Name: Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj zmodyfikowany model udaru fototrombotycznego wzbogacony fibryną i trombiną, który tworzy skrzepy podobne do ludzkich i wykazuje wysoką wrażliwość na terapię trombolityczną tPA u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH (NS108763, NS100419, NS095064 i HD080429 dla C.Y.K.; oraz NS106592 dla Y.Y.S.).

Ten protokół został zatwierdzony przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Wirginii i jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Rysunek 1A przedstawia sekwencję zabiegów chirurgicznych w tym protokole.
1. Konfiguracja operacji
<ol>
	<li>Na adapterze dla małych zwierząt umieścić wkładkę rozgrzewającą z ustawioną temperaturą 37 °C co najmniej 15 minut przed zabiegiem. Przygotuj rolkę z klipsem na nos do adaptera, który umożliwia obracanie głowy zwierzęcia. Przygotuj środki znieczulające: ketaminę (60 mg/kg) / ksylazynę (10 mg / kg).</li>
	<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki, kleszcze, uchwyty do mikroigieł, hemostatyki, waciki i szwy za pomocą autoklawu (121 °C przy 15 psi przez 60 min). Przygotuj klej tkankowy i maść do oczu. Przygotuj okulary ochronne na laser 532 nm dla chirurgów. 
	UWAGA: Niniejszy protokół opisuje poważną procedurę chirurgiczną przeżycia i powinien być przeprowadzany przy użyciu technik aseptycznych.</li>
	<li>Skonfiguruj system oświetlenia ze źródłem lasera o długości fali 532 nm. Przygotuj wiertło dentystyczne.</li>
	<li>Przygotuj roztwór róży bengalskiej w soli fizjologicznej (10 mg/ml). Umieścić podwielokrotną trombinę bydlęcą (0,1 U/μl) na wiadrze z lodem.</li>
	<li>Wstrzyknąć ketoprofen (4,0 mg/kg) podskórnie myszy jako środek przeciwbólowy na 30 minut przed zabiegiem lub zastosować schemat przeciwbólowy zalecany przez lokalne wytyczne instytucjonalne.</li>
</ol>
2. Podwiązanie tętnicy szyjnej wspólnej ipsilateralnej
<ol>
	<li>Znieczulić 10-14 tygodniowe samce myszy C57BL/6NCrl o masie ciała od 22 do 30 g poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (60 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). 
	UWAGA: Oczekuje się, że cała procedura chirurgiczna, obejmująca podwiązanie ipsilateralnej tętnicy szyjnej wspólnej poprzez monitorowanie przepływu krwi w mózgu, zajmie ~120 minut. Schemat znieczulenia będzie zazwyczaj skuteczny przez cały ten czas, ale głębokość znieczulenia powinna być ponownie oceniana co najmniej co 15 minut. Podczas nauki tych procedur może być konieczne ponowne dawkowanie znieczulenia.</li>
	<li>Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Usuń włosy z lewej szyi w celu podwiązania CCA i głowy w celu przerzedzenia czaszki za pomocą kremu do depilacji.</li>
	<li>Umieść mysz na adapterze dla małych zwierząt w pozycji leżącej. Wysterylizuj obszar chirurgiczny, przecierając skórę trzema naprzemiennymi machnięciami jodu powidonu i 70% etanolu.</li>
	<li>Zabezpiecz głowę myszy za pomocą nauszników. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj 0,5 cm nacięcie lewej szyjki macicy za pomocą mikronożyczek i prostych kleszczy w odległości około 0,2 cm w bok od linii środkowej.</li>
	<li>Użyj pary drobno ząbkowanych kleszczyków, aby rozdzielić tkankę miękką i powięź, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną wspólną (LCCA). Ostrożnie oddziel lewe CCA od nerwu błędnego za pomocą pary cienkich, gładkich kleszczy.</li>
	<li>Umieść stały szew z podwójnym węzłem wokół LCCA za pomocą jedwabnego szwu 5-0 pociętego na segmenty 20 mm, a następnie zamknij ranę za pomocą sterylnych klipsów do ran.</li>
</ol>
3. Przerzedzenie czaszki nad gałęzią MCA i fotoaktywacja
<ol>
	<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej na adapterze dla małych zwierząt. Obróć rolkę klipsa na nos o 15°. Wysterylizuj obszar operacyjny, przecierając skórę trzema naprzemiennymi machnięciami betadyny i 70% etanolu.</li>
	<li>Wykonaj 0,8 cm nacięcie na skórze głowy za pomocą mikronożyczek i prostych kleszczy wzdłuż lewego oka i ucha, aby odsłonić mięsień skroniowy, który znajduje się między okiem a uchem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj 0,5 cm nacięcie wzdłuż krawędzi mięśnia skroniowego na lewej kości ciemieniowej za pomocą pary drobno ząbkowanych kleszczy. Wykonaj drugie pionowe nacięcie o długości 0,3 cm na mięśniu skroniowym za pomocą mikronożyczek. Cofnij mięsień skroniowy, aby odsłonić krawędź kości ciemieniowej i kości łuskowej. Upewnij się, że wizualizujesz punkt orientacyjny szwu koronalnego między kością czołową a ciemieniową (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C).</li>
	<li>Nawilż czaszkę, nakładając sterylną sól fizjologiczną, aby odsłonić lewy MCA. Zaznacz bliższą gałąź MCA na kości łuskowej markerem. Delikatnie narysuj okrąg o średnicy około 1 mm otaczający zaznaczony obszar za pomocą pneumatycznej wiertarki dentystycznej (ustawienie prędkości zadziorów na 50% regulatora prędkości), a następnie rozcieńcz czaszkę na głębokość około 0,2 mm, nie dotykając spodniej opony twardej. Przerwij wiercenie, aż pozostanie bardzo cienka warstwa kości.</li>
	<li>Wymieszaj roztwór trombiny (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) i Rose Bengalgal (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) w zależności od masy ciała myszy. Na przykład dla myszy o masie ciała 25 g wymieszaj 20 μl trombiny (0,1 U/μL) i 125 μL RB (10 mg/ml).</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć roztwór T+RB (145 μl na 25 g masy ciała) do zatoki zaoczodołowej za pomocą strzykawki insulinowej (#31G igły). 
	UWAGA: W eksperymentach pilotażowych zbadano śmiertelność w przypadku zwiększania dawek trombiny zmieszanej ze standardową dawką barwnika RB (50 mg/kg) pod kątem fotoaktywacji. Śmiertelność wynosiła 0% dla trombiny 80 U/kg (n=13), 43% dla trombiny 120 U/kg (n=7) i 100% dla trombiny 160 U/kg (n=5), jak i 200 U/kg trombiny (n=5). W związku z tym dla tego modelu wybrano dawkę 80 U/kg trombiny. Laserowe obrazowanie plamkowe zastosowano również w celu wykluczenia możliwości gwałtownego krzepnięcia krwi w pobliżu jamy oczodołu po wstrzyknięciu T + RB do zatoki zaoczodołowej (rysunek uzupełniający 1), a także rozległego odkładania się fibryny w przeciwległej półkuli, która nie była poddawana oświetleniu laserowemu (ryc. uzupełniająca 2).</li>
