Name: Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę MAPS do identyfikacji celów sRNA w bakteriach Gram-dodatnich przy użyciu oczyszczania powinowactwa MS2 i sekwencjonowania RNA. Technika ta ujawnia sieci regulacyjne wpływające na czynniki wirulencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, oraz ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, do PR). Został on również opublikowany w ramach labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 oraz ANR-17-EURE-0023 (do PR), jako finansowanie przez państwo zarządzane przez ANR w ramach programu Inwestycje na przyszłość. DL otrzymał wsparcie w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji "Maria Skłodowska-Curie" nr 753137-SaRNAReg. Prace w E. Massé Lab zostały wsparte grantami operacyjnymi z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) oraz National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.

<ol><li>Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadening+the+Definition+of+Bacterial+Small+RNAs%3A+Characteristics+and+Mechanisms+of+Action%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action.</a> Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).</li>
<li>Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Acting+Small+RNAs+and+Their+Effects+on+Gene+Expression+in+Escherichia+coli+and+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica.</a> EcoSal Plus. 9 (1), (2020).</li>
<li>Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA.</a> Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).</li>
<li>Adams, P. P., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+small+base-pairing+RNAs+derived+from+diverse+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524(2020).</li>
<li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+bacterial+small+RNA+target+prediction+programs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of bacterial small RNA target prediction programs.</a> RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).</li>
<li>Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+through+the+twists+and+turns+of+RNA+sequencing+technologies%3A+Application+to+bacterial+regulatory+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506(2020).</li>
<li>Wright, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CopraRNA+and+IntaRNA%3A+predicting+small+RNA+targets%2C+networks+and+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).</li>
<li>Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+new+RNA+classes+and+global+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins.</a> Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).</li>
<li>Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+RNA-seq+approaches+for+the+study+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens.</a> Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).</li>
<li>Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+Interactomes+of+ProQ+and+Hfq+Reveal+Overlapping+and+Competing+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles.</a> Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).</li>
<li>Melamed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Small+RNA-Target+Interactions+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria.</a> Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).</li>
<li>Iosub, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+CLASH+uncovers+sRNA-target+interaction+networks+linked+to+nutrient+availability+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Waters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+interactome+of+pathogenic+E.+revealed+through+crosslinking+of+RNase+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E.</a> The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+interactions+broaden+the+functions+of+the+RNA+chaperone+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq.</a> Current Genetics. , (2019).</li>
<li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li>
<li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10(2007).</li>
<li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone%2C+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li>
<li>Olejniczak, M., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProQ%2FFinO-domain+proteins%3A+another+ubiquitous+family+of+RNA+matchmakers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers.</a> Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3%27+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li>
<li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+%28MAPS%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li>
<li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA%3A+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li>
<li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li>
<li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li>
<li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li>
<li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+for+optimization+of+DNA+ligation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions.</a> Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li>
<li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Preparation+and+Electroporation+of+S.+aureus+and+S.+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).</li>
<li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).</li>
<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Reseaerch%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li>
<li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li>
<li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IntaRNA+2.0%3A+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li>
<li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+cooperation%3A+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zmodyfikowany protokół dla bakterii Gram-dodatnich Wstępny protokół MAPS został opracowany w celu zbadania interaktomu sRNA w organizmie modelowym E. coli20,30. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowany protokół, który jest odpowiedni do scharakteryzowania zależnych od sRNA sieci regulacyjnych w oportunistycznym ludzkim patogenie S. aureus i z pewnością można go przenieść na inne bakterie Gram-dodatnie, chorobotwórcze lub nie.<...

