Name: Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj technikę domięśniowego przeszczepienia komórek macierzystych z użyciem hydrożeli żelatynowych w modelu mysim. Ta metoda poprawia retencję i przeżywalność komórek w tkance sercowej po zawale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania są wspierane przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (NRF-2018R1D1A1A02049346)

Wszystkie procedury badań na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt Laboratoryjnych, Przewodnikiem do Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych oraz Wytycznymi i Zasadami Eksperymentów na Gryzoniach dostarczonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Szkole Medycznej Katolickiego Uniwersytetu Korei.
1. Przygotowanie MSCs i hydrożeli żelatynowych do wstrzykiwania
<ol>
	<li>Hodowla MSCs w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Gdy wzrost MSCs osiągnie 80% zbieżności, umyj naczynie dwukrotnie DPBS i dodaj 1 ml substytutu trypsyny w temperaturze 37 °C przez 3 min. 
	UWAGA: MSCs wyizolowano z mysiego szpiku kostnego zgodnie z konwencjonalnymi procedurami16, hodowano w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego i zastosowano między pasażem 7\u20129 w tym badaniu.</li>
	<li>Dodać 9 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 500 x g przez 3 min. Następnie wyrzuć powstały supernatant, ponownie zawieś komórki w 1 ml PBS i utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek w 10 μl błękitu trypanowego i uzyskać stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić i przenieść MSCs do probówki o pojemności 1 ml o gęstości 1 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Przygotować 6,25% wag. sprzężonego roztworu GH w PBS i rozdzielić na 2 fiolki. Następnie wymieszać roztwory GH z 6 μg/ml HRP (roztwór GH A) lub 0,07% wag.H2O2 (roztwór GH B). 
	UWAGA: Przygotuj koniugaty kwasu żelatynowo-hydroksyfenylowo-propionowego (GH) zgodnie z opublikowanymi protokołami12,15.
	<ol>
		<li>Zachowaj stosunek objętościowy roztworu sprzężonego GH do HRP (roztwór GH A) i roztworu sprzężonego GH doH2O2 (roztwór GH B) w stosunku 9:1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed zmieszaniem MSCs z roztworem GH A należy krótko odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 1 000 x g i ostrożnie odessać powstały supernatant. Następnie wymieszać osad zawierający MSCs z roztworem GH A.</li>
</ol>
2. Ładowanie MSC in situ i trójwymiarowa hodowla in vitro
<ol>
	<li>Umieścić roztwór GH A (zawierający MSC) i roztwór GH B po obu stronach podwójnej strzykawki. Umieścić 300 μl połączonych roztworów GH z MSCs o końcowej gęstości 5 x 106 komórek/ml na szkiełku ośmiodołkowym.</li>
	<li>Po utworzeniu hydrożelu in situ, a następnie enkapsulacji MSC poprzez sieciowanie enzymatyczne, dodaj 700 μl DMEM zawierającego 10% FBS i 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy.</li>
	<li>Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i wymieniać pożywkę co 2–3 dni.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie proliferacji in vitro i przeżywalności MSCs w hydrożelach GH
<ol>
	<li>Aby określić żywotność MSCs hodowanych w 3D w hydrożelach GH, należy użyć testu barwienia żywych/martwych komórek po określonym czasie inkubacji.</li>
	<li>Po inkubacji zamkniętych w kapsułkach MSCs w hydrożelach GH przez 3, 5, 7 lub 14 dni, należy zassać pożywkę i dwukrotnie przemyć studzienkę PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący zawierający 5 μl kalceiny AM i 20 μl homodimeru etydyny-1 (EthD-1) w 10 ml DPBS.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu barwiącego do studzienki i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zassać roztwór barwiący i dwukrotnie umyć studzienkę PBS.</li>
	<li>Ostrożnie oddzielić komorę od szkiełka i nałożyć pełne szkiełko nakrywkowe na hydrożele GH. Użyj mikroskopii konfokalnej, aby zobrazować stopień proliferacji i zmiany morfologiczne zamkniętych MSCs. 
	UWAGA: Obrazy fluorescencyjne uzyskano w 200-krotnym powiększeniu i zobrazowano na długościach fal wzbudzenia/emisji 470/540 nm dla kalceiny i 516/607 nm dla EthD-1.</li>
</ol>
4. Indukcja zawału mięśnia sercowego u myszy
<ol>
	<li>Znieczulenie 7-tygodniowego samca myszy C57BL/6 (20\u201222 g) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny Zoletil (30 mg/kg) i Rompun (10 mg/kg) w soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy zdepilować klatkę piersiową myszy za pomocą kremu do depilacji i wysterylizować skórę jodem.</li>