	<li>Nałóż maść na oczy na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Nałóż oświetlacz światłem laserowym 532 nm (o energii 0,5 mW) na wiercone miejsce w odległości 2 cali przez 20 minut. Wizualizuj oświetlenie na bliższej gałęzi MCA przez gogle ochrony laserowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C,D). 
	UWAGA: MCA z podświetleniem 532 nm pokazuje czerwoną fluorescencję pod goglami. Dystalne MCA zniknie po 10 minutach oświetlenia. Wyklucz zwierzę, jeśli dystalny przepływ MCA jest nadal obecny po 20 minutach oświetlenia.</li>
	<li>Zatrzymaj oświetlenie lasera po 20 minutach. Zamknij ranę sterylnymi klipsami.</li>
</ol>
4. Obrazowanie przyżyciowe (opcjonalnie)
UWAGA: Aby scharakteryzować powstawanie skrzepliny in vivo, użyj obrazowania wewnątrzwirusowego za pomocą konfokalnego dysku spinowego z systemem fotoaktywacji23.
<ol>
	<li>Wykonaj okno czaszki o średnicy ~3 mm na kości ciemieniowej czaszki.</li>
	<li>Umieść szkło nakrywkowe na oknie czaszki i zlokalizuj dystalny MCA (o średnicy ~50 μm) pod obiektywem 20x zanurzonym w wodzie.</li>
	<li>Oznaczyć krążącą płytkę krwi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej przeciwciała anty-GPIbβ sprzężonego z DyLight488 (0,1 mg / kg) na 5 minut przed obrazowaniem.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór mieszaniny trombiny (80 j./kg) i róży bengalskiej (50 mg/kg) za pomocą retroorbitalu na 5 minut przed obrazowaniem.</li>
	<li>Fotoaktywuj MCA za pomocą systemu laserowego 561 nm z wiązką laserową o średnicy 10 μm i rejestruj obraz aż do powstania skrzepliny.</li>
</ol>
5. Administracja tPA
<ol>
	<li>Umieścić znieczulone zwierzę na ciepłej podkładce o temperaturze 37 °C. W wybranym punkcie czasowym po fotoaktywacji zwilż gazę ciepłą wodą o temperaturze ~45 °C i zawiń ją na ogonie na 1 min.</li>
	<li>Wstrzyknąć rekombinowany ludzki tPA (10 mg/kg) przez żyłę ogonową z 50% bolusem i 50% w ciągu 30 minut za pomocą pompy infuzyjnej. 
	UWAGA: Chociaż dawka kliniczna rekombinowanego ludzkiego tPA w leczeniu ostrego udaru niedokrwiennego wynosi 0,9 mg/kg, wyższa dawka (10 mg/kg) jest powszechnie stosowana u gryzoni w celu skompensowania zmniejszonej międzygatunkowej reaktywności tPA. Postępowaliśmy również zgodnie ze standardowym protokołem podawania tPA w przedklinicznych modelach udaru, używając 50% jako bolusa i 50% podawanego przez żyłę ogonową przez 30 min.24</li>
</ol>
6. Monitor przepływu krwi w mózgu (CBF)
UWAGA: Aby potwierdzić powrót do zdrowia CBF po leczeniu tPA, użyj dwuwymiarowego systemu obrazowania kontrastowego z laserowymi plamkami15 i zapisz natychmiast po fotozakrzepicy (krok 3.9) lub po 24 godzinach od leczenia tPA.
<ol>
	<li>Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej i wykonaj nacięcie w linii środkowej na skórze głowy z odsłoniętą czaszką.</li>
	<li>Nawilż czaszkę sterylną solą fizjologiczną i delikatnie nałóż żel ultradźwiękowy na czaszkę. Unikaj włosów i pęcherzyków w żelu, które będą zakłócać sygnał CBF.</li>
	<li>Monitoruj CBF w obu półkulach mózgowych pod laserowym obrazem kontrastowym przez 10 minut.</li>
	<li>Po nagraniu obrazu CBF zamknij skórę głowy klejem tkankowym i wróć zwierzę do klatki.</li>
	<li>Przeanalizuj CBF w wybranych regionach i oblicz procent odzysku CBF w porównaniu z regionem przeciwległym.</li>
	<li>Następnie umieść zwierzę z powrotem w ciepłej klatce w celu odzyskania zdrowia. Monitoruj myszy przez 5-10 minut, aż wyzdrowieją ze znieczulenia. Umieść zwilżoną karmę w klatce i zwróć ją do placówki opieki nad zwierzętami. 
	UWAGA: Zapewnij analgezję pooperacyjną zgodnie z zaleceniami lokalnych wytycznych instytucjonalnych.</li>
</ol>
7. Pomiar objętości zawału za pomocą barwienia chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC)
<ol>
	<li>Dwadzieścia cztery godziny po fotozakrzepicy należy głęboko znieczulić zwierzę zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi chirurgii nieprzeżywalności. 
	UWAGA: Podajemy tribromoetanol (avertin) 250 mg/kg we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP).</li>
	<li>Wykonaj perfuzję przezsercową za pomocą PBS, zbierz świeży mózg i zanurz w 3% żelu agarowym.</li>
	<li>Plaster mózgu o grubości 1 mm należy podzielić na sekcje za pomocą wibratomu i inkubować w 2% roztworze TTC przez 10 minut.</li>
	<li>Określ ilościowo całkowitą objętość zawału z 6 wycinków mózgu jako objętość bezwzględną za pomocą oprogramowania ImageJ. 
	UWAGA: Obrzęk mózgu nie był używany jako miara wyniku z dwóch powodów. Po pierwsze, barwienie TTC mierzy żywotność tkanek (poprzez aktywność redukcyjną mitochondriów), co jest poważniejszą konsekwencją niż obrzęk. Po drugie, w miarę postępu zawału pojawia się zarówno obrzęk naczyniopochodny, jak i cytotoksyczny, którego nie można łatwo odróżnić za pomocą standardowych metod pomiaru obrzęku mózgu. Jednak zastosowaliśmy znakowanie antyimmunoglobiną (IgG) do oceny integralności bariery krew-mózg (BBB) i znaleźliśmy porównywalne wynaczynienie IgG po 6 godzinach od fotoaktywacji zarówno w modelach udaru RB, jak i T + RB (rysunek uzupełniający 3).</li>
</ol>
8. Pomiar powstawania skrzepliny
UWAGA: Aby zmierzyć powstawanie skrzepliny, zbierz mózg po 1 i 2 godzinach od fotozakrzepicy, aby zmierzyć skrzeplinę w MCA metodą immunochemiczną (IHC) i odpowiednio w celu pomiaru fibryny w półkuli mózgu za pomocą immunoblot.
<ol>
	<li>Wykonać IHC w celu scharakteryzowania składu skrzepu. Napraw mózg 4% paraformaldehydem przez noc, a następnie odwodnij mózg 30% sacharozy w celu osadzenia OCT.</li>
	<li>Przeciąć mózg w orientacji strzałkowej o grubości 20 μm i wykonać IHC ze specyficznymi przeciwciałami przeciwko fibrynogenowi, płytkom krwi (glikoproteina IIb), czerwonym krwinkom (TER119) i naczyniom krwionośnym (izolektyna GS-IB4).</li>
	<li>Wykonaj pomiar fibryny w półkuli mózgu za pomocą immunoblot z przeciwciałem przeciwko fibrynogenowi.</li>
</ol>