Setki, a może nawet tysiące małych regulatorowych RNA (sRNA) zostały zidentyfikowane w większości genomów bakteryjnych, ale funkcje zdecydowanej większości z nich pozostają niescharakteryzowane. Ogólnie rzecz biorąc, sRNA są krótkimi, niekodującymi cząsteczkami, odgrywającymi główną rolę w fizjologii bakterii i adaptacji do zmiennych środowisk1,2,3. Rzeczywiście, te makrocząsteczki znajdują się w centrum wielu skomplikowanych sieci regulacyjnych, wpływając na szlaki metaboliczne, reakcje na stres, ale także zjadliwość i oporność na antybiotyki. Logicznie rzecz biorąc, ich synteza jest wyzwalana przez określone bodźce środowiskowe (np. głód składników odżywczych, stresy oksydacyjne lub błonowe). Większość sRNA reguluje wiele docelowych mRNA na poziomie potranskrypcyjnym poprzez krótkie i nieciągłe parowanie zasad. Zazwyczaj zapobiegają one inicjacji translacji, konkurując z rybosomami o regiony inicjacji translacji4. Tworzenie dupleksów sRNA:mRNA często powoduje również aktywną degradację docelowego mRNA poprzez rekrutację specyficznych RNaz.
Charakterystyka celu sRNA (tj. całego zestawu jego docelowych RNA) pozwala na identyfikację szlaków metabolicznych, w które interweniuje, oraz potencjalnego sygnału, na który reaguje. W związku z tym funkcje specyficznego sRNA można ogólnie wywnioskować z jego celu. W tym celu opracowano kilka narzędzi do przewidywania in silico, takich jak IntaRNA i CopraRNA5,6,7. Opierają się one w szczególności na komplementarności sekwencji, energii parowania i dostępności potencjalnego miejsca interakcji w celu określenia przypuszczalnych partnerów sRNA. Jednak algorytmy predykcyjne nie uwzględniają wszystkich czynników wpływających na parowanie zasad in vivo, takich jak udział chaperonów RNA8 faworyzujących nieoptymalne interakcje lub koekspresję obu partnerów. Ze względu na ich nieodłączne ograniczenia, odsetek wyników fałszywie dodatnich narzędzi predykcyjnych pozostaje wysoki. Większość eksperymentalnych podejść na dużą skalę opiera się na wspólnym oczyszczaniu par sRNA:mRNA oddziałujących ze znakowanym białkiem wiążącym RNA (RBP)6,9. Na przykład metoda RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) zidentyfikowała dupleksy RNA oczyszczone z białkami opiekuńczymi RNA, takimi jak Hfq i ProQ, w Escherichia coli10,11. Podobna technologia zwana UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) została zastosowana do sRNazy E i sRNA związanych z Hfq w E. coli12,13. Pomimo dobrze opisanej roli Hfq i ProQ w regulacji za pośrednictwem sRNA u wielu bakterii8,14,15, regulacja oparta na sRNA wydaje się być niezależna od opiekuńczego RNA w kilku organizmach, takich jak S. aureus16,17,18. Nawet jeśli oczyszczanie dupleksów RNA w połączeniu z RNazami jest wykonalne, jak zademonstrowali Waters i współpracownicy13, pozostaje to trudne, ponieważ RNazy powodują ich szybką degradację. W związku z tym oczyszczanie MS2-Affinity w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA (MAPS) 19,20 stanowi solidną alternatywę dla takich organizmów.
W przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, MAPS wykorzystuje specyficzne sRNA jako przynętę do przechwytywania wszystkich oddziałujących RNA, a zatem nie polega na zaangażowaniu RBP. Cały proces jest przedstawiony w Rysunek 1. Krótko mówiąc, sRNA jest znakowane w 5' aptamerem MS2 RNA, który jest specyficznie rozpoznawany przez białko płaszcza MS2. Białko to jest łączone z białkiem wiążącym maltozę (MBP) w celu unieruchomienia na żywicy amylozy. Dlatego MS2-sRNA i jego partnerzy RNA są zatrzymywani na kolumnie chromatografii powinowactwa. Po elucji maltozą, oczyszczone RNA są identyfikowane za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, a następnie analizy bioinformatycznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Technologia MAPS ostatecznie rysuje mapę interakcji wszystkich potencjalnych interakcji zachodzących in vivo.
