Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii
15 września 2020
Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.
Metoda ta pozwala na prowadzenie badań bakterii w skali nano. Dostarcza nam szczegółowych informacji na temat zmian chemicznych w oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W związku z tym może przyczynić się do lepszego zrozumienia oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i opracowywania leków.
Rozmiary bakterii w skali nano znacznie ograniczają dostępne narzędzia badawcze zdolne do badania ich składu chemicznego. AFM-IR pozwala nam robić to w sposób nieniszczący, niezależny od obserwatora, nawet na poziomie subkomórkowym. Dostarczając informacji na temat oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, metoda ta może pomóc w identyfikacji i testowaniu celów molekularnych dla nowych środków przeciwdrobnoustrojowych.
Oprócz bakterii, AFM-IR może badać szereg komórek, tkanek, a nawet wirusów. Aby przygotować próbkę do obrazowania w podczerwieni AFM-IR, po wyhodowaniu interesujących bakterii na odpowiedniej pożywce w odpowiednich warunkach hodowli, należy użyć sterylnej pętli, aby ostrożnie pobrać bakterie z wierzchu kolonii w celu przeniesienia do szklanej probówki. Dodaj jeden mililitr ultraczystej wody do probówki i wiruj przez jedną do dwóch minut, aż zebrane osady bakteryjne przestaną być widoczne na dnie probówki.
Oszacuj przybliżone zmętnienie roztworu poprzez wizualne porównanie przygotowanego roztworu ze standardami McFarlanda. Jeśli zmętnienie zawiesiny bakteryjnej wydaje się być bardzo niskie, kontynuuj dodawanie większej ilości bakterii i wirowanie, aż szorstkie zmętnienie roztworu będzie porównywalne ze wzorcami McFarlanda 0,5 i 1. Bakterie osadzić przez odwirowanie i ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety.
Ponownie zawiesić osad komórek bakteryjnych w jednym mililitrze ultraczystej wody z wirowaniem i osadnić bakterie za pomocą kolejnego wirowania. Po umyciu bakterii do trzech razy więcej, jak to właśnie pokazano, odessać supernatant i wirować osad przez co najmniej dwie minuty przed dodaniem pięciu mikrolitrów komórek do eksperymentalnego podłoża. Jeśli pożądana grubość to monowarstwa lub pojedyncze bakterie, natychmiast po osadzeniu dodaj do podłoża od 20 do 100 mikrolitrów ultraczystej wody i delikatnie wymieszaj roztwór końcówką pipety.
Gdy próbka wyschnie na powietrzu, użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby zamontować podłoże na metalowym krążku próbki AFM. Aby przygotować przyrząd do spektroskopii AFM-IR do analizy, po włączeniu oprogramowania i lasera naciśnij przycisk Inicjalizuj i potwierdź, że migawka lasera jest w pozycji otwartej. Podczas tego procesu pojawi się okno Inicjalizacja etapu.
Po zakończeniu procesu inicjalizacji kliknij przycisk Zainicjuj i OK. Jeśli to możliwe, włącz przepływ azotu, aby oczyścić przyrząd azotem i wyreguluj przedmuchiwanie azotem, aby osiągnąć stabilny poziom wilgotności. Ostrożnie umieść próbkę w komorze na próbkę, nie uszkadzając końcówki i kliknij przycisk Załaduj w oprogramowaniu. Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora, aby załadować próbkę, koncentrując się na końcówce i próbce w każdym kroku.
Następnie kliknij przycisk Approach, aby podejść do próbki bez angażowania się. Przed włączeniem próbki wybierz Narzędzia, Kalibracja tła IR i Nowy. W wyskakującym oknie ustaw rozdzielczość i zakres spektralny zgodnie z celem analizy oraz ustaw współśrednie i tła na wartości średnie.
Wybierz opcję Włącz. W wyskakującym okienku ustaw parametry początkowe i końcowe, a następnie kliknij przycisk Zaakceptuj i pobierz. Po pobraniu danych w tle kliknij przycisk Zapisz.
Aby połączyć końcówkę z próbką, kliknij przycisk Włącz. System będzie zbliżał się do powierzchni próbki, dopóki nie zostanie wykryty bezpośredni kontakt. Kliknij przycisk Skanuj, aby zebrać początkowy obraz AFM o większym obszarze i niskiej rozdzielczości przestrzennej w celu wizualizacji powierzchni przed przesunięciem końcówki do interesującego miejsca pomiaru.
Aby wyrównać laser na podczerwień do liczby fali, przy której próbka będzie absorbować, wprowadź numer fali, przy której próbka będzie absorbować w polu Numer fali, a następnie kliknij przycisk Start, IR.At na wykresie amplitudy w funkcji częstotliwości należy zaobserwować co najmniej jeden wyraźny pik. Wykres ugięcia w funkcji czasu powinien pokazywać okresową formę fali. Kliknij przycisk Optymalizuj, aby wybrać konwencjonalne widmo bakterii w podczerwieni w celu zidentyfikowania pozycji pasm i użyć widma do optymalizacji gorących punktów przy różnych wartościach liczby fal z różnych obszarów widma.