<ol><li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLyden%2C+PD+%22Thrombolytic+Therapy+for+Acute+Stroke.+3%2Fe%22">Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li>
<li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia%3A+implications+for+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li>
<li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li>
<li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li>
<li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl%283%29+application%3A+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke%3A+A+retrospective+pooled+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li>
<li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li>
<li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li>
<li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li>
<li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807(2014).</li>
<li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury%3A+Implications+for+perioperative+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li>
<li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia%2Fischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li>
<li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978(2015).</li>
<li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+%28tissue-type+plasminogen+activator%29+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li>
<li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li>
<li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li>
<li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li>
<li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li>
<li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li>
<li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717(2019).</li>
<li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis%3A+When%2C+how%2C+and+who+to+test%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li>
<li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke%3A+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%22%5BJournal%5D)">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li>
<li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+antiplatelet+therapies%3A+emphasis+on+preserving+haemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li>
<li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+crculation+in+ischemic+stroke%3A+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li>
<li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombsis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tradycyjny udar fotozakrzepowy RB, wprowadzony w 1985 roku, jest atrakcyjnym modelem ogniskowego niedokrwienia mózgu do prostych zabiegów chirurgicznych, niskiej śmiertelności i wysokiej odtwarzalności zawału mózgu. 5 W tym modelu barwnik fotodynamiczny RB szybko aktywuje płytki krwi po wzbudzeniu świetlnym, co prowadzi do powstania gęstych agregatów, które zamykają naczynie krwionośne 5,8,23. Jednak niew...