	<li>Umieść mysz na stole operacyjnym i zaintubuj, wkładając cewnik do tchawicy, aby zapewnić dodatkowy tlen poprzez wentylację mechaniczną.</li>
	<li>Delikatnie przetnij skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych, a następnie przebij mięśnie międzyżebrowe za pomocą mikronożyczek. Oddziel 2. i 3. lewe żebro za pomocą jedwabnego szwu 5-0, aby utrzymać otwartą jamę klatki piersiowej.</li>
	<li>Ostrożnie podwiązać lewą tętnicę wieńcową przednią zstępującą (LAD) za pomocą uchwytu na igłę z 8-0 Szew polipropylenowy i przeciąć szew za pomocą elektrokoagulacji.</li>
	<li>Obserwuj natychmiastową zmianę koloru w przedniej ścianie lewej komory.</li>
</ol>
5. Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli GH obciążających MSC
<ol>
	<li>Po wywołaniu zawału mięśnia sercowego przez podwiązanie LAD, wstrzyknąć 10 μl roztworów GH ładujących MSC do dwóch różnych punktów w strefie granicznej zawału (łącznie: 2 x 105 MSCs/20 μL) za pomocą podwójnej strzykawki wyposażonej w igłę 26G.
	<ol>
		<li>Postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w Kroku 1, przygotować i przenieść roztwory GH do podwójnej strzykawki. 
		UWAGA: Aby ocenić wszczepienie hydrożeli GH obciążających MSC w obszarze zawału, koniugaty MSC i GH zostały wstępnie znakowane odpowiednio PHK26 i izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przywróć otwartą jamę klatki piersiowej i zamknij mięśnie i skórę za pomocą szwów 5-0. 
	UWAGA: Przed zamknięciem klatki piersiowej usuń powietrze za pomocą strzykawki z cewnikiem.</li>
	<li>Wyjmij rurkę dotchawiczą i umieść mysz w klatce pod lampą podczerwieni podczas rekonwalescencji.</li>
	<li>W przypadku analgezji pooperacyjnej należy podawać podskórne zastrzyki z ketoprofenu (5 mg/kg dziennie) przez minimum 72 godziny. Wszystkie myszy powinny być ściśle monitorowane przez odpowiedni czas, aby zapewnić prawidłową rekonwalescencję po zabiegach chirurgicznych, a także odpowiednie leczenie bólu.</li>
</ol>
6. Echokardiografia
<ol>
	<li>Cztery tygodnie po przeszczepie należy najpierw znieczulić mysz 5% izofluranem, a następnie dostosować stężenie izofluranu do 1%.</li>
	<li>Zrób depilację klatki piersiowej za pomocą kremu do depilacji i umieść mysz na poduszce grzewczej. Nałóż żel do przetwornika ultradźwiękowego na klatkę piersiową.</li>
	<li>Uzyskuj dwuwymiarowe widoki krótkiej osi przymostkowej i rejestruj śledzenie w trybie M na poziomie mięśnia brodawkowatego. 
	UWAGA: Umieść przetwornik liniowy (7\u201215 MHz) w lewej linii przymostkowej i view struktury anatomiczne.</li>
	<li>Zmierz odpowiednie linie dla LVAW, LVID i LVPW, aby uzyskać grubość ścianki serca, wymiar komory i skrócenie frakcyjne. 
	UWAGA: Porównaj czynność serca, w tym frakcję wyrzutową (EF), skrócenie frakcyjne (FS) i objętość końcowoskurczową (ESV) na poziomie mięśnia brodawkowatego, aby zapewnić prawidłową ocenę w tym samym miejscu anatomicznym.</li>
</ol>
7. Ocena histologiczna
<ol>
	<li>W określonym czasie po przeszczepieniu hydrożeli GH ładujących MSC do serca z zawałem, poddaj mysz eutanazji w komorze CO2 i pobierz serce do analizy histologicznej15.</li>
	<li>W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz trichromem Massona (MT) należy utrwalić wypreparowane tkanki serca w 4% paraformaldehydzie (PFA) i zatopić w parafinie. Następnie pokrój bloki serca zatopione w parafinie na odcinki szeregowe 4 μm za pomocą mikrotomu i wybarwij skrawki barwnikiem MT zgodnie ze standardowymi protokołami17.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy na skanerze slajdów przy 20-krotnym powiększeniu i oblicz wielkość zawału w grupach leczonych. 
	Rozmiar zawału (%) = całkowity obwód zawału / całkowity obwód lewej komory x 100</li>
	<li>Oblicz oba obwody na podstawie pomiaru długości linii środkowej. W przypadku obwodów linii środkowej lewej linii zmierz długości linii środkowej między powierzchnią wsierdzia i nasierdzia. W przypadku obwodów zawału w linii środkowej zmierz długość zawału, w tym więcej niż 50 % całkowitej grubości mięśnia sercowego18. 
	UWAGA: Wszystkie analizy obrazu zostały wykonane przy użyciu oprogramowania ImageJ.</li>
	<li>Zmierz grubość ścianki blizny na poziomie mięśni brodawkowatych.</li>
	<li>Oblicz frakcję powierzchni kolagenu. 
	Powierzchnia kolagenu (%) = całkowita powierzchnia zwłóknienia śródmiąższowego/powierzchnia miocytów x 100</li>
</ol>

