nanometrycznym. Ta metoda pozwala analizować zmiany chemiczne związane z opornością na antybiotyki.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Przeglądaj więcej filmów