Trombektomia wewnątrznaczyniowa i tromboliza za pośrednictwem tPA to jedyne dwie zatwierdzone przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) terapie ostrego udaru niedokrwiennego, który dotyka ~700 000 pacjentów rocznie w Stanach Zjednoczonych1. Ponieważ zastosowanie trombektomii jest ograniczone do niedrożności dużych naczyń (LVO), podczas gdy tromboliza tPA może łagodzić niedrożność małych naczyń, obie są cennymi terapiami ostrego udaru niedokrwiennego2. Co więcej, połączenie obu terapii (np. rozpoczęcie trombolizy tPA w ciągu 4,5 godziny od wystąpienia udaru, a następnie trombektomia) poprawia reperfuzję i wyniki funkcjonalne3. W związku z tym optymalizacja trombolizy pozostaje ważnym celem badań nad udarem mózgu, nawet w erze trombektomii.
Modele zakrzepowo-zatorowe są niezbędnym narzędziem do przedklinicznych badań nad udarem, mających na celu poprawę terapii trombolitycznej. Dzieje się tak dlatego, że mechaniczne modele okluzji naczyń krwionośnych (np. okluzja MCA szwu śródświetlnego) nie wytwarzają skrzepów krwi, a jego szybkie odzyskanie przepływu krwi w mózgu po usunięciu mechanicznej okluzji jest nadmiernie wyidealizowane4,5. Do tej pory główne modele choroby zakrzepowo-zatorowej obejmują fotozakrzepicę6,7,8, miejscowe zastosowanie chlorku żelaza (FeCl3)9, mikroiniekcja trombiny do gałęzi MCA10,11, wstrzyknięcie ex vivo (mikro)zatoru do MCA lub tętnicy szyjnej wspólnej (CCA)12,13,14, oraz przejściowe niedotlenienie-niedokrwienie (tHI)15,16,17,18. Te modele udaru różnią się składem histologicznym powstałych skrzepów i wrażliwością na terapie lityczne za pośrednictwem tPA (Tabela 1). Różnią się one również wymogiem chirurgicznym kraniotomii (potrzebnym do wstrzyknięcia trombiny in situ i miejscowego stosowania FeCl3), spójnością wielkości i lokalizacji zawału (np. Wlew CCA mikrozatorów daje bardzo zróżnicowane wyniki) oraz globalnym wpływem na układ sercowo-naczyniowy (np. tHI zwiększa częstość akcji serca i pojemność minutową serca, aby skompensować rozszerzenie naczyń obwodowych wywołane niedotlenieniem).
Model udaru fotozakrzepowego (PTS) na bazie barwnika RB ma wiele atrakcyjnych cech, w tym proste zabiegi chirurgiczne bez kraniotomii, niską śmiertelność (zazwyczaj < 5%) oraz przewidywalny rozmiar i lokalizację zawału (na terytorium dostarczającym MCA), ale ma dwa główne ograniczenia. 8 Pierwszym zastrzeżeniem jest słaba lub zerowa odpowiedź na leczenie trombolityczne za pośrednictwem tPA, co jest również wadą modelu FeCl37,19,20. Drugim zastrzeżeniem modeli udarowych PTS i FeCl3 jest to, że powstałe skrzepliny składają się z gęsto upakowanych agregatów płytek krwi z niewielką ilością fibryny, co nie tylko prowadzi do jej odporności na terapię tPA-lityczną, ale także odbiega od wzorca mieszanych zakrzepów płytkowych:fibrynowych u pacjentów z ostrym udarem niedokrwiennym21,22. Natomiast model mikroiniekcji trombiny in situ obejmuje głównie spolimeryzowaną fibrynę i niepewną zawartość płytek krwi10.
Biorąc pod uwagę powyższe rozumowanie, postawiliśmy hipotezę, że domieszka RB i podzakrzepowej dawki trombiny do fotoaktywacji ukierunkowanej na MCA przez przerzedzoną czaszkę może zwiększyć zawartość fibryny w powstałym skrzeplinie i zwiększyć wrażliwość na leczenie lityczne za pośrednictwem tPA. Potwierdziliśmy tę hipotezę,23 i w niniejszym artykule opisujemy szczegółowe procedury zmodyfikowanego modelu udaru fotozakrzepowego (T+RB).