<ol><li>Jhund, P. S., McMurray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+failure+after+acute+myocardial+infarction%3A+a+lost+battle+in+the+war+on+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure.</a> Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).</li>
<li>Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+failure+after+myocardial+infarction+in+the+era+of+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+Mechanisms%2C+incidence+and+identification+of+patients+at+risk%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk.</a> World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).</li>
<li>Cambria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+cardiac+stem+cell+therapy%3A+advancing+from+first-generation+to+next-generation+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types.</a> npj Regenerative Medicine. 2, 17(2017).</li>
<li>Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Progress+in+Stem+Cell+Modification+for+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration.</a> Stem Cells International. 2018, 1909346(2018).</li>
<li>Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+injectable+hydrogels+for+cardiac+stem+cell+therapy+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering.</a> Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).</li>
<li>Gaetani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+application+of+cardiac+progenitor+cells+in+a+3D-printed+gelatin%2Fhyaluronic+acid+patch+preserves+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction.</a> Biomaterials. 61, 339-348 (2015).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circualtion+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+Hydrogels+for+Cardiac+Tissue+Repair+after+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction.</a> Advanced Science. 2 (11), 1500122(2015).</li>
<li>Wu, R., Hu, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Optimized+Strategies+for+Stem+Cell-Based+Therapy+in+Myocardial+Repair%3A+Clinical+Translatability+and+Potential+Limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation.</a> Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+forming+gelatin-based+tissue+adhesives+and+their+phenolic+content-driven+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties.</a> Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).</li>
<li>Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-catalyzed+in+situ+forming+gelatin+hydrogels+as+bioactive+wound+dressings%3A+effects+of+fibroblast+delivery+on+wound+healing+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy.</a> Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Crosslinkable+Gelatin+Hydrogels+for+Vasculogenic+Induction+and+Delivery+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells.</a> Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).</li>
<li>Jung, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogel+matrix+prolongs+persistence+and+promotes+specific+localization+of+an+oncolytic+adenovirus+in+a+tumor+by+restricting+nonspecific+shedding+and+an+antiviral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response.</a> Biomaterials. 147, 26-38 (2017).</li>
<li>Kim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonsil-derived+mesenchymal+stem+cell-embedded+in+situ+crosslinkable+gelatin+hydrogel+therapy+recovers+postmenopausal+osteoporosis+through+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration.</a> PLoS One. 13 (7), 0200111(2018).</li>
<li>Kim, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-Encapsulating+in+situ+Cross-Linkable+Gelatin+Hydrogels+To+Promote+Myocardial+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair.</a> ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).</li>
<li>Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell%3A+isolation%2C+in+vitro+expansion%2C+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization.</a> Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).</li>
<li>Ojha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+structural+and+functional+changes+in+the+myocardium+following+focal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).</li>
<li>Takagawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+in+the+mouse+chronic+infarction+model%3A+comparison+of+area-+and+length-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches.</a> Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).</li>
<li>Terrovitis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Quantification+and+Optimization+of+Acute+Cell+Retention+by+In+vivo+Positron+Emission+Tomography+After+Intramyocardial+Cardiac-Derived+Stem+Cell+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).</li>
<li>Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Therapy+for+Cardiovascular+Disease%3A+A+Comparison+of+Methods+of+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby zadeklarować w związku z tą pracą.

