Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Mikroskopia 4D jest cennym narzędziem do rekonstrukcji pełnej linii komórkowej zarodka C.elegans lub dowolnej innej próbki na poziomie pojedynczej komórki. Optyka Nomarski może być używana do uwydatniania zmian kształtu komórek podczas rozwoju za pomocą standardowego mikroskopu i światła przechodzącego bez konieczności stosowania zwierząt transgenicznych lub mikroskopii fluorescencyjnej. Mikroskop 4D pozwala badać cykl komórkowy, proliferację, różnicowanie i apoptozę u C.elegans oraz w innych układach, takich jak ssaki czy hodowle komórek tkankowych.

Śledzenie pochodzenia komórek na obrazach DIC jest wykonywane ręcznie. Jest to czasochłonne i wymaga pewnej wprawy, aby przeprowadzić pełną analizę zarodków. Procedurę zademonstruje Begona Ezcurra, technik z naszego laboratorium.

Przed przygotowaniem zarodków należy dostosować temperaturę zapisu mikroskopu 4D do 15, 20 lub 25 stopni Celsjusza i ustawić mikroskop tak, aby rejestrował 1 500, 30 stosów ogniskowych z w odległości jednego mikrona od siebie z zachowaniem 30-sekundowych odstępów między początkiem każdego stosu. Następnie podlej od 500 do 1000 mikrolitrów płynnego 4,5% agaru do trzymilimetrowych szklanych probówek i ostrożnie uszczelnij probówki folią woskową, aby uniknąć wysuszenia. Aby przygotować cienką, jednorodną podkładkę agarową do nagrywania, ostrożnie podgrzej i porcjuj agar nad palnikiem alkoholowym, aż agar się rozpuści i umieść probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Umieść szklane szkiełko mikroskopowe na kawałku plastiku i użyj pipety pastwiskowej w jednej ręce, aby umieścić małą kroplę stopionego agaru na środku szkiełka, a następnie natychmiast drugą ręką umieść drugie szkiełko na kropli agaru, aby utworzyć bardzo cienką podkładkę agarową. Aby zamontować zarodki, najpierw użyj próbnika, aby przenieść od 5 do 10 grawitacyjnych hermafrodytów do szkła zegarmistrzowskiego wypełnionego wodą pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj skalpela, aby rozciąć nicienie hermafrodytyczne i wydobyć od jednego do czterech wczesnych jaj z macicy.

Delikatnie zsuń górną szkiełko z podkładki agarowej i użyj rurki kapilarnej, aby umieścić wczesne jajko na środku podkładki. Użyj rzęsy przyklejonej do końca wykałaczki, aby w razie potrzeby dostosować pozycję jajka i użyj pipety kapilarnej, aby usunąć nadmiar wody. Za pomocą skalpela powoli i ukośnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na preparat przed użyciem mikropipety do wypełnienia wodą 3/4 przestrzeni otaczającej podkładkę agarową.

Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe wazeliną, aby uniknąć wysuszenia podczas długich okresów nagrywania. Po uszczelnieniu umieść szkiełko na stoliku mikroskopu 4D i użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby ustawić ostrość zarodka. Wybierz obiektyw 100X zanurzenia i ustaw ostrość kondensatora.

Całkowicie otwórz aperturę kondensatora i zamknij przysłonę polową, aby zapewnić wyższą aperturę numeryczną i większą rozdzielczość. Obróć pryzmat Wollastona, aby uzyskać trójwymiarowy obraz zarodka oświetlonego z jednej strony, następnie obróć pryzmat w drugą stronę, aby uzyskać efekt oświetlenia zarodka z drugiej strony i rozpocznij zapis 4D. Aby zrekonstruować linię komórkową zarodka nagranego w filmie 4D, otwórz oprogramowanie do śledzenia pochodzenia i wybierz Plik i Nowy projekt.

Wybierz odpowiedni szablon pochodzenia komórek w zależności od temperatury zapisu i ustaw liczbę skanów na 1500. Czas między skanowaniami do 30 sekund, licznik poziomów do 30, a odległość między poziomami do jednego mikrona. Wybierz plik obrazu, format i katalog, w którym obrazy zostały zapisane.

Wybierz, czy obrazy zostały zapisane jako pojedyncze obrazy, czy jako stosy z wieloma obrazami, a następnie ustaw nazewnictwo plików i formaty obrazów. Następnie kliknij opcję Przetwarzanie kanałów włączone, aby wykryć i ustawić odpowiednie kanały światła filmu 4D. W celu śledzenia linii komórek uruchom oprogramowanie do śledzenia linii komórek.

Pojawi się okno wideo i okno pochodzenia komórki. W oknie pochodzenia wybierz gałąź pochodzenia i kliknij jądro komórkowe odpowiadające tej komórce w oknie wideo. Odtwórz film 4D do przodu, do tyłu lub w górę lub w dół o poziom, aby śledzić interesującą komórkę przestrzennie w czasie.

Od czasu do czasu klikaj jądro komórki, aby wygenerować punkt w gałęzi rodowej i zarejestrować współrzędne przestrzenne komórki w określonym czasie. W rezultacie możliwe są progresje linii komórkowych i rekonstrukcje 3D zarodka. Następnie naciśnij powrotu, aby zaznaczyć mitozę i wybierz jedną z komórek potomnych, aby śledzić postęp komórki, jak właśnie pokazano.

Powtórz analizę dla pozostałych komórek embrionalnych, aby prześledzić całą linię komórkową lub śledzić określone komórki będące przedmiotem zainteresowania, takie jak te poddawane apoptozie. Aby umożliwić porównanie interesujących nas zmutowanych linii genetycznych ze stereotypową linią komórkową C. elegans typu dzikiego. Płytki ślimakowe są inkubowane w kartonach, aby uniknąć kondensacji.

Po zakończeniu zapisu linię komórkową można zrekonstruować za pomocą oprogramowania do śledzenia linii, jak pokazano. Na przykład w tej reprezentatywnej analizie porównano prześledzoną linię komórek zarodka ze zmutowanym genezą gsr-1 z linią C.elegans typu dzikiego. Ujawniono wykrycie postępującego opóźnienia w cyklu komórkowym podczas rozwoju embrionalnego.

W konsekwencji zmutowane zarodki zatrzymywały się w stadiach pośrednich, podczas gdy zarodki typu dzikiego rozwijały się i ostatecznie wykluwały się jako larwy. Ponadto inne ważne cechy rozwoju embrionalnego, takie jak apoptoza, mogą być dynamicznie wizualizowane za pomocą mikroskopii 4D. Śledzenie pochodzenia obrazów DIC musi być przetwarzane ręcznie.

Przetwarzanie programowe nieoznaczonych komórek w świetle widzialnym we wczesnych stadiach rozwoju nie jest dokładne w przypadku analizy zarodków. Zastosowanie systemu rozpoznawania obrazu w dziedzinie mikroskopii światła widzialnego przyniesie ogromny postęp w dziedzinie biologii rozwoju.