Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym

Protokół ten może stanowić zmienne odniesienie metodologiczne do zrozumienia skomplikowanej struktury nerwowo-naczyniowej opony twardej czaszki w stanie fizjologicznym lub patologicznym. Wykorzystując przezroczystą oponę twardą w całości, można zademonstrować przestrzenną korelację immunoreaktywnych włókien nerwowych i naczyń krwionośnych opony twardej CGRP w widoku 3D. Po eutanazji szczura, transcardially perfundowano go 100 mililitrami 0,9% normalnej soli fizjologicznej, a następnie 250 do 300 mililitrami 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym.

Po zakończeniu usuń skórę głowy i otwórz czaszkę, aby odsłonić oponę twardą i grzbietową stronę mózgu. Wypreparuj oponę twardą czaszki wzdłuż pnia mózgu do opuszki węchowej w całym wzorze montażu. Przepłukać oponę twardą czaszki w 0,1-molowym buforze fosforanowym przez około jedną minutę i inkubować ją w roztworze blokującym.

Przenieś oponę twardą do mysiego przeciwciała anty-CGRP na noc. Następnego dnia przemyć oponę twardą trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Inkubować oponę twardą w mieszanym roztworze przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom Alexa Fluor 488 i falloidyny 568 w 0,1.

Molowy bufor fosforanowy zawierający 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj oponę twardą trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym, przytnij krawędzie i zamontuj na szkiełkach mikroskopowych. Przed obserwacją założyć szkiełka nakrywkowe z 50% gliceryną.

Zobrazuj całą oponę twardą za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie wykonaj zdjęcia immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i naczyń krwionośnych znakowanych falloidyną w oponie twardej za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ogol głowę szczura elektryczną maszynką do golenia, a następnie przyłóż nauszniki do szczura i umieść je na urządzeniu stereotaktycznym. Ustaw uchwyt na usta i nałóż maść okulistyczną na oczy.

Oczyść chirurgiczną stronę skóry głowy za pomocą 75% etanolu i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy. Tępo usuń okostną i tkanki mięśniowe z czaszki za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Wywierć mały otwór za pomocą wiertła do zadziorów z okrągłą końcówką na lewej kości ciemieniowej i skroniowej powyżej środkowej tętnicy oponowej.

Zbuduj bank wokół otworu z dentystycznym cementem krzemianowym i dodaj dwa mikrolitry fluorogold do otworu wokół środkowej tętnicy oponowej za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Przykryj otwór małym kawałkiem gąbki hemostatycznej. Połóż kawałek folii parafinowej na otworze i uszczelnij krawędzie woskiem kostnym.

Zszyj ranę sterylną nicią. Trzymaj szczury w ciepłym miejscu, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Następnie zawróć szczury z powrotem do ich klatek.

Po siedmiu dniach przeżycia należy przeprowadzić perfuzję tych szczurów z 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Wyciąć TG i szyjkę macicy od jednego do czterech DRG, a następnie przeciąć je na grubość 30 mikrometrów na systemie mikrotomu kriostatu w kierunku strzałkowym. I zamontuj sekcje na szkiełkach szklanych pokrytych silanem.

Zakreślić skrawki pisakiem histochemicznym i inkubować je przez 30 minut w roztworze blokującym. Przenieść próbki do roztworu króliczego przeciwciała anty-fluorogold i mysiego przeciwciała anty-CGRP i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przemyć skrawki trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym.

Umyte skrawki inkubować w mieszanym roztworze przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi Alexa Fluor 594 i przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom Alexa Fluor 488. Następnie umyj je trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym i nałóż szkiełka nakrywkowe z 50% gliceryną do obserwacji. Zrób zdjęcia neuronów znakowanych fluorozłotem w TG i DRG w świetle UV za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Następnie uchwyć obrazy neuronów znakowanych fluorozłotem i CGRP w TG i DRG. Po immunofluorescencyjnym i fluorescencyjnym barwieniu histochemicznym CGRP i falloidyną, immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP i tętniczki oponowe i tkanki łączne znakowane falloidyną zostały wyraźnie uwidocznione na całej powierzchni opony twardej czaszki we wzorze 3D. Zarówno grube, jak i cienkie immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP biegną równolegle do tętnic oponowych wokół ściany naczyniowej lub między naczyniami krwionośnymi.

Siedem dni po zastosowaniu fluorogoldu w okolicy środkowej tętnicy oponowej i opony twardej czaszki szczura, neurony znakowane fluorozłotem wykryto w TG i szyjce macicy DRG po ipsilateralnej stronie aplikacji znacznika, co bezpośrednio obserwowano pod oświetleniem UV mikroskopii fluorescencyjnej. Neurony znakowane fluorozłotem znaleziono we wszystkich trzech gałęziach TG, z wyższymi stężeniami w podziale ocznym i szczękowym oraz z niższymi stężeniami w podziale żuchwy. Niektóre z neuronów znakowanych fluorozłotem zaobserwowano również w dwóch do trzech DRG szyjki macicy.

Te reprezentatywne fotografie z podwójną immunofluorescencją pokazują neurony czuciowe w TG i DRG. Znakowane neurony z FG, CGRP i zarówno FG, jak i CGRP zostały uwidocznione przez podwójną immunofluorescencję. Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby całkowicie wyciąć oponę twardą czaszki i wkleić ją na szkiełku w całym wzorze mocowania.