Name: Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki szczura przy użyciu immunofluorescencji oraz śledzenia wstecznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez projekt National Key R&D Program of China (kod projektu nr 2019YFC1709103; nr 2018YFC1707804) oraz National Natural Science Foundation of China (kod projektu nr 81774211; nr 81774432; nr 81801561).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (numer referencyjny D2018-09-29-1). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano dwanaście dorosłych samców szczurów rasy Sprague-Dawley (masa ciała 220 ± 20 g). Zwierzęta [numer licencji SCXK (JING) 2017-0005] zostały dostarczone przez National Institutes for Food and Drug Control.
1. Unerwienie opony twardej czaszki szczura
<ol>
	<li>Perfuzje
	<ol>
		<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć szczurowi nadmierną dawkę roztworu tribromoetanolu (250 mg/kg) w celu wywołania eutanazji.</li>
		<li>Gdy oddech ustaje, perfuzję przezsercową ze 100 ml 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 250-300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4).</li>
		<li>Po perfuzji usuń skórę głowy i otwórz czaszkę, aby odsłonić oponę twardą i grzbietową stronę mózgu. Następnie wypreparuj oponę twardą czaszki wzdłuż pnia mózgu do opuszki węchowej we wzorze całego montażu (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1). Wykonać utrwalenie w 4% paraformaldehydzie przez 2 godziny, a następnie krioprotekcję w 25% sacharozie w 0,1 M PB przez ponad 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia fluorescencyjna do znakowania CGRP i falloidyny 
	UWAGA: Zastosowano kombinację barwienia fluorescencyjnego CGRP i falloidyny, aby ujawnić przestrzenną korelację włókien nerwowych opony twardej i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki szczura we wzorze całego mocowania.
	<ol>
		<li>Płucz oponę twardą czaszki w 0,1 M PB przez około 1 minutę.</li>
		<li>Inkubować oponę twardą w roztworze blokującym zawierającym 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w 0,1 M PB przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść oponę twardą do mysiego przeciwciała anty-CGRP (1:1000) w 0,1 M PB zawierającego 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C11.</li>
		<li>Następnego dnia umyć oponę twardą trzykrotnie w 0,1 M PB.</li>
		<li>Inkubować oponę twardą w mieszanym roztworze przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom Alexa Fluor 488 (1:500) i falloidyny 568 (1:1000) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (26 °C).</li>
		<li>Umyć oponę twardą trzy razy w 0,1 M PB.</li>
		<li>Przytnij krawędzie i zamontuj go na szkiełkach mikroskopowych (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przed obserwacją nałóż szkiełka nakrywkowe z 50% gliceryną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja i rejestracja
	<ol>
		<li>Obserwuj próbki fluorescencyjne pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym systemem obrazowania.</li>
		<li>Wykonaj zdjęcia opony twardej w całości za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową (4x, NA: 0,13) i użyj czasu naświetlania 500 ms. Mozaiki obrazowe opony twardej uzupełniono za pomocą oprogramowania mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wykonaj zdjęcia immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i naczyń krwionośnych znakowanych falloidyną w oponie twardej za pomocą mikroskopu konfokalnego. Długości fal wzbudzenia i emisji wynosiły 488 nm (kolor zielony) i 594 nm (kolor czerwony). Otworek konfokalny wynosi 110 (20x) i 105 μm (40x). Rozdzielczość przechwytywania obrazu wynosi 640 x 640 pikseli.</li>
		<li>Uchwyć 20 obrazów w klatkach 2 μm z każdego przekroju o grubości 40 μm i wykonaj pojedynczą integrację obrazu w ostrości z systemem oprogramowania powiązanego z konfokalnym przetwarzaniem obrazu do analizy 3D w następujący sposób: Ustaw początkową płaszczyznę ogniskową | Ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej | Ustawianie rozmiaru kroku | Wybierz wzór głębokości | Przechwytywanie obrazu | Seria Z.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do edycji zdjęć, aby dostosować jasność i kontrast obrazów w celu optymalizacji wizualizacji. Zwróć uwagę, aby nie usuwać żadnych danych z obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Badanie śledzenia wstecznego z FG
<ol>
	<li>Zabiegi chirurgiczne
	<ol>
		<li>Określ obszar współrzędnych zainteresowania w oponie twardej czaszki szczura.</li>
		<li>Przygotuj mikrostrzykawkę o pojemności 10 μl i przetestuj ją z płynną parafiną.</li>
		<li>Znieczulić szczury roztworem tribromoetanolu (150 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
		<li>Ogol głowę szczura elektryczną maszynką do golenia.</li>
		<li>Przyłóż pręty do uszu szczura i umieść je na urządzeniu stereotaktycznym. Następnie załóż uchwyt na usta i nałóż maść okulistyczną na oczy.</li>
		<li>Oczyść miejsce operacji skóry głowy za pomocą 10% jodu powidonu, a następnie 75% etanolu.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy.</li>
		<li>Tępo usuń okostną i tkanki mięśniowe z czaszki za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A).</li>
		<li>Wywierć mały otwór (~5-7 mm) za pomocą wiertła do zadziorów z wiertłem z okrągłą końcówką (#106) na lewej kości ciemieniowej i skroniowej powyżej MMA12, i upewnij się, że opona twarda czaszki pozostała nienaruszona (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Zbuduj bank wokół otworu z dentystycznym cementem krzemianowym, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się znacznika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Dodaj 2 μl 2% FG do otworu wokół MMA za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
