Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA lub MAPS zostało opracowane w celu identyfikacji całego celu dowolnego RNA będącego przedmiotem zainteresowania u bakterii. Technologia ta umożliwia identyfikację dowolnego rodzaju partnerów sRNA niezależnie od mechanizmu regulacji. Charakterystyka sieci regulacyjnych zależnych od sRNA pomoże lepiej zrozumieć produkcję czynników wirulencji, tworzenie biofilmu i przetrwanie bakterii w komórkach gospodarza, a ostatecznie zwalczać infekcje gronkowcowe.

Protokół ten można zastosować do dowolnych chorobotwórczych lub niepatogennych bakterii Gram-dodatnich. Procedurę zademonstruje Noemie Mercier, doktorantka z laboratorium dr Pascala Romby'ego. Na początek wyhoduj jedną kolonię szczepów przenoszących plazmidy pCN51 P3 MS2 sRNA lub pCN51 P3 MS2 w trzech mililitrach pożywki BHI uzupełnionej 10 mikrogramami erytromycyny na mikrolitr w duplikatach.

Rozcieńczyć każdą nocną hodowlę w 50 mililitrach świeżej pożywki BHI uzupełnionej erytromycyną, aby osiągnąć OD 600 0,05. Hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 180 obr./min przez sześć godzin. Przenieś każdą kulturę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj probówki w temperaturze 2 900 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie wyrzuć supernatant, zamroź i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub trzymaj granulki na lodzie i bezpośrednio przeprowadź mechaniczną lizę komórek.

Aby przeprowadzić mechaniczną lizę komórek, ponownie zawieś granulki w pięciu mililitrach buforu A i przenieś zawieszone komórki do 15-mililitrowych probówek wirówkowych z 3,5 gramami kulek krzemionkowych. Włóż probówki do mechanicznego przyrządu do lizy komórek i uruchom cykl 40 sekund z prędkością czterech metrów na sekundę. Odwirować probówki w temperaturze 2 900 razy G przez 15 minut, a następnie odzyskać supernatant i utrzymać go na lodzie.

Upewnij się, że supernatant jest klarowny, powtarzając wirowanie, jeśli tak nie jest. Usuń końcówkę kolumny, a następnie umieść kolumnę chromatograficzną w stojaku kolumnowym i umyj kolumnę ultraczystą wodą. Dodać 300 mikrolitrów żywicy amylozowej i przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu A. Rozcieńczyć 1, 200 pikamoli białka MBP-MS2 w sześciu mililitrach buforu A i załadować go do kolumny.

Przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu A. Następnie przeprowadzić oczyszczanie z powinowactwem MS2. Załaduj lizat komórkowy do kolumny i zbierz frakcję przepływową do czystej probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę trzykrotnie 10 mililitrami buforu A i zebrać frakcję płuczką, następnie wymyć kolumnę jednym mililitrem buforu E i zebrać frakcję elucyjną w mikroprobówce o pojemności dwóch mililitrów.

Trzymaj wszystkie zebrane frakcje na lodzie do czasu ekstrakcji RNA. Użyj jednego mililitra każdej frakcji do ekstrakcji RNA. Dodaj jedną objętość fenolu do RNA i energicznie wymieszaj, a następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Przenieś górną fazę do czystej mikroprobówki o pojemności dwóch mililitrów. Dodać jedną objętość chloroformowego alkoholu izoamylowego i powtórzyć wirowanie, a następnie przenieść górną fazę do nowej probówki. Dodać 2,5 objętości 100% zimnego etanolu i 0,1 objętości trzymolowego octanu sodu o pH 5,2 i wytrącać przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odwiruj probówki przez 15 minut w temperaturze 16 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Powoli usuń etanol za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć granulki. Dodaj 500 mikrolitrów 80% zimnego etanolu i wiruj przez pięć minut.

Wyrzuć etanol, pipetując go powoli, a następnie wysusz granulat za pomocą koncentratora próżniowego przez pięć minut w trybie pracy. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości ultraczystej wody. Protokół ten został wykorzystany do zbadania celu RsaC w S.aureus.

Za pomocą technologii MAPS zidentyfikowano kilka mRNA oddziałujących bezpośrednio z RsaC, ujawniając ich kluczową rolę w stresie oksydacyjnym i reakcjach związanych z metalami. Aby potwierdzić konstrukty sRNA MS2 i uwidocznić ich wzorzec ekspresji, komórki zebrano po dwóch, czterech i sześciu godzinach wzrostu w pożywce BHI. Ekstrakcjo RNA i przeprowadzono analizę Northern blot przy użyciu sondy DIG specyficznej dla RsaC.

Poziom endogennego RsaC znacznie wzrósł po sześciu godzinach wzrostu. Co ważne, poziom MS2-RsaC 544 i MS2-RsaC 1, 116 był porównywalny z endogennym RsaC po sześciu godzinach. Przeprowadzono oczyszczanie powinowactwa i wyekstrahowano RNA z surowego ekstraktu, frakcji przepływowych i elucyjnych w szczepie typu dzikiego eksprymującym sam znacznik MS2 i zmutowanym szczepie RsaC wyrażającym konstrukt MS2-RsaC 544.

Długi endogenny RsaC nukleotydu 1,116 został wzbogacony we frakcję elucyjną, ale oddziaływał niespecyficznie z kolumną powinowactwa ze względu na swoją długość i złożoną strukturę drugorzędową. MS2-RsaC 544 został wysoce wzbogacony we frakcję elucyjną, co pokazuje, że został skutecznie zatrzymany przez białko fuzyjne MS2-MBP. Analiza bioinformatyczna ujawniła przypuszczalne cele mRNA zgodnie ze zmianą fałdowania między sRNA MS2 a kontrolą MS2, co wskazuje, że sodA był pierwszym przypuszczalnym celem.

Analiza Northern blot przeprowadzona przez sondę DIG specyficzną dla sody A po oczyszczeniu z powinowactwem do MS2 pokazuje, że sodA był skutecznie wzbogacany MS2-RsaC 544 w porównaniu z kontrolą MS2. Próbując skorzystać z tego protokołu, należy pamiętać, że dodanie znacznika MS2 może wpłynąć na potwierdzenie, stabilność lub funkcję sRNA. Należy to uważnie monitorować.

MAPS zapewnia migawkę parowania celów sRNA-RNA. Dalsza walidacja eksperymentalna pozwoli odkryć ich funkcję. Technika ta stanowi potężne narzędzie do budowy sieci regulacyjnych sRNA u dowolnych bakterii.