Technologia MAPS została pierwotnie zaimplementowana w niepatogennej bakterii Gram-ujemnej E. coli21. Co ciekawe, projekt MAPS pomógł zidentyfikować fragment pochodzący z tRNA, który specyficznie oddziałuje zarówno z sRNA RyhB, jak i RybB i zapobiega jakiemukolwiek szumowi transkrypcyjnemu sRNA w celu regulacji celów mRNA w warunkach nieindukujących. Następnie MAPS został z powodzeniem zastosowany do innych sRNA E. coli, takich jak DsrA22, RprA23, CyaR23 i GcvB24 (Tabela 1). Oprócz potwierdzenia wcześniej znanych celów, MAPS rozszerzyło cel tych dobrze znanych sRNA. Niedawno przeprowadzono MAPS w Salmonella Typhimurium i ujawniono, że sRNA SraL wiąże się z mRNA rho, kodując czynnik terminacji transkrypcji25. Dzięki temu parowaniu SraL chroni mRNA rho przed przedwczesnym zakończeniem transkrypcji wywołanym przez sam Rho. Co ciekawe, technologia ta nie jest ograniczona do sRNA i może być stosowana do dowolnego typu komórkowego RNA, czego przykładem jest użycie fragmentu pochodzącego z tRNA26 i 5'-nieuleganego regionu mRNA22 (Tabela 1).
Metoda MAPS została również dostosowana do patogennej bakterii Gram-dodatniej S. aureus19. W szczególności protokół lizy został szeroko zmodyfikowany w celu skutecznego rozbijania komórek ze względu na grubszą ścianę komórkową niż bakterie Gram-ujemne i utrzymania integralności RNA. Ten zaadaptowany protokół już rozwikłał interaktom RsaA27, RsaI28 i RsaC29. Podejście to dostarczyło informacji na temat kluczowej roli tych sRNA w mechanizmach regulacyjnych właściwości powierzchni komórek, wychwytu glukozy i reakcji na stres oksydacyjny.
Protokół opracowany i wdrożony u E. coli w 2015 roku został niedawno opisany bardzo szczegółowo30. W tym miejscu udostępniamy zmodyfikowany protokół MAPS, który jest szczególnie odpowiedni do badania sieci regulacyjnych sRNA u bakterii Gram-dodatnich (grubsza ściana komórkowa), zarówno niepatogennych, jak i chorobotwórczych (środki ostrożności).

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 2 ml</td><td>Starstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrument do bioanalizowania</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>ilość i jakość RNA</td></tr><tr><td>250 ml kolba hodowlana</td><td>Dominique Dutscher</td><td>2515074</td><td>Bakteryjne kultury</td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td>Wirowanie kultur</td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Ekstrakcja i oczyszczanie RNA Wirówka</td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Peletowanie bakteryjne</td></tr><tr><td>Ampicilin (amp)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>wzrostowa Żywica amylozowa Nowość</td><td> Anglia BioLabs</td><td>E8021S</td><td>Oczyszczanie powinowactwa MS2</td></tr><tr><td>Antydioksygenina AP Fragment Fab</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>Kaseta autoradiografii</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-212-726</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0051</td><td>Budowa plazmidu</td></tr><tr><td>Bulion BHI (Brain Heart Infusion)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>CDP-Star</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11759051001</td><td>Testy Northern blot (substrat)</td></tr><tr><td>Wirówka 5415 R</td><td>Ekstrakcja i oczyszczanie RNA</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Dominique Dutscher</td><td>508320-CER</td><td>Ekstrakcja RNA i oczyszczanie</td></tr><tr><td>Mieszanka do znakowania DIG-RNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11277073910</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>leczenie DNazy</td></tr><tr><td>Erytromycyna (ery)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Fluka 45673</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Urządzenie FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>Mechaniczna liza</td></tr><tr><td>Tiocyjanian</td> <td>guaniduTesty Northern blot Sigma-Aldrich</td><td>G9277-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hybrydyzacja Hoven Hybrigene</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>Probówki hybrydyzacyjne</td><td>Techne</td><td>FHB16</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/6960/08</td><td>Ekstrakcja i oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>LB (bulion lizogenny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Lysing Matrix B Bulk</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540-428</td><td>Mechaniczna liza</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td>Budowa plazmidu</td></tr><tr><td>Urządzenie wodne Milli-Q Millipore</td><td></td><td>Z00QSV0WW</td> Spektrofotometr <td>NanoDrop do wody ultraczystej</td></tr><tr><td></td> Ilość i jakość <td></td><td></td>ThermoFisher Scientific <td></td> RNA/DNA</tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Dominique Dutsher</td><td>10600002</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>Phembact Neutre</td><td>PHEM Technologies</td><td>BAC03-5-11205</td><td>Czyszczenie i odkażanie</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Carl Roth</td><td>38.2</td><td>Ekstrakcja i oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Budowa plazmidu</td></tr><tr><td>pMBP-MS2</td><td>Addgene</td><td>65104</td><td>Produkcja MS2-MBP</td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna Poly-Prep</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>Oczyszczanie powinowactwa MS2</td></tr><tr><td>PstI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0615</td><td>Konstrukcja plazmidu</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 3</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td>ilość RNA</td></tr><tr><td>Roztwór RNAPro</td><td>MP Biomedicals</td><td>6055050</td><td>Mechaniczna liza</td></tr><tr><td>Kompletny zestaw ScriptSeq</td><td>Illumina</td><td>BB1224</td><td>Przygotowanie bibliotek cDNA</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Genesys 20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11972278</td><td>Kultury bakteryjne</td></tr><tr><td>Urządzenie próżniowe SpeedVac Savant</td><td>Ekstrakcja i oczyszczanie RNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DNA120</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400672</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0014</td><td>Budowa plazmidu</td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borate-EDTA)</td><td>Euromedex</td><td>ET020-C</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>ThermalCycler T100</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Budowa plazmidu</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>Procesor filmu rentgenowskiego</td><td>hu.q</td><td>HQ-350XT</td><td>Testy Northern blot</td></tr><tr><td>Filmy rentgenowskie Super RX-N</td><td>FujiFilm</td><td>4741019318</td><td>Testy Northern blot</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie powinowactwa ms2 w połączeniu z sekwencjonowaniem rna u bakterii gram-dodatnich

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Chociaż małe regulatorowe RNA (sRNA) są szeroko rozpowszechnione w bakteryjnej domenie życia, funkcje wielu z nich pozostają słabo scharakteryzowane, szczególnie z powodu trudności w identyfikacji ich celów mRNA. W tym miejscu opisaliśmy zmodyfikowany protokół oczyszczania MS2-Affinity w połączeniu z technologią sekwencjonowania RNA (MAPS), mający na celu ujawnienie wszystkich partnerów RNA określonego sRNA in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, aptamer MS2 jest połączony z końcem 5' interesującego nas sRNA. Konstrukt ten jest następnie wyrażany in vivo, umożliwiając MS2-sRNA interakcję ze swoimi partnerami komórkowymi. Po zebraniu bakterii komórki są poddawane lizie mechanicznej. Surowy ekstrakt jest ładowany do kolumny chromatograficznej na bazie amylozy, uprzednio pokrytej białkiem MS2 połączonym z białkiem wiążącym maltozę. Umożliwia to specyficzne wychwytywanie MS2-sRNA i oddziałujących RNA. Po elucji wspólnie oczyszczone RNA są identyfikowane przez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA, a następnie analizę bioinformatyczną. Poniższy protokół został wdrożony w ludzkim patogenie Gram-dodatnim Staphylococcus aureus i w zasadzie można go przenieść na dowolną bakterię Gram-dodatnią. Podsumowując, technologia MAPS stanowi skuteczną metodę dogłębnego zbadania sieci regulacyjnej danego sRNA, oferując migawkę całego jego celu. Należy jednak pamiętać, że przypuszczalne cele zidentyfikowane przez MAPS nadal muszą zostać zweryfikowane za pomocą uzupełniających podejść eksperymentalnych.