		<li>Przykryj otwór małym kawałkiem gąbki hemostatycznej.</li>
		<li>Połóż kawałek folii parafinowej na otworze i uszczelnij krawędzie woskiem kostnym, aby zapobiec wyciekowi znacznika i uniknąć zanieczyszczenia otaczających tkanek.</li>
		<li>Zszyj ranę sterylną nicią.</li>
		<li>Trzymaj szczury w ciepłym miejscu, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.</li>
		<li>Wróć szczury z powrotem do ich klatek i dodaj antybiotyk i środek przeciwbólowy do wody pitnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzje i sekcje
	<ol>
		<li>Po 7 dniach przeżycia należy przeprowadzić perfuzję u tych szczurów, jak wspomniano powyżej w procedurach w punkcie 1.1.</li>
		<li>Wypreparuj DRG TG i C1-4, a następnie wykonaj je po naprawie i zabezpiecz kriogenicznie, jak wspomniano powyżej w sekcji 1.1.3 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
		<li>Wyciąć TG i DRG o grubości 30 μm na mikrotomie kriostatu w kierunku strzałkowym i zamontować na szkiełkach pokrytych silanem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwójne immunofluorescencje do znakowania FG i CGRP w TG i DRGs 
	UWAGA: Chociaż znakowanie FG można bezpośrednio zaobserwować przy oświetleniu UV pod lampą rtęciową bez dodatkowego barwienia13,14,15,16, znakowane neurony z FG były dalej badane w TG i szyjkach macicy DRG przy użyciu podwójnych immunofluorescencji z FG i CGRP w celu ujawnienia pochodzenia opornych CGRP-immunoreaktywnych włókien nerwowych w TG i DRG.
	<ol>
		<li>Zakreśl sekcje pisakiem histochemicznym.</li>
		<li>Inkubować skrawki przez 30 minut w roztworze blokującym zawierającym 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w 0,1 M PB.</li>
		<li>Przenieść próbki do roztworu króliczego przeciwciała antyfluorozłotego (1:1000) i mysiego przeciwciała anty-CGRP (1:1000) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia umyć skrawki trzykrotnie w 0,1 M PB.</li>
		<li>Inkubować w mieszanym roztworze przeciwciała anty-królika Alexa Fluor 594 (1:500) (1:500) i przeciwciała anty-myszego osła Alexa Fluor 488 (1:500) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć i nałożyć szkiełka nakrywkowe na skrawki, jak to opisano w krokach 1.2.6 i 1.2.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja i rejestracja
	<ol>
		<li>Wykonaj zdjęcia neuronów znakowanych FG w TG i DRG w świetle UV za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową.</li>
		<li>Uchwyć obrazy neuronów znakowanych FG i CGRP w TG i DRG pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do edycji, aby dostosować jasność i kontrast obrazów oraz dodać etykiety na zdjęciach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+Head+and+Neck%2C+Dura+Mater%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li>
<li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+contributions+to+migraine%3A+moving+beyond+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li>
<li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Headache%22%5BJournal%5D)">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).</li>
<li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).</li>
<li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li>
<li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat%3A+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li>
<li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+receptor-like+receptor+%28CLR%29%2C+receptor+activity-modifying+protein+1+%28RAMP1%29%2C+and+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system%3A+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li>
<li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%3A+Official+Journal+of+the+American+Pain+Society%22%5BJournal%5D)">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li>
<li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+%22Taichong%22+%28LR3%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Zhen+Ci+Yan+Jiu%22%5BJournal%5D)">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li>
<li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+%28ST+36%29+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Integrative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li>
<li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li>
<li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li>
<li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li>
<li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+%28G-CSF%29+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord%3A+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+neural+circuits%22%5BJournal%5D)">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6(2014).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+express+%CE%B1-smooth+muscle+actin%2C+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861(2018).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li>
<li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoro-Gold%3A+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu udało nam się wykazać rozmieszczenie i pochodzenie immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP w oponie twardej czaszki przy użyciu immunofluorescencji, rekonstrukcji 3D i metod śledzenia neuronalnego za pomocą przeciwciała CGRP i znacznika neuronalnego FG, dostarczając dowodów histologicznych i chemicznych w celu lepszego zrozumienia sieci nerwowo-naczyniowej opony twardej.
Jak wiadomo, CGRP odgrywa kluczową rolę w patogenezie migreny 4,17<sup cla...

