Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów związanych z obecnie zaostrzoną terapią kardiologiczną, takich jak niska przydatność do niskiej retencji i przeżycia przeszczepionych komórek w sercach z zawałem. Aby rozwiązać ten problem, metoda ta może zapewnić wiarygodną technikę badania przeszczepu wewnątrzmięśniowego komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli do wstrzykiwań w modelu mysim, który jest doskonałą platformą do wykorzystania do badania naprawy i regeneracji tkanki serca po zawale mięśnia sercowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to wykonalna metoda poprawy retencji i przeżycia przeszczepionych komórek macierzystych po przeszczepie do mięśnia sercowego przy użyciu hydrożeli do wstrzykiwań typu cross-link in situ.

Hydrożele te oferują różnorodne możliwości w inżynierii tkankowej serca, takie jak dostarczanie nie tylko komórek macierzystych, ale także czynników wzrostu, materiałów genetycznych i leków, aby zmaksymalizować ich efekt terapeutyczny w tkankach serca z zawałem. Procedurę eksperymentu in vitro zademonstruje Eunmi Lee, technolog badawczy z mojego laboratorium. Technolodzy z Eun-Hye Park i Eunhwa Seong zademonstrują procedurę eksperymentów in vivo.

Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSCs w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, umyj naczynie dwukrotnie DPBS i inkubuj je z jednym mililitrem substytutu trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej do komórek i odwiruj je w temperaturze 500 razy G przez trzy minuty.

Odrzucić otrzymany supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze PBS i utrzymywać zawiesinę komórek na lodzie. Rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek 10 mikrolitrami błękitu trypanowego i oznaczyć stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.

Ponownie zawiesić MSC do gęstości od jednego razy 10 do siódmych komórek na mililitr i przenieść je do probówki o pojemności jednego mililitra. Przygotować skoniugowany roztwór 6,25% GH w PBS i rozdzielić go na dwie fiolki. Następnie wymieszaj roztwory GH z sześcioma mikrogramami na mililitr HRP lub 0,07% nadtlenkiem wodoru.

Krótko odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 1000 razy G i ostrożnie odessać powstały supernatant. Następnie wymieszać osad komórkowy z roztworem GH A. Załadować MSC w roztworze GH A i roztworze GH B po obu stronach podwójnej strzykawki. Umieść 300 mikrolitrów połączonych roztworów GH z MSC o końcowej gęstości 5 milionów komórek na mililitr na szkiełku z ośmioma dołkami.

Po utworzeniu hydrożelu in situ, a następnie enkapsulacji MSC poprzez sieciowanie enzymatyczne, dodaj 700 mikrolitrów DMEM zawierającego 10% FBS i 1% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i wymieniać pożywkę co dwa do trzech dni. Przed zabiegiem należy opróżnić klatkę piersiową myszy za pomocą kremu do depilacji i wysterylizować skórę jodem.

Umieść mysz na stole operacyjnym i zaintubuj ją, wprowadzając cewnik do tchawicy, aby zapewnić dodatkowy tlen przez wentylację mechaniczną. Delikatnie przeciąć skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie penetruj mięśnie międzyżebrowe mikronożyczkami.

Oddziel drugie i trzecie lewe żebro za pomocą jedwabnego szwu 5-O, aby utrzymać otwartą jamę klatki piersiowej. Ostrożnie podwiązać lewą przednią zstępującą tętnicę wieńcową za pomocą uchwytu na igłę z 8-0 Szew polipropylenowy i przeciąć szew za pomocą elektrokoagulacji. Obserwuj natychmiastową zmianę koloru w przedniej ścianie lewej komory.

Po wywołaniu zawału mięśnia sercowego wstrzyknąć 10 mikrolitrów roztworów GH ładujących MSC do dwóch różnych punktów w strefie granicznej zawału. Przywróć otwartą jamę klatki piersiowej i zamknij mięśnie i skórę za pomocą szwów 5-0. Wyjmij rurkę dotchawiczą i umieść mysz w klatce pod lampą podczerwieni podczas rekonwalescencji.

Wykonaj echokardiografię i zmierz odpowiednie linie dla przedniej ściany lewej komory, wewnętrznej i tylnej lewej komory, aby uzyskać grubość ściany serca, wymiar komory i skrócenie frakcji. Przed przeszczepieniem in vivo proliferację i przeżywalność MSCs w hydrażelach GH potwierdzono za pomocą testu barwienia 3D żywych martwych komórek in vitro. Reprezentatywne obrazy wykazały wystarczającą proliferację MSC, co wskazuje na rozgałęzione sieci w obrębie hydrożeli GH.

Rozległa wielokomórkowa struktura 3D MSCs została wyraźnie zaobserwowana w 14 dniu, co wskazuje, że hydrożele GH mogą zapewnić odpowiednie mikrośrodowisko dla zamkniętych komórek. Po indukcji zawału mięśnia sercowego hydrożele GH ładujące MSC zostały przeszczepione domięśniowo w okolice zawału. MSCs i żel były odpowiednio podtrzymywane w okolicy zawału.

MSCs były dobrze zintegrowane z hydrożelami GH. W celu zweryfikowania efektów terapeutycznych hydrożeli GH ładujących MSC, zmiany w funkcji i strukturze serca oceniono za pomocą echokardiografii i analizy histologicznej w 28. dniu po przeszczepieniu i porównano je między różnymi grupami leczenia. Reprezentatywna echokardiografia wykazała poprawę funkcji serca, w tym skrócenie frakcyjne, frakcję wyrzutową i końcową objętość skurczową w grupie leczonej żelem MSC.

Ponadto analiza histologiczna wykazała mniejsze zwłóknienie, grubsze ściany zawału i mniejszy rozmiar zawału w grupie leczonej żelem MSC niż w pozostałych grupach, co wskazuje, że protokół ten znacznie osłabił przebudowę lewej komory. Korzystając z tej techniki, uzyskaliśmy długoterminową proliferację komórek macierzystych i doprowadziła do znacznej poprawy struktury i funkcji serca po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim. Technika ta może zostać rozszerzona do stosowania u dużych zwierząt i do zastosowania klinicznego jako nowa strategia zapobiegania pozawałowej niewydolności serca poprzez zapewnienie naprawy i regeneracji tkanki serca.