Po zoptymalizowaniu plamek podczerwieni dla wybranych wartości liczby fal zdefiniuj rozdzielczość i zakres widma oraz liczbę współśrednich, a następnie kliknij przycisk Acquire, aby zebrać widmo AFM-IR. Aby zebrać obraz rozkładu intensywności dla wybranej wartości liczby falowej, po zarejestrowaniu pojedynczego widma AFM-IR nagraj obraz AFM wybranego obszaru próbki i wybierz wartości liczby fali dla obrazowania AFM-IR. Upewnij się, że plamka IR lasera została zoptymalizowana dla wybranych wartości liczby fali i ustaw liczbę punktów danych w kierunkach X i Y obszaru obrazu.
W oknie Ogólne ustaw moc lasera. W oknie AFM Scan (Skanowanie AFM) zdefiniuj szybkość skanowania. Następnie zaznacz pole Włącz obrazowanie w podczerwieni i kliknij Skanuj, aby rozpocząć obrazowanie.
AFM-IR intensywności sygnału o wybranej liczbie fali zostanie zebrany jednocześnie z danymi AFM z tego obszaru. Protokół ten umożliwia pozyskiwanie szeregu rodzajów rozmieszczenia komórek bakterii na podłożu, od pojedynczych komórek po monowarstwy i wielowarstwy. Protokół może być stosowany do monitorowania dynamicznych zmian w żywych bakteriach.
Na przykład w tworzeniu przegrody podczas podziału komórek S.aureus. Widmo AFM-IR przegrody charakteryzowało się większą względną intensywnością pasm na wysokości 1, 240 i 1 090 centymetrów w porównaniu z widmami AFM-IR pobranymi z obszaru komórki, co sugeruje, że przegroda składa się z grup węglowodanowych i fosfodiestrowych składników ściany komórkowej. Protokół może być również wykorzystany do badania różnic w składzie chemicznym wynikających z rozwoju oporności.
Jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie, nie zmierzono różnic morfologicznych między przerywaną opornością na wankomycynę a komórkami S.aureus wrażliwymi na wankomycynę. Ocena widm AFM-IR i ich drugich pochodnych wykazała jednak wyraźny wzrost względnej intensywności pasm związanych z grupami węglowodanowymi i fosfodiestrowymi ze składników ściany komórkowej w odpornym szczepie w porównaniu z podatnym odpowiednikiem. Ważne jest, aby przygotować czystą próbkę, dlatego należy zadbać o to, aby od samego początku zmniejszyć zawartość podłoża i całkowicie usunąć je z wielokrotnego mycia.
Ponieważ AFM-IR jest techniką nieniszczącą, próbka może być później badana za pomocą innych technik, takich jak barwienie lub spektroskopia jonów konfokalnych, które mogą dostarczyć uzupełniających informacji na temat ich składu chemicznego.
Przegląd
Spektroskopia podczerwieni sprzężona z skaningową mikroskopią sił atomowych (AFM-IR) umożliwia badania bakterii w nanoskali, dostarczając informacji o zmianach chemicznych związanych z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Metoda ta pozwala na nieniszczącą analizę na poziomie podkomórkowym, pogłębiając naszą wiedzę o mechanizmach oporności na leki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Biofizyka
Wprowadzenie
- AFM-IR stanowi potężną platformę do badania bakterii.
- Nanometryczna wielkość bakterii ogranicza dostępność narzędzi badawczych.
- Zrozumienie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) jest kluczowe dla opracowywania leków.
- AFM-IR umożliwia analizę różnych próbek biologicznych, w tym komórek i tkanek.
Cel badania
- Badanie zmian chemicznych w bakteriach związanych z AMR.
- Identyfikacja celów molekularnych dla nowych środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Monitorowanie dynamicznych zmian w żywych bakteriach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbki obejmuje hodowlę bakterii oraz mieszanie w wstrząsarku typu vortex.
- Obrazowanie AFM-IR wykonuje się po naniesieniu próbki na podłoże.
- Kluczowymi etapami są kalibracja instrumentu oraz akwizycja danych tła.
- Gromadzenie danych obejmuje obrazy AFM i widma podczerwone.
Główne wyniki
- AFM-IR pozwala na rozróżnienie różnic w składzie chemicznym bakterii opornych.
- W przegrodzie podczas podziału komórki zaobserwowano pasma o wyższej intensywności.
- Nie odnotowano różnic morfologicznych pomiędzy szczepami opornymi a wrażliwymi.
- Widma AFM-IR dostarczyły istotnych informacji na temat składników ścian komórkowych bakterii.
Wnioski
- AFM-IR jest cennym narzędziem do badania chemii bakterii.
- Metoda ta pogłębia zrozumienie mechanizmów AMR.