Opona twarda czaszki jest najbardziej zewnętrzną warstwą opon mózgowych chroniącą mózg i zawiera liczne naczynia krwionośne oraz różne rodzaje włókien nerwowych1,2. Wiele badań wykazało, że uwrażliwiona opona twarda czaszki może być kluczowym czynnikiem prowadzącym do wystąpienia bólów głowy, obejmujących nieprawidłowe rozszerzenie naczyń krwionośnych i unerwienie3,4,5. Tak więc wiedza na temat struktury nerwowo-naczyniowej w oponie twardej czaszki jest ważna dla zrozumienia patogenezy bólów głowy, zwłaszcza migreny.
Chociaż unerwienie opony twardej było wcześniej badane za pomocą konwencjonalnej immunohistochemii, korelacja przestrzenna włókien nerwowych i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki była mniej zbadana6,7,8,9. W celu bardziej szczegółowego ujawnienia struktury nerwowo-naczyniowej opony twardej, peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) i falloidyna zostały wybrane jako markery do odpowiedniego barwienia włókien nerwowych opony twardej i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki z całą mocowaną oponą twardą za pomocą immunofluorescencji i histochemii fluorescencyjnej10. Może to być optymalny wybór w celu uzyskania trójwymiarowego (3D) widoku struktury nerwowo-naczyniowej. Dodatkowo fluorogold (FG) nałożono na obszar wokół tętnicy oponowej środkowej (MMA) w oponie twardej czaszki w celu określenia pochodzenia immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i prześledzono zwoje zwoju nerwu trójdzielnego (TG) i zwoje korzenia grzbietowego szyjki macicy (C) (DRG), podczas gdy neurony znakowane FG były dalej badane razem z CGRP za pomocą immunofluorescencji.
Celem tego badania było dostarczenie skutecznego narzędzia do badania struktury nerwowo-naczyniowej w oponie twardej czaszki pod kątem unerwienia CGRP-immunoreaktywnego i jego pochodzenia. Wykorzystując przezroczystą oponę twardą z całym mocowaniem i łącząc immunofluorescencję, śledzenie wsteczne, techniki konfokalne i rekonstrukcję 3D, spodziewaliśmy się przedstawić nowatorski widok 3D struktury nerwowo-naczyniowej w oponie twardej czaszki. Te podejścia metodologiczne mogą być dalej wykorzystywane do badania patogenezy różnych bólów głowy.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 osł anty-mysi IgG (H+L)</td><td>Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific</td><td>A21202</td><td>Chronić przed światłem; RRID: AB_141607</td></tr><tr><td>Instrument do stereotaksji mózgu</td><td>Narishige</td><td>SR-50</td><td></td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>Olympus</td><td>Wersja 1.1</td><td>Oprogramowanie mikroskopu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>System obrazowania konfokalnego</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold (FG)</td><td>Fluorochrome</td><td>52-9400</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>System obrazowania fluorescencyjnego</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do zamrażania</td><td>Thermo</td><td>Microm International&nbsp; </td><td></td>GmbH</tr><tr><td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td><td>Olympus</td><td>Version 4.2</td><td>Konfokalny system oprogramowania do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Marathon-N7</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-CGRP</td><td>Abcam</td><td>ab81887</td><td>RRID: AB_1658411</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna 568</td><td>Molekularny& nbsp; Sondy</td><td>A12380</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Photoshop i&nbsp; Ilustracja</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td>Oprogramowanie do edycji zdjęć</td></tr><tr><td>Królik anty-Fluorogold</td><td>Abcam</td><td>ab153</td><td>RRID: AB_90738</td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>Narodowe Instytuty Kontroli Żywności i Leków</td><td>SCXK (JING) 2014-0013</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost plus</td><td>Thermo</td><td>#4951PLUS-001</td><td>25x75x1mm</td></tr></tbody></table>

wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Celem tego badania było zbadanie dystrybucji i pochodzenia immunoreaktywnych czuciowych włókien nerwowych peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w oponie twardej czaszki za pomocą techniki immunofluorescencji, trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji i śledzenia wstecznego. W tym przypadku włókna nerwowe i naczynia krwionośne zostały wybarwione przy użyciu technik immunofluorescencyjnych i histochemicznych odpowiednio CGRP i fluorescencyjnej falloidyny. Korelację przestrzenną CGRP z immunologicznymi włóknami nerwowymi i naczyniami krwionośnymi wykazano za pomocą rekonstrukcji 3D. Tymczasem pochodzenie immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP wykryto za pomocą techniki śledzenia neuronalnego za pomocą fluorogoldu (FG) z obszaru wokół środkowej tętnicy oponowej (MMA) w oponie twardej czaszki do zwoju nerwu trójdzielnego (TG) i zwojów korzenia grzbietowego szyjki macicy (C) (DRG). Ponadto zbadano również charakterystykę chemiczną neuronów znakowanych FG w TG i DRG razem z CGRP przy użyciu podwójnej immunofluorescencji. Korzystając z przezroczystej próbki z całego montażu i rekonstrukcji 3D, wykazano, że immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP i tętniczki znakowane falloidyną biegną razem lub oddzielnie, tworząc sieć nerwowo-naczyniową opony twardej w widoku 3D, podczas gdy neurony znakowane FG znaleziono w gałęziach ocznych, szczękowych i żuchwowych TG, a także C2-3 DRG ipsilateralnie po stronie aplikacji znacznika, w której niektóre neurony znakowane FG wykazywały ekspresję immunoreaktywną CGRP. Dzięki tym podejściom wykazaliśmy charakterystykę dystrybucji immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP wokół naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki, a także pochodzenie tych włókien nerwowych z TG i DRG. Z punktu widzenia metodologii może stanowić cenne odniesienie do zrozumienia skomplikowanej struktury nerwowo-naczyniowej opony twardej czaszki w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.

Struktura naczyniowo-nerwowa opony twardej czaszki 
Po barwieniu immunofluorescencyjnym i fluorescencyjnym histochemicznym z użyciem CGRP i falloidyny, CGRP-immunoreaktywne włókna nerwowe oraz oznakowane falloidyną tętniczki oponowe i tkanki łączące zostały wyraźnie wykazane w całej preparacie opony twardej czaszki w układzie 3D (Rysunek 2C,D,E,F). Wykazano, że zarówno grube, jak i cienkie CGRP-immunoreaktywne włókna nerwo...

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji przestrzennej korelacji peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) - immunoreaktywnych włókien nerwowych i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki za pomocą immunofluorescencji i histochemii fluorescencyjnej odpowiednio z CGRP i falloidyną. Ponadto pochodzenie tych włókien nerwowych zostało prześledzone wstecznie za pomocą fluorescencyjnego znacznika neuronowego.

Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Protokół ten może stanowić zmienne odniesienie metodologiczne do zrozumienia skomplikowanej struktury nerwowo-naczyniowej opony twardej czaszki w stanie fizjologicznym lub patologicznym. Wykorzystując przezroczystą oponę twardą w całości, można zademonstrować przestrzenną korelację immunoreaktywnych włókien nerwowych i naczyń krwionośnych opony twardej CGRP w widoku 3D. Po eutanazji szczura, transcardially perfundowano go 100 mililitrami 0,9% normalnej soli fizjologicznej, a następnie 250 do 300 mililitrami 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym.Po zakończeniu usuń skórę głowy i otwórz czaszkę, aby odsłonić oponę twardą i grzbietową stronę mózgu. Wypreparuj oponę twardą czaszki wzdłuż pnia mózgu do opuszki węchowej w całym wzorze montażu. Przepłukać oponę twardą czaszki w 0,1-molowym buforze fosforanowym przez około jedną minutę i inkubować ją w roztworze blokującym.Przenieś oponę twardą do mysiego przeciwciała anty-CGRP na noc. Następnego dnia przemyć oponę twardą trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Inkubować oponę twardą w mieszanym roztworze przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom Alexa Fluor 488 i falloidyny 568 w 0,1.Molowy bufor fosforanowy zawierający 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj oponę twardą trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym, przytnij krawędzie i zamontuj na szkiełkach mikroskopowych. Przed obserwacją założyć szkiełka nakrywkowe z 50% gliceryną.Zobrazuj całą oponę twardą za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie wykonaj zdjęcia immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i naczyń krwionośnych znakowanych falloidyną w oponie twardej za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ogol głowę szczura elektryczną maszynką do golenia, a następnie przyłóż nauszniki do szczura i umieść je na urządzeniu stereotaktycznym. Ustaw uchwyt na usta i nałóż maść okulistyczną na oczy.Oczyść chirurgiczną stronę skóry głowy za pomocą 75% etanolu i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy. Tępo usuń okostną i tkanki mięśniowe z czaszki za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Wywierć mały otwór za pomocą wiertła do zadziorów z okrągłą końcówką na lewej kości ciemieniowej i skroniowej powyżej środkowej tętnicy oponowej.Zbuduj bank wokół otworu z dentystycznym cementem krzemianowym i dodaj dwa mikrolitry fluorogold do otworu wokół środkowej tętnicy oponowej za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Przykryj otwór małym kawałkiem gąbki hemostatycznej. Połóż kawałek folii parafinowej na otworze i uszczelnij krawędzie woskiem kostnym.Zszyj ranę sterylną nicią. Trzymaj szczury w ciepłym miejscu, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Następnie zawróć szczury z powrotem do ich klatek.Po siedmiu dniach przeżycia należy przeprowadzić perfuzję tych szczurów z 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Wyciąć TG i szyjkę macicy od jednego do czterech DRG, a następnie przeciąć je na grubość 30 mikrometrów na systemie mikrotomu kriostatu w kierunku strzałkowym. I zamontuj sekcje na szkiełkach szklanych pokrytych silanem.Zakreślić skrawki pisakiem histochemicznym i inkubować je przez 30 minut w roztworze blokującym. Przenieść próbki do roztworu króliczego przeciwciała anty-fluorogold i mysiego przeciwciała anty-CGRP i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przemyć skrawki trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym.Umyte skrawki inkubować w mieszanym roztworze przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi Alexa Fluor 594 i przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom Alexa Fluor 488. Następnie umyj je trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym i nałóż szkiełka nakrywkowe z 50% gliceryną do obserwacji. Zrób zdjęcia neuronów znakowanych fluorozłotem w TG i DRG w świetle UV za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Następnie uchwyć obrazy neuronów znakowanych fluorozłotem i CGRP w TG i DRG. Po immunofluorescencyjnym i fluorescencyjnym barwieniu histochemicznym CGRP i falloidyną, immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP i tętniczki oponowe i tkanki łączne znakowane falloidyną zostały wyraźnie uwidocznione na całej powierzchni opony twardej czaszki we wzorze 3D. Zarówno grube, jak i cienkie immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP biegną równolegle do tętnic oponowych wokół ściany naczyniowej lub między naczyniami krwionośnymi.Siedem dni po zastosowaniu fluorogoldu w okolicy środkowej tętnicy oponowej i opony twardej czaszki szczura, neurony znakowane fluorozłotem wykryto w TG i szyjce macicy DRG po ipsilateralnej stronie aplikacji znacznika, co bezpośrednio obserwowano pod oświetleniem UV mikroskopii fluorescencyjnej. Neurony znakowane fluorozłotem znaleziono we wszystkich trzech gałęziach TG, z wyższymi stężeniami w podziale ocznym i szczękowym oraz z niższymi stężeniami w podziale żuchwy. Niektóre z neuronów znakowanych fluorozłotem zaobserwowano również w dwóch do trzech DRG szyjki macicy.Te reprezentatywne fotografie z podwójną immunofluorescencją pokazują neurony czuciowe w TG i DRG. Znakowane neurony z FG, CGRP i zarówno FG, jak i CGRP zostały uwidocznione przez podwójną immunofluorescencję. Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby całkowicie wyciąć oponę twardą czaszki i wkleić ją na szkiełku w całym wzorze mocowania.

visualizing-calcitonin-gene-related-peptide-immunoreactive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Źródło: Wang, J., et al. Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym. J. Vis. Exp. (2021).  Ten film demonstruje metodę śledzenia pochodzenia neuronów czuciowych w oponie twardej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Znacznik wsteczny jest wprowadzany do odsłoniętej opony twardej znieczulonego szczura. Znacznik jest pobierany przez czuciowe aksony neuronów i przemieszcza się...

Badanie pochodzenia neuronów czuciowych w oponie twardej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Obecny protokół opisuje model uwalniania peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) ex vivo oraz strategię ilościowego określania wpływu środków farmakologicznych na ilość CGRP uwalnianego z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni.

Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

Grubość skrawków tkanek ograniczała badanie morfologiczne unerwienia skóry. Niniejszy protokół opisuje unikalną technikę oczyszczania tkanek w celu wizualizacji włókien nerwowych skóry w grubych skrawkach tkanki o grubości 300 μm pod mikroskopią konfokalną.

Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę wizualizacji immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki szczura przy użyciu immunofluorescencji oraz śledzenia wstecznego.

Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym

Przeglądaj więcej filmów