Hydrożele GH do wstrzykiwań mają ogromny potencjał do zastosowań in vivo ze względu na ich zdolność do jednorodnego włączania różnych środków terapeutycznych in situ. Co więcej, ich właściwościami fizycznymi i biochemicznymi można łatwo manipulować w oparciu o wymagania zależne od choroby. W związku z tym zaproponowano hydrożele do wstrzykiwań, aby rozwiązać główne ograniczenia w obecnej terapii komórkami macierzystymi serca, utrudnione przez słabe przeżycie i retencję komórek (tj. < 10% w ciągu 24 godzin po przeszczepie...

Terapia komórkami macierzystymi serca pojawiła się jako potencjalne podejście do naprawy i regeneracji mięśnia sercowego1,2. Pomimo ostatnich pozytywnych wyników w modelach zwierzęcych i badaniach klinicznych, zastosowanie terapii opartej na komórkach macierzystych do naprawy mięśnia sercowego jest ograniczone ze względu na niską retencję i słabą przeżywalność wstrzykniętych komórek w tkankach serca po zawale 3,4. W rezultacie, zastosowanie inżynierii tkankowej opartej na komórkach, w tym biomateriałów do wstrzykiwań5, plastry na serce6 i arkusze komórek7, było intensywnie badane w celu poprawy retencji i integracji komórek w mięśniu sercowym gospodarza.
Wśród różnych potencjalnych podejść do bioinżynieryjnej naprawy tkanki serca, hydrożele do wstrzykiwania w połączeniu z odpowiednimi typami komórek, takimi jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), są atrakcyjną opcją skutecznego dostarczania komórek do obszarów mięśnia sercowego8,9. Żelatyna, dobrze znany naturalny polimer, może być stosowana jako matryca do wstrzykiwań ze względu na jej doskonałą biokompatybilność, znaczną biodegradowalność i obniżoną immunogenność w porównaniu z szeroką gamą biomateriałów stosowanych w zastosowaniach biomedycznych. Chociaż platformy iniekcyjne na bazie żelatyny mają ogromny potencjał, ich zastosowanie in vivo pozostaje ograniczone ze względu na ich niską sztywność mechaniczną i łatwą degradację w środowisku fizjologicznym.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zaproponowano nowatorski i prosty projekt hydrożeli na bazie żelatyny, składających się z kwasu hydroksyfenylopropionowego, do zastosowań in vivo. Konugaty kwasu żelatynowo-hydroksyfenylopropionowego (GH) mogą być sieciowane in situ w obecności enzymu, peroksydazy chrzanowej (HRP), a następnie otaczać różne leki, biomolekuły lub komórki w hydrożelu, co sugeruje ogromny potencjał w zastosowaniach inżynierii tkankowej10,11,12,13,14. Ponadto niedawno zbadaliśmy efekty terapeutyczne hydrożeli GH zawierających kapsułkowane MSCs i wykazaliśmy ich zastosowanie w skutecznej naprawie i regeneracji serca po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim15. W tym protokole opisujemy prostą technikę enkapsulacji i trójwymiarowej (3D) proliferacji MSCs in vitro w hydrożelach GH. Wprowadzamy również zabieg chirurgiczny mający na celu wygenerowanie mysiego modelu zawału serca poprzez podwiązanie tętnicy wieńcowej i domięśniowe przeszczepienie hydrożeli GH obciążających MSC do serca po zawale.