<table><tbody><tr><td>Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>zawał</td></tr><tr><td>4-0 Nylonowy szew monofilamentowy</td><td>LOOK</td><td>766B</td><td>Materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>5-0 Szew jedwabny</td><td>Aparat Harvarda</td><td>624143</td><td>materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>Wiązka laserowa 543 nm</td><td>Melles Griot</td><td>25-LGP-193-249</td><td>fotozakrzepica</td></tr><tr><td>dorosłe samce myszy</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6</td><td>10 ~ 14 tygodni (22 ~ 30 g)</td></tr><tr><td>Pręt anestezjologiczny do warsztatu mechanicznego adapterów myszy</td>, <td>konfiguracja chirurgiczna</td><td>UVA</td><td></td></tr><tr><td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoetanol)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>eutanazja</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Dentamerica</td><td>Rotex 782</td><td>konfiguracja chirurgiczna</td></tr><tr><td>Mikroskop cyfrowy</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>obrazowanie mózgu</td></tr><tr><td>Preparacja mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>konfiguracja chirurgiczna</td></tr><tr><td>Cienkie zakrzywione kleszcze (ząbkowane)</td> <td>Instrument chirurgiczny</td> <td>FST</td><td>11370-31</td></tr><tr><td>Kleszcze drobno zakrzywione (gładkie)</td> <td>FST</td><td>11373-12</td><td>instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>koza anty-królik Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Immunohistochemia</td></tr><tr><td>Hemostatyki Halsteda-Komara</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>Pompa ciepła z podkładką rozgrzewającą</td><td>Chirurgiczna pompa</td>infuzyjna <td>Gaymar</td><td>TP700</td></tr><tr><td></td><td>Leczenie trombolityczne</td><td>KD Scientific</td><td>200</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z igłą 31G</td><td>BD</td><td>328291</td><td>fotozakrzepica</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>CCM,</td><td>znieczulenie</td>UVA <td></td></tr><tr><td>Laserowa ochrona google 532nm</td><td>Thorlabs</td><td>LG3</td><td>fotozakrzepica</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>NSAID</td></tr> mikro <tr><td>uchwyty na igły</td> przeciwbólowe <td>FST</td><td>12060-01</td><td>instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>mikronożyczki</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>MoorFLPI-2 obrazownik przepływu krwi</td> Źródło lasera <td>Moor</td><td>780 nm</td><td>Adapter myszy do obrazowania kontrastowego Laser Speckle</td></tr><tr><td></td><td>Konfiguracja chirurgiczna</td> <td>RWD</td><td>68014</td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna Puralube</td><td>Fisher</td><td>NC0138063</td><td>zapobieganie suchości oczu</td></tr><tr><td>Końcówki retraktora</td><td>Konfiguracja chirurgiczna</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgi-5014-2</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>198250</td><td>fotozakrzepica</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>T7513</td><td>fotozakrzepica</td></tr><tr><td>Klej tkankowy</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>materiały chirurgiczne</td></tr><tr><td>tPA</td><td>Genetech</td><td>Cathflo activaza 2mg</td><td>leczenie trombolityczne</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>TTC infacrt</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>CCM,</td><td>znieczulenie</td> UVA <td></td></tr></tbody></table>

