Izolacja, proliferacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej makaka rezusa

Izolacja i proliferacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej wytwarza dużą liczbę komórek macierzystych, które można wykorzystać do kilku dalszych zastosowań i technik eksperymentalnych. Głównym zamierzonym zastosowaniem zróżnicowanych adipocytów w tym protokole są testy metaboliczne, takie jak wychwyt glukozy stymulowany insuliną, lipogeneza i lipoliza stymulowana. Na początek stwórz sterylne środowisko pracy, dezynfekując kaptur bezpieczeństwa biologicznego i wszystkie narzędzia.

Odpipetować około 10 mililitrów pięciu PBS do czterech 100-milimetrowych naczyń do hodowli komórkowych. Przenieść 50-gramową próbkę tłuszczu do jednego z naczyń i umyć ją cztery razy, kolejno przenosząc ją na inne szalki zawierające pięć PBS. Następnie umytą tkankę tłuszczową przenieś do czystego naczynia hodowlanego o grubości 100 milimetrów i dokładnie zmielić za pomocą nożyczek lub sterylnych kleszczyków.

Przenieś jedno- lub trzycentymetrowy fragment zmielonej tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 13 mililitrów buforu kolagenazy. Wypłucz pozostałą tkankę z naczynia hodowlanego dwoma mililitrami buforu kolagenazy, aby uzyskać całkowitą objętość 15 mililitrów. Dokładnie wymieszać próbkę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów i inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bujaczku przez 30 do 60 minut.

W celu zneutralizowania aktywności enzymu, po inkubacji dodaj 10 mililitrów pożywki wzrostowej ADSC do probówki i dobrze wymieszaj ją pipetą, aby oddzielić wszelkie agregaty tkankowe. Przenieś płynną porcję do nowej sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, pozostawiając tkankę stałą. Umyj chusteczkę trzy razy za pomocą siedmiu mililitrów dwóch PBS i przenieś płyn do nowej probówki.

Następnie odwirować probówkę o sile 500 razy G przez pięć minut i ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 1X buforu do lizy czerwonych krwinek lub RBC i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj komórki dwukrotnie, dodając pięć mililitrów pożywki wzrostowej ADSC do probówki i odwirowując w celu usunięcia supernatantu.

Po ostatnim praniu ponownie zawieś granulat w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej ADSC i przefiltruj go przez sitko do komórek o wielkości 70 mikronów do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłukać sitko dodatkowymi dwoma mililitrami pożywki i przenieść cztery mililitry zawiesiny do sterylnego naczynia hodowlanego o pojemności 100 mililitrów. Przepłucz stożkową rurkę dwukrotnie trzema mililitrami pożywki, aby zebrać całkowitą objętość 10 mililitrów w naczyniu hodowlanym.

Obserwuj zebrane komórki pod odwróconym mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, aby sprawdzić, czy nie ma komórek pływających. Inkubuj komórki przez 24 godziny w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 100% wilgotności względnej. Aby zapewnić sterylność pożywki hodowlanej, należy dołączyć płytkę z samym podłożem.

Po 24 godzinach obejrzyj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby sprawdzić przyleganie komórek. Usuwaj i zastępuj pożywkę ciepłą pożywką co 48 godzin, aż komórki będą zlewać się w 80 do 90%. W celu proliferacji usuń pożywkę wzrostową z konfluentnych komórek ADSC i umyj je dwukrotnie dwoma mililitrami sterylnego PBS o temperaturze pokojowej.

Odessać PBS i dodać dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA do każdej płytki hodowlanej, pokrywając całą powierzchnię płytki. Inkubować płytkę przez siedem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, a następnie mechanicznie usunąć trypsynizowane komórki za pomocą silnego pipetowania. Dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej ADSC i delikatnie wymieszaj komórki.

Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, płucząc naczynie dodatkowymi dwoma mililitrami pożywki, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek z płytki. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i zdekantować supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu do sześciu mililitrach pożywki wzrostowej ADSC na milion komórek.

Policz komórki za pomocą hemocytometru i unieś je płytką zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, odessać pożywkę wzrostową i przepłukać komórki sterylnym PBS o temperaturze pokojowej, a następnie dodać 10 mililitrów pożywki różnicującej ADSC. Wymieniaj pożywkę co trzy dni przez około 14 do 21 dni.

Obserwuj komórki pod kątem obecności kropelek lipidów pod odwróconym mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu. Dojrzałe adipocyty obserwuje się na ogół po 14 dniach. W dniu posiewu ADSC nie przylegały i unosiły się w kulturze.

Komórki stały się zlewające się w 80% po 72 godzinach i były gotowe do różnicowania adipocytów. Po 14 dniach różnicowania ADSC dojrzałe adipocyty wykazywały silne cechy adipogenne, które obserwowano przy 40-krotnym powiększeniu. W dniu 14 komórki wybarwiono i utrwalono za pomocą Oil Red O i BODIPY w celu wizualizacji kropelek lipidów.

Zróżnicowane adipocyty można było zaobserwować w 20-krotnym powiększeniu. Wypróbowując ten protokół, należy pamiętać, że sterylne środowisko pracy ma kluczowe znaczenie dla zdrowej izolacji, odpowiedniej ekspansji i skutecznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej. Po tej procedurze komórki te można wykorzystać do kilku testów metabolicznych, takich jak wychwyt glukozy, lipogeneza i lipoliza, która jest głównym celem naszych badań.

Technika ta pozwala na zbadanie, w jaki sposób przewlekły alkohol i SIV wpływają na zdolność metaboliczną adipocytów.