Reprezentatywne wyniki pochodzą z badania targetomu RsaC u S. aureus29. RsaC jest niekonwencjonalnym sRNA o długości 116 nt. Jego koniec 5’ zawiera kilka regionów powtarzalnych, natomiast koniec 3’ (54 nt) jest strukturalnie niezależny i zawiera wszystkie przewidywane miejsca oddziaływania z docelowymi mRNA. Ekspresja tego sRNA jest indukowana w warunkach niedoboru manganu (Mn), co często występuje w kontekście odpowiedzi odpornościowej gospodarza. Wykorzystując technologię MAPS, zidentyf...

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA lub MAPS zostało opracowane w celu identyfikacji całego celu dowolnego RNA będącego przedmiotem zainteresowania u bakterii. Technologia ta umożliwia identyfikację dowolnego rodzaju partnerów sRNA niezależnie od mechanizmu regulacji. Charakterystyka sieci regulacyjnych zależnych od sRNA pomoże lepiej zrozumieć produkcję czynników wirulencji, tworzenie biofilmu i przetrwanie bakterii w komórkach gospodarza, a ostatecznie zwalczać infekcje gronkowcowe.Protokół ten można zastosować do dowolnych chorobotwórczych lub niepatogennych bakterii Gram-dodatnich. Procedurę zademonstruje Noemie Mercier, doktorantka z laboratorium dr Pascala Romby'ego. Na początek wyhoduj jedną kolonię szczepów przenoszących plazmidy pCN51 P3 MS2 sRNA lub pCN51 P3 MS2 w trzech mililitrach pożywki BHI uzupełnionej 10 mikrogramami erytromycyny na mikrolitr w duplikatach.Rozcieńczyć każdą nocną hodowlę w 50 mililitrach świeżej pożywki BHI uzupełnionej erytromycyną, aby osiągnąć OD 600 0,05. Hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 180 obr./min przez sześć godzin. Przenieś każdą kulturę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj probówki w temperaturze 2 900 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie wyrzuć supernatant, zamroź i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub trzymaj granulki na lodzie i bezpośrednio przeprowadź mechaniczną lizę komórek.Aby przeprowadzić mechaniczną lizę komórek, ponownie zawieś granulki w pięciu mililitrach buforu A i przenieś zawieszone komórki do 15-mililitrowych probówek wirówkowych z 3,5 gramami kulek krzemionkowych. Włóż probówki do mechanicznego przyrządu do lizy komórek i uruchom cykl 40 sekund z prędkością czterech metrów na sekundę. Odwirować probówki w temperaturze 2 900 razy G przez 15 minut, a następnie odzyskać supernatant i utrzymać go na lodzie.Upewnij się, że supernatant jest klarowny, powtarzając wirowanie, jeśli tak nie jest. Usuń końcówkę kolumny, a następnie umieść kolumnę chromatograficzną w stojaku kolumnowym i umyj kolumnę ultraczystą wodą. Dodać 300 mikrolitrów żywicy amylozowej i przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu A. Rozcieńczyć 1, 200 pikamoli białka MBP-MS2 w sześciu mililitrach buforu A i załadować go do kolumny.Przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu A. Następnie przeprowadzić oczyszczanie z powinowactwem MS2. Załaduj lizat komórkowy do kolumny i zbierz frakcję przepływową do czystej probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę trzykrotnie 10 mililitrami buforu A i zebrać frakcję płuczką, następnie wymyć kolumnę jednym mililitrem buforu E i zebrać frakcję elucyjną w mikroprobówce o pojemności dwóch mililitrów.Trzymaj wszystkie zebrane frakcje na lodzie do czasu ekstrakcji RNA. Użyj jednego mililitra każdej frakcji do ekstrakcji RNA. Dodaj jedną objętość fenolu do RNA i energicznie wymieszaj, a następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Przenieś górną fazę do czystej mikroprobówki o pojemności dwóch mililitrów. Dodać jedną objętość chloroformowego alkoholu