<table><tbody><tr><td>4 % paraformaldehyd (PFA)</td><td>Intron</td><td>IBS-BP031-2</td><td></td></tr><tr><td>5-0 szew jedwabny</td><td>AILEE</td><td>SK534</td><td></td></tr><tr><td>8-0 szew polipropylenowy</td><td>ETHICON</td><td>M8732H</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowy szkiełko komorowe Cewnik</td><td>Nunc LAB-TEK</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Angiocath Plus (22GA)</td><td>BD Angiocath Plus</td><td>REF382423</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwmiokokowy</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>GYROGEN</td><td>1582MGR</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>MARIENFELD</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej</td><td>Bovie</td><td>QTY1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Podwójna strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOSIN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> HT110116 <tr><td>Etanol</td><td>EMSURE</td><td>K49350783 739</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki spojówkowe Fechtnera tytan</td><td>WORLD PRECISISON INSTRUMENTS</td><td>WP1820</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina izomer izotiocyjanianu I (FITC)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>HEBU</td><td>HB0458</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Ildong Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Stoelting</td><td>50300</td><td>System</td></tr><tr><td></td><td></td> homeotermicznych <td>50301</td><td>Wymienna poduszka grzewcza do 50300 (10 x 12,5 cm)</td></tr> <tr><td>Hematoksylina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HHS80</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek chrzanu (HRP; 250-330 U/mg)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2; 30 % wag. w H2O)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Jodine</td><td>Green Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY zestaw do barwienia komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator mechaniczny</td><td>Harvard Aparatura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>HANIL</td><td>Micro 12</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do mikroigieł</td><td>KASCO</td><td>37-1452</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki</td><td>HEBU</td><td>HB7381</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia</td><td>MT SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1079-1SET</td><td>Weigert& rsquo; s roztwór</td></tr><tr><td></td><td></td> hematoksyliny żelaza <td>HT15-1KT</td><td>Zestaw bejc trichromowych (Masson)</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>LK LABKOREA</td><td>H06-660-107</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia PHK26</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>Skaner slajdów</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>HEBU</td><td>HB7454</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>3M micopore</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta na tkanki</td><td>Scilab Korea</td><td>Cas3003</td><td></td></tr><tr><td>Żel przetwornika</td><td>SUNGHEUNG</td><td>SH102</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły Trout-Barraquer zakrzywiony</td><td>KASCO</td><td>50-3710c</td><td></td></tr><tr><td>System ultrasonograficzny</td><td>Philips</td><td>Affiniti 50</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>JUNSEI</td><td>25175-0430</td><td></td></tr></tbody></table>

domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających msc po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

Jednym z głównych problemów, z jakimi borykają się obecne terapie komórkami macierzystymi serca w celu zapobiegania pozawałowej niewydolności serca, jest niska retencja i przeżywalność przeszczepionych komórek w uszkodzonym mięśniu sercowym, co ogranicza ich skuteczność terapeutyczną. Ostatnio zastosowanie biomateriałów rusztowań zyskało na znaczeniu w celu poprawy i maksymalizacji terapii komórkami macierzystymi. Celem tego protokołu jest wprowadzenie prostej i nieskomplikowanej techniki przeszczepiania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (MSC) przy użyciu hydrożeli kwasu hydroksyfenylopropionowego (GH) do wstrzykiwań; Hydrożele są korzystne jako platforma dostarczania komórek do zastosowań w inżynierii tkanek serca ze względu na ich zdolność do sieciowania in situ i wysoką biokompatybilność. Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania hydrożeli GH obciążających MSC (MSC/hydrożele) oraz oceny ich przeżywalności i proliferacji w trójwymiarowej (3D) hodowli in vitro. Ponadto demonstrujemy technikę domięśniowego przeszczepu MSC/hydrożeli u myszy, opisując zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego (MI) poprzez podwiązanie lewej przedniej przedniej zstępującej (LAD) tętnicy wieńcowej, a następnie przeszczepienie MSC/hydrożeli.

Aby skutecznie dostarczyć MSC do zawałowego mięśnia sercowego, w niniejszym protokole zastosowano hydrożele sieciowalne in situ z obciążeniem MSC, opisane na Rysunku 1. Przed transplantacją in vivo potwierdzono proliferację i przeżywalność MSC w hydrożelach GH za pomocą 3D in vitro testu barwienia żywych/martwych komórek (żywe: zielone; martwe: czerwone). Jak pokazano na Rysunku 2, reprezentatywne obrazy wykazały wystarczającą proliferację MSC, ukazując rozgałęz...