wzbogacony fibryną i wrażliwy na tpa model udaru fototrombotycznego

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Idealny model udaru zakrzepowo-zatorowego wymaga pewnych właściwości, w tym stosunkowo prostych procedur chirurgicznych o niskiej śmiertelności, stałego rozmiaru i lokalizacji zawału, wytrącania się skrzepów krwi mieszanych płytkami krwi i fibryną podobnych do tych u pacjentów, oraz odpowiedniej wrażliwości na leczenie fibrynolityczne. Model udaru fotozakrzepowego na bazie barwnika różowego bengalu (RB) spełnia pierwsze dwa wymagania, ale jest wysoce oporny na leczenie lityczne za pośrednictwem tPA, prawdopodobnie ze względu na bogaty w płytki krwi, ale ubogi w fibrynę skład skrzepu. Uważamy, że połączenie barwnika RB (50 mg / kg) i podzakrzepowej dawki trombiny (80 U / kg) do fotoaktywacji skierowanej na bliższą gałąź tętnicy środkowej mózgu (MCA) może powodować powstawanie skrzepów wzbogaconych w fibrynę i wrażliwych na tPA. Rzeczywiście, model fotozakrzepicy w połączeniu z trombiną i RB (T + RB) wywołał mieszane zakrzepy krwi płytkowo-fibrynowe, jak wykazano za pomocą barwienia immunologicznego i immunoblotów, i utrzymywał stałe rozmiary i lokalizacje zawałów oraz niską śmiertelność. Ponadto dożylne wstrzyknięcie tPA (Alteplase, 10 mg/kg) w ciągu 2 godzin po fotoaktywacji istotnie zmniejszyło rozmiar zawału w fotozakrzepicy T+RB. W związku z tym model udaru fotozakrzepowego wzmocniony trombiną może być użytecznym modelem eksperymentalnym do testowania nowych terapii trombolitycznych.

W pierwszej kolejności porównano zawartość fibryny w skrzepach krwi indukowanych fototrombozą w grupach RB oraz T+RB. Myszy uśmiercono poprzez perfuzję transkardialną utrwalaczy 2 godziny po fotoaktywacji, a następnie wyizolowano mózgi w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego gałęzi tętnicy środkowej mózgu (MCA) w płaszczyznach podłużnej i poprzecznej. W przypadku fototrombozy RB gałąź MCA była gęsto wypełniona CD41+ płytki krwi i niewielka ilość fibryny (Rycina 2<...

Tradycyjne modele udaru fotozakrzepowego (PTS) głównie indukują gęste agregaty płytek krwi o wysokiej odporności na tkankowe leczenie aktywatorem plazminogenu (tPA)-litycznym. Tutaj zmodyfikowany mysi model PTS jest wprowadzany przez jednoczesne wstrzykiwanie trombiny i barwnika światłoczułego w celu fotoaktywacji. Model PTS wzmocniony trombiną wytwarza mieszane skrzepy płytkowo-fibrynowe i jest bardzo wrażliwy na trombolizę tPA.

Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Chcemy stworzyć model udaru, który wytwarza skrzep krwi podobny do próbek pobranych od pacjenta i reaguje na klinicznie istotną terapię trombolityczną. W związku z tym modyfikujemy klasyczny model udaru fotozakrzepowego i mieszamy trombinę z barwnikiem fotodynamicznym różowym bengalskim przed fotoaktywacją. Cieszymy się, że ta procedura rzeczywiście tworzy skrzepy krwi, które są bardzo wrażliwe na trombolizę za pośrednictwem tPA.Ten zmodyfikowany model udaru fotozakrzepowego, wykorzystujący bardzo proste zabiegi chirurgiczne o niskim wskaźniku śmiertelności, pozwolił uzyskać bardzo spójny rozmiar i lokalizację zawału. Wytwarza się również skrzep krwi mieszany z fibryną i płytkami krwi, który jest podobny do tych u pacjenta z ostrym udarem mózgu. Dlatego uważamy, że jest to bardzo przydatne w przedklinicznych badaniach nad udarem mózgu w celu opracowania skuteczniejszych terapii trombolitycznych.Mamy nadzieję, że więcej osób skorzysta z naszego modelu. Procedurę zademonstruje dr Yu-Yo Sun, nasz adiunkt naukowy w naszej grupie. 30 minut przed zabiegiem przygotuj mysz, wstrzykując środek przeciwbólowy.Po znieczuleniu myszy wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że jest w pełni znieczulona. Następnie usuń włosy z lewej szyi i głowy za pomocą kremu do depilacji. Umieść mysz na adapterze dla małych zwierząt w pozycji leżącej na plecach i wysterylizuj chirurgiczny obszar skóry, wycierając go trzema naprzemiennymi ruchami jodu powidonu i 70% etanolu.Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie lewej szyjki macicy za pomocą mikronożyczek i prostych kleszczy w odległości około 0,2 centymetra w bok od linii środkowej. Następnie, za pomocą pary drobno ząbkowanych kleszczy, rozsuń tkankę miękką i powięź, aby odsłonić LCCA. Następnie za pomocą cienkich, gładkich kleszczyków ostrożnie oddziel LCCA od nerwu błędnego.Umieść stały szew z podwójnym węzłem wokół LCCA za pomocą jedwabnego szwu 5-0. Ustaw mysz w pozycji leżącej i obróć rolkę klipsa na nos o 15 stopni. Następnie wysterylizuj obszar chirurgiczny, przecierając skórę trzema naprzemiennymi machnięciami Betadine i 70% etanolu.Wykonaj 0,8-centymetrowe nacięcie na skórze głowy za pomocą mikronożyczek i prostych kleszczy wzdłuż lewego oka i ucha, aby odsłonić mięsień skroniowy. Następnie wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie wzdłuż krawędzi mięśnia skroniowego na lewej kości ciemieniowej. Następnie wykonaj drugie 0,3-centymetrowe pionowe nacięcie na mięśniu skroniowym i cofnij mięsień, aby odsłonić krawędź kości ciemieniowej i kości płaskonabłonkowej.Upewnij się, że wizualizujesz punkt orientacyjny szwu koronalnego między kością czołową a ciemieniową. Następnie zwilż czaszkę, nakładając sterylną sól fizjologiczną, aby odsłonić lewe MCA i zaznacz bliższą gałąź MCA na kości łuskowej markerem. Delikatnie narysuj okrąg o średnicy jednego milimetra otaczający ten zaznaczony obszar za pomocą pneumatycznej wiertarki dentystycznej.Następnie rozrzedzić czaszkę na głębokość około 0,2 milimetra, nie dotykając spodniej opony twardej. Przerwij wiercenie, gdy pozostanie bardzo cienka warstwa kości. Następnie wymieszaj trombinę i roztwór róży bengalskiej w zależności od masy ciała myszy i powoli wstrzyknij mieszaninę do zatoki zaoczodołowej za pomocą igły o rozmiarze 31.Nałóż maść na oczy na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Nałóż oświetlacz światłem laserowym o długości 532 nm na wiercone miejsce w odległości dwóch cali przez 20 minut. Wizualizuj oświetlenie w bliższej gałęzi MCA za pomocą gogli do projekcji laserowej.Po 20 minutach zatrzymaj oświetlenie laserowe. Wykonaj okno czaszki o średnicy trzech milimetrów na kości ciemieniowej czaszki i umieść na nim szkło nakrywkowe. Następnie zlokalizuj dystalne MCA pod soczewką obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie.Oznacz krążącą płytkę krwi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej sprzężonego przeciwciała anty-GP1b-beta DyLight 488 na pięć minut przed obrazowaniem. Następnie po orbicie wstrzyknąć mieszaninę trombiny i roztworu bengalu różanego. Fotoaktywuj MCA za pomocą 532-nanometrowego systemu laserowego z wiązką laserową o średnicy 10 mikrometrów i rejestruj obraz aż do powstania skrzepliny.W celu podania tPA umieść znieczulone zwierzę na ciepłej podkładce o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Owiń jego ogon ciepłą, mokrą gazą o temperaturze 45 stopni Celsjusza na jedną minutę w wybranym punkcie czasowym po fotoaktywacji. Następnie wstrzyknąć rekombinowany ludzki tPA przez żyłę ogonową.Wstrzyknąć 50% w bolusie, a pozostałe 50% w infuzji w ciągu 30 minut za pomocą pompy infuzyjnej. Aby monitorować przepływ krwi w mózgu, wykonaj nacięcie w linii środkowej na skórze głowy z odsłoniętą czaszką. Nawilż czaszkę sterylną solą fizjologiczną i delikatnie nałóż na nią żel ultradźwiękowy, uważając, aby w żelu nie znalazły się włosy ani pęcherzyki powietrza.Monitoruj przepływ krwi w mózgu w obu półkulach mózgowych pod laserowym obrazem kontrastowym przez 10 minut. Znakowanie immunofluorescencyjne pokazuje, że w fotozakrzepicy na bazie barwnika różanego bengalskiego gałąź MCA była gęsto wypełniona płytkami krwi CD41-dodatnimi i niewielką ilością fibryny. Natomiast w fotozakrzepicy trombiny i róży bengalskiej gałąź MCA była okludowana przez losowo zmieszane skrzepy płytek krwi i fibryny.Analiza immunoblottingu wykazała ponad dwukrotny wzrost odkładania się fibryny w półkuli ipsilateralnej w trombinie i fotozakrzepicy różowej bengalskiej w porównaniu z samą różą bengalską. Obrazowanie przyżyciowe oparte na mikroskopie konfokalnym wykazało, że dożylne wstrzyknięcie trombiny nie indukowało agregatów płytek krwi, nawet przy oświetleniu laserowym. Płytki krwi tworzyły jednorodne skrzepy w modelu fotozakrzepicy różowej bengalskiej, ale nierówne agregaty z wieloma słabymi obszarami w modelu trombiny i róży bengalskiej.CBF tej samej myszy przed i 24 godziny po leczeniu tPA w porównaniu z podłożem mierzono za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym i znormalizowano do półkuli przeciwległej. W fotozakrzepicy róży bengalskiej leczenie tPA doprowadziło do tendencji do odzyskiwania CBF, szczególnie w niedokrwiennym obszarze granicznym w porównaniu z myszami leczonymi podłożem. W fotozakrzepicy trombiny i róży bengalskiej odzyskiwanie CBF u myszy leczonych tPA było bardziej widoczne, a proksymalne gałęzie MCA często stawały się widoczne po 24 godzinach.W fotozakrzepicy róży bengalskiej podobny rozmiar zawału wykryto u myszy leczonych nośnikiem i leczonych tPA. W przeciwieństwie do tego, w fotozakrzepicy trombiny i róży bengalskiej, leczenie lityczne tPA znacznie zmniejszyło zawał po 0,5, jednej lub dwóch godzinach, ale nie po sześciu godzinach od fotoaktywacji w porównaniu z myszami leczonymi podłożem, Wytwarzanie fibryny za pośrednictwem trombiny ma kluczowe znaczenie dla tworzenia skrzepliny w tej procedurze. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania składu skrzepów i dalszego badania nad leczeniem trombolitycznem.Po tej procedurze można zastosować inne metody terapii trombolitycznej i określić późniejszą skuteczność. Dodanie trombiny umożliwia dostosowanie składu skrzepu od ubogiego w fibrynę do bogatego w fibrynę, co pozwala naukowcom na opracowanie klinicznie istotnych strategii terapeutycznych.