izoamylowego i powtórzyć wirowanie, a następnie przenieść górną fazę do nowej probówki. Dodać 2,5 objętości 100% zimnego etanolu i 0,1 objętości trzymolowego octanu sodu o pH 5,2 i wytrącać przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Następnego dnia odwiruj probówki przez 15 minut w temperaturze 16 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Powoli usuń etanol za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć granulki. Dodaj 500 mikrolitrów 80% zimnego etanolu i wiruj przez pięć minut.Wyrzuć etanol, pipetując go powoli, a następnie wysusz granulat za pomocą koncentratora próżniowego przez pięć minut w trybie pracy. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości ultraczystej wody. Protokół ten został wykorzystany do zbadania celu RsaC w S.aureus.Za pomocą technologii MAPS zidentyfikowano kilka mRNA oddziałujących bezpośrednio z RsaC, ujawniając ich kluczową rolę w stresie oksydacyjnym i reakcjach związanych z metalami. Aby potwierdzić konstrukty sRNA MS2 i uwidocznić ich wzorzec ekspresji, komórki zebrano po dwóch, czterech i sześciu godzinach wzrostu w pożywce BHI. Ekstrakcjo RNA i przeprowadzono analizę Northern blot przy użyciu sondy DIG specyficznej dla RsaC.Poziom endogennego RsaC znacznie wzrósł po sześciu godzinach wzrostu. Co ważne, poziom MS2-RsaC 544 i MS2-RsaC 1, 116 był porównywalny z endogennym RsaC po sześciu godzinach. Przeprowadzono oczyszczanie powinowactwa i wyekstrahowano RNA z surowego ekstraktu, frakcji przepływowych i elucyjnych w szczepie typu dzikiego eksprymującym sam znacznik MS2 i zmutowanym szczepie RsaC wyrażającym konstrukt MS2-RsaC 544.Długi endogenny RsaC nukleotydu 1,116 został wzbogacony we frakcję elucyjną, ale oddziaływał niespecyficznie z kolumną powinowactwa ze względu na swoją długość i złożoną strukturę drugorzędową. MS2-RsaC 544 został wysoce wzbogacony we frakcję elucyjną, co pokazuje, że został skutecznie zatrzymany przez białko fuzyjne MS2-MBP. Analiza bioinformatyczna ujawniła przypuszczalne cele mRNA zgodnie ze zmianą fałdowania między sRNA MS2 a kontrolą MS2, co wskazuje, że sodA był pierwszym przypuszczalnym celem.Analiza Northern blot przeprowadzona przez sondę DIG specyficzną dla sody A po oczyszczeniu z powinowactwem do MS2 pokazuje, że sodA był skutecznie wzbogacany MS2-RsaC 544 w porównaniu z kontrolą MS2. Próbując skorzystać z tego protokołu, należy pamiętać, że dodanie znacznika MS2 może wpłynąć na potwierdzenie, stabilność lub funkcję sRNA. Należy to uważnie monitorować.MAPS zapewnia migawkę parowania celów sRNA-RNA. Dalsza walidacja eksperymentalna pozwoli odkryć ich funkcję. Technika ta stanowi potężne narzędzie do budowy sieci regulacyjnych sRNA u dowolnych bakterii.

ms2-affinity-purification-coupled-with-rna-sequencing-gram-positive

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Protokół zubożenia rybosomalnego RNA (rRNA) został opracowany w celu wzbogacenia informacyjnego RNA (mRNA) dla sekwencyjnego RNA metatranskryptomu jelita komara. Z komara i jego mikroorganizmów jelitowych stworzono sondy rRNA specyficzne dla próbki, które użyto do usunięcia rRNA poprzez odejmowanie. Działanie protokołu może skutkować usunięciem około 90-99% rRNA.

Zubożenie rybosomalnego RNA dla metagenomicznego RNA-seq jelit komarów

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę MAPS do identyfikacji celów sRNA w bakteriach Gram-dodatnich przy użyciu oczyszczania powinowactwa MS2 i sekwencjonowania RNA. Technika ta ujawnia sieci regulacyjne wpływające na czynniki wirulencji.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Przeglądaj więcej filmów