- Może ona ułatwić opracowanie nowych strategii przeciwdrobnoustrojowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technika AFM-IR umożliwia nanostrukturę analizy chemicznej pojedynczych bakterii, odpowiadając na krytyczną potrzebę badania fenotypowego w badaniach nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Dzięki jednoczesnemu dostarczaniu danych przestrzennych i spektralnych z rozdzielczością poniżej poziomu komórkowego, metoda ta wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania nowych antybiotyków. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji celów molekularnych i monitorowaniu mechanizmów oporności, co bezpośrednio wpływa na identyfikację wiodących związków oraz decyzje na etapie przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie zmian w składzie chemicznym z fenotypami oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.
- Wartość operacyjna: Zapewnia niedestrukcyjny, niezależny od obserwatora profil chemiczny na poziomie pojedynczych komórek w celu walidacji funkcjonalnych celów.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność przewidywań dzięki bezpośredniej obserwacji zmian w składnikach ścian komórkowych u szczepów opornych.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy bakteryjne do dalszych etapów analizy poprzez usunięcie składników pożywki za pomocą standaryzowanych protokołów płukania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki kontrolowanemu nanoszeniu próbek oraz przygotowaniu podłoża, co pozwala na spójne pozyskiwanie danych AFM-IR.
- Wartość naukowa: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez rejestrację obrazów rozkładu intensywności przy określonych liczbach falowych w celu mapowania zmian chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność kliniczną poprzez badanie składu chemicznego wynikającego z rozwoju oporności w szczepach o znaczeniu klinicznym, takich jak S. aureus.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając analizę po AFM-IR za pomocą technik komplementarnych, takich jak barwienie lub spektroskopia konfokalna.
- Wartość naukowa: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez odróżnianie szczepów opornych i wrażliwych za pomocą biomarkerów widmowych, bez polegania na różnicach morfologicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
AFM-IR wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez w biologii podstawowej po identyfikację wiodących związków i walidację przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne cykle projektowania, wytwarzania i testowania w opracowywaniu antybiotyków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez wykrywanie zmian chemicznych w tworzeniu przegrody oraz w składnikach ściany komórkowej podczas podziału bakterii i rozwoju oporności.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu przygotowaniu zawiesiny bakteryjnej z wykorzystaniem wzorców mętności McFarlanda oraz sekwencyjnych etapów przemywania.
- Analityka: Generuje ilościowe widma podczerwieni oraz analizę drugiej pochodnej w celu porównania szczepów opornych i wrażliwych na podstawie intensywności pasm przy 1,240 i 1,090 cm⁻¹.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając pobieranie nieinwazyjnych próbek do późniejszej walidacji za pomocą metod ortogonalnych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do badania różnorodnych próbek biologicznych, w tym komórek, tkanek i wirusów, poza zakresem badań bakteryjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Większa pewność predykcyjna w identyfikacji celów, ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w mechanizmach oporności oraz redukcja ryzyka fenotypowego w przypadku kandydatów na antybiotyki.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja dzięki przygotowaniu próbek z wykorzystaniem wstrząsania w wirułku, powtarzalność dzięki współuśredzaniu kalibracji tła oraz skalowalność od mapowania pojedynczych komórek do warstw monowarstwowych.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go dzięki bezpośredniej detekcji chemicznych biomarkerów, efektywność kapitałowa we wczesnym screeningu celów oraz zmniejszenie częstotliwości niepowodzeń na późnym etapie z powodu nieprzewidzianych mechanizmów oporności.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja leadów w oparciu o ryzyko poprzez identyfikację biosyntezy ściany komórkowej jako szlaku związanego z opornością, co umożliwia postęp oparty na wiedzy o mechanizmach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikrobiologii w celu sterylnego obchodzenia się z bakteriami oraz biegłość w obsłudze aparatury AFM-IR w zakresie wyrównywania laserów i optymalizacji widm.
- Procedura zależy od dostępności spektrometru AFM-IR z możliwością płukania azotem, systemów wody ultraczystej oraz podłoży kompatybilnych z montażem adhezyjnym.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów płukania próbek w celu zminimalizowania interferencji pożywki i zapewnienia wierności widmowej.
- Należy uwzględnić modyfikacje w zależności od różnych gatunków bakterii, faz wzrostu i rodzajów podłoży, aby utrzymać stosunek sygnału do szumu.
- Metoda jest ograniczona koniecznością stosowania bibliotek referencyjnych widm w celu przypisania piku do konkretnych biomolekuł oraz czasem wymaganym dla mapowania punkt po punkcie w porównaniu do pomiarów IR objętościowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Atomic Force Microscopy-Infrared (AFM-IR) Spectroscopy Sample Preparation
2:50
Instrument Preparation
3:50
Single Spectrum Data Collection
5:42
Imaging Approach Data Collection
6:41
Results: Representative AFM-IR Analyses of Single Bacterium Chemistry
8:11
Conclusion