Terapia oparta na komórkach macierzystych pojawiła się jako skuteczna strategia naprawy uszkodzonych tkanek serca po zawale mięśnia sercowego. Zapewniamy optymalną aplikację in vivo do przeszczepu komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli żelatynowych, które mogą być sieciowane enzymatycznie.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów związanych z obecnie zaostrzoną terapią kardiologiczną, takich jak niska przydatność do niskiej retencji i przeżycia przeszczepionych komórek w sercach z zawałem. Aby rozwiązać ten problem, metoda ta może zapewnić wiarygodną technikę badania przeszczepu wewnątrzmięśniowego komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli do wstrzykiwań w modelu mysim, który jest doskonałą platformą do wykorzystania do badania naprawy i regeneracji tkanki serca po zawale mięśnia sercowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to wykonalna metoda poprawy retencji i przeżycia przeszczepionych komórek macierzystych po przeszczepie do mięśnia sercowego przy użyciu hydrożeli do wstrzykiwań typu cross-link in situ.Hydrożele te oferują różnorodne możliwości w inżynierii tkankowej serca, takie jak dostarczanie nie tylko komórek macierzystych, ale także czynników wzrostu, materiałów genetycznych i leków, aby zmaksymalizować ich efekt terapeutyczny w tkankach serca z zawałem. Procedurę eksperymentu in vitro zademonstruje Eunmi Lee, technolog badawczy z mojego laboratorium. Technolodzy z Eun-Hye Park i Eunhwa Seong zademonstrują procedurę eksperymentów in vivo.Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSCs w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, umyj naczynie dwukrotnie DPBS i inkubuj je z jednym mililitrem substytutu trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej do komórek i odwiruj je w temperaturze 500 razy G przez trzy minuty.Odrzucić otrzymany supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze PBS i utrzymywać zawiesinę komórek na lodzie. Rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek 10 mikrolitrami błękitu trypanowego i oznaczyć stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.Ponownie zawiesić MSC do gęstości od jednego razy 10 do siódmych komórek na mililitr i przenieść je do probówki o pojemności jednego mililitra. Przygotować skoniugowany roztwór 6,25% GH w PBS i rozdzielić go na dwie fiolki. Następnie wymieszaj roztwory GH z sześcioma mikrogramami na mililitr HRP lub 0,07% nadtlenkiem wodoru.Krótko odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 1000 razy G i ostrożnie odessać powstały supernatant. Następnie wymieszać osad komórkowy z roztworem GH A. Załadować MSC w roztworze GH A i roztworze GH B po obu stronach podwójnej strzykawki. Umieść 300 mikrolitrów połączonych roztworów GH z MSC o końcowej gęstości 5 milionów komórek na mililitr na szkiełku z ośmioma dołkami.Po utworzeniu hydrożelu in situ, a następnie enkapsulacji MSC poprzez sieciowanie enzymatyczne, dodaj 700 mikrolitrów DMEM zawierającego 10% FBS i 1% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i wymieniać pożywkę co dwa do trzech dni. Przed zabiegiem należy opróżnić klatkę piersiową myszy za pomocą kremu do depilacji i wysterylizować skórę jodem.Umieść mysz na stole operacyjnym i zaintubuj ją, wprowadzając cewnik do tchawicy, aby zapewnić dodatkowy tlen przez wentylację mechaniczną. Delikatnie przeciąć skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie penetruj mięśnie międzyżebrowe mikronożyczkami.Oddziel drugie i trzecie lewe żebro za pomocą jedwabnego szwu 5-O, aby utrzymać otwartą jamę klatki piersiowej. Ostrożnie podwiązać lewą przednią zstępującą tętnicę wieńcową za pomocą uchwytu na igłę z 8-0 Szew polipropylenowy i przeciąć szew za pomocą elektrokoagulacji. Obserwuj natychmiastową zmianę koloru w przedniej ścianie lewej komory.Po wywołaniu zawału mięśnia sercowego wstrzyknąć 10 mikrolitrów roztworów GH ładujących MSC do dwóch różnych punktów w strefie granicznej zawału. Przywróć otwartą jamę klatki piersiowej i zamknij mięśnie i skórę za pomocą szwów 5-0. Wyjmij rurkę dotchawiczą i umieść mysz w klatce pod lampą podczerwieni podczas rekonwalescencji.Wykonaj echokardiografię i zmierz odpowiednie linie dla przedniej ściany lewej komory, wewnętrznej i tylnej lewej komory, aby uzyskać grubość ściany serca, wymiar komory i skrócenie frakcji. Przed przeszczepieniem in vivo proliferację i przeżywalność MSCs w hydrażelach GH potwierdzono za pomocą testu barwienia 3D żywych martwych komórek in vitro. Reprezentatywne obrazy wykazały wystarczającą proliferację MSC, co wskazuje na rozgałęzione sieci w obrębie hydrożeli GH.Rozległa wielokomórkowa struktura 3D MSCs została wyraźnie zaobserwowana w 14 dniu, co wskazuje, że hydrożele GH mogą zapewnić odpowiednie mikrośrodowisko dla zamkniętych komórek. Po indukcji zawału mięśnia sercowego hydrożele GH ładujące MSC zostały przeszczepione domięśniowo w okolice zawału. MSCs i żel były odpowiednio podtrzymywane w okolicy zawału.MSCs były dobrze zintegrowane z hydrożelami GH. W celu zweryfikowania efektów terapeutycznych hydrożeli GH ładujących MSC, zmiany w funkcji i strukturze serca oceniono za pomocą echokardiografii i analizy histologicznej w 28. dniu po przeszczepieniu i porównano je między różnymi grupami leczenia. Reprezentatywna echokardiografia wykazała poprawę funkcji serca, w tym skrócenie frakcyjne, frakcję wyrzutową i końcową objętość skurczową w grupie leczonej żelem MSC.Ponadto analiza histologiczna wykazała mniejsze zwłóknienie, grubsze ściany zawału i mniejszy rozmiar zawału w grupie leczonej żelem MSC niż w pozostałych grupach, co wskazuje, że protokół ten znacznie osłabił przebudowę lewej komory. Korzystając z tej techniki, uzyskaliśmy długoterminową proliferację komórek macierzystych i doprowadziła do znacznej poprawy struktury i funkcji serca po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim. Technika ta może zostać rozszerzona do stosowania u dużych zwierząt i do zastosowania klinicznego jako nowa strategia zapobiegania pozawałowej niewydolności serca poprzez zapewnienie naprawy i regeneracji tkanki serca.