a-fibrin-enriched-and-tpa-sensitive-photothrombotic-stroke-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę generowania udaru fotozakrzepowego w modelu mysim poprzez laserowe oświetlenie nienaruszonej czaszki po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru fotozakrzepowego w modelu mysim: technika oświetlenia laserowego przez czaszkę myszy po podaniu barwnika światłoczułego w celu wywołania fotozakrzepicy

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Tutaj opisujemy półinwazyjną metodę mikroskopii optycznej do indukcji skrzepu fotozakrzepowego Rose Bengal w korze somatosensorycznej myszy in vivo.  Opisano techniczne aspekty procedury obrazowania, począwszy od indukcji zdarzenia fotozakrzepowego, a skończywszy na zastosowaniu i gromadzeniu danych.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Modele udaru zakrzepowo-zatorowego są kluczowymi narzędziami do optymalizacji terapii rekanalizacyjnej. W tym miejscu przedstawiamy mysi model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu niedotlenienia i niedokrwieniu mózgu (tHI), które wywołuje zakrzepicę i zawał oraz pozytywnie reaguje na fibrynolizację za pośrednictwem tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) w oknie terapeutycznym podobnym do tych u pacjentów po udarze.

Model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu-niedokrwieniu mózgu

Ten manuskrypt opisuje technikę modelowania zawału torebkowego. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną technikę fotozakrzepową o niskim natężeniu światła po przedoperacyjnym mapowaniu celu. Za pomocą tej techniki stworzyliśmy opisany model zawału torebki z trwałym upośledzeniem ruchowym.

Modelowanie zawału torebki opisanej techniką fotozakrzepową

Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.

Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza

Tutaj opisany jest model udaru fotozakrzepowego, w którym udar jest wytwarzany przez nienaruszoną czaszkę poprzez wywołanie trwałej okluzji mikronaczyniowej za pomocą oświetlenia laserowego po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru u myszy: ogniskowe zmiany korowe spowodowane fotozakrzepicą

Stosując całkowicie optyczne podejście, udar niedokrwienny jest indukowany, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów Ca2+ za pomocą fluorescencyjnego biosensora w wyłaniającym się rdzeniu udaru czujnej, zachowującej się myszy.

Jednoczesna fotozakrzemia i fotometria włókien w celu wywołania i monitorowania udaru niedokrwiennego u zachowujących się myszy

Aby zasymulować udar zakrzepowo-zatorowy, do tętnicy środkowej mózgowej wstrzykiwano zatory przygotowane z heterologicznego krwi szczura, a następnie podano trombolizę ogólnoustrojową w celu reanalizacji. Ta wersja modelu jest zoptymalizowana do pracy w sieci wielolaboratoryjnej i wspiera testowanie wielu kandydatów na terapię.

Wielolaboratoryjny model udaru zakrzepowo z trombolizą Stroke Preclinical Assessment Network Stroke: TE-MCAo

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj zmodyfikowany model udaru fototrombotycznego wzbogacony fibryną i trombiną, który tworzy skrzepy podobne do ludzkich i wykazuje wysoką wrażliwość na terapię trombolityczną tPA u myszy.

Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego

Przeglądaj więcej filmów