intramyocardial-transplantation-msc-loading-injectable-hydrogels

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano sposób wykorzystania szybkiego i wiarygodnego modelu do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych niedokrwienia mięśnia sercowego.

Ligacja LAD: mysi model zawału mięśnia sercowego

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Ten protokół ma na celu złagodzenie ograniczeń związanych z nieprawidłowym przeszczepem komórek macierzystych w leczeniu zawałów mięśnia sercowego za pomocą systemu hydrożelowego i kleju na bazie fibryny. Dzięki takiemu podejściu można utrzymać kontakt komórka-tkanka po zawale choroby, zwiększając potencjał terapeutyczny korzystnych środków w miejscu urazu.

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Mysie badania na modelach zapalenia jelita grubego wykazały, że niewielki procent (1 - 5%) mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wstrzykniętych dożylnie lub dootrzewnowo do miejsca zapalnego jelita grubego1,2. Badanie to pokazuje, że dosercowe wstrzyknięcia MSC pod kontrolą USG powodują zwiększoną lokalizację w jelicie.

Wstrzyknięcie dosercowe pod kontrolą ultradźwięków ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia naprowadzania do jelita do stosowania w mysich modelach eksperymentalnych chorób zapalnych jelit

W tym protokole pokazujemy i rozwijamy, jak używać ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania i oczyszczania kardiomiocytów, a ponadto, jak poprawić efektywność ich przeszczepu za pomocą wstępnego leczenia inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho w modelu zawału mięśnia sercowego u myszy.

Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho

Staraliśmy się stworzyć świński model niewydolności serca wywołanej zablokowaniem lewej tętnicy obwodowej i szybką stymulacją, aby przetestować efekt i bezpieczeństwo domięśniowego podawania komórek macierzystych w terapiach komórkowych.

Opracowanie świńskiego modelu niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego do leczenia komórkami macierzystymi

Komórki macierzyste są stale badane jako potencjalne metody leczenia osób z uszkodzeniem mięśnia sercowego, jednak ich zmniejszona żywotność i retencja w uszkodzonej tkance może wpłynąć na ich długoterminową skuteczność. W tym manuskrypcie opisujemy alternatywną metodę dostarczania komórek macierzystych w mysim modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.

Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwań domięśniowych pod kontrolą echokardiografii w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego przy użyciu igły 29 G x 88 mm. Technika ta zapewnia solidne, precyzyjne i powtarzalne dostarczanie środków terapeutycznych bezpośrednio do strefy okołozawałowej.

Iniekcja pod kontrolą echokardiografii w celu ukierunkowanego i niezawodnego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego

Poznaj technikę domięśniowego przeszczepienia komórek macierzystych z użyciem hydrożeli żelatynowych w modelu mysim. Ta metoda poprawia retencję i przeżywalność komórek w tkance sercowej po zawale.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów