Name: Frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę AF4 z detekcją UV-vis do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę rozmiarów od 1 do 1000 nm dla złożonych próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować całemu konsorcjum ACEnano za owocne dyskusje na wszystkich etapach przygotowania przedstawionego tutaj protokołu. Autorzy doceniają również dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 (H2020) w ramach umowy o grant nr 720952 w ramach projektu ACEnano.

1. Konfiguracja systemu AF4
<ol>
	<li>Złożyć kartridż AF4 i połączyć wszystkie komponenty sprzętowe systemu AF4 oraz detektora UV-vis (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji obsługi producenta.</li>
	<li>Zainstalować wszystkie niezbędne pakiety oprogramowania do sterowania, akwizycji, przetwarzania i ewaluacji danych zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji obsługi producenta.</li>
	<li>Upewnić się, że ustanowiono wszystkie niezbędne połączenia sygnałowe pomiędzy systemem AF4 a detektorem UV-vis.</li>
	<li>Upewnić się, że ustanowione połączenia AF4-UV-vis są szczelne i pozbawione wycieków, przepłukując układ wodą ultrapurystyczną (UPW) przez 15 min (przepływ tip flow rate 1 mL∙min-1, przepływ focus flow rate 1 mL∙min-1 oraz przepływ cross flow rate 1.5 mL∙min-1). W tym celu należy otworzyć oprogramowanie sterujące AF4 i wprowadzić wartości przepływów w odpowiednich panelach w prawym górnym rogu strony głównej. W razie potrzeby dokręcić odpowiednie złączki i powtórzyć procedurę, aż do momentu, gdy nie będą widoczne żadne wycieki. 
	UWAGA: Wewnętrzne ciśnienie systemu podczas wszystkich pomiarów powinno być monitorowane i musi mieścić się w zakresie od 4 do 12 bar. W przypadku, gdy ciśnienie jest wyższe lub niższe, należy dostosować rurkę przeciwciśnieniową. Ponadto trend ciśnienia w kanale powinien być stały przez cały czas trwania pomiaru. 
	UWAGA: Jeśli dostępna jest komora termostatyczna kanału, należy ustawić jej temperaturę na 25 °C, aby zapewnić porównywalne warunki pomiarowe we wszystkich eksperymentach AF4.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów i zawiesin do kwalifikacji systemu AF4-UV-vis oraz analizy próbek
<ol>
	<li>Roztwór czyszczący
	<ol>
		<li>Do 1 L UPW dodać 8 g stałego wodorotlenku sodu (NaOH) oraz 2 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) i mieszać roztwór do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluent
	<ol>
		<li>Do 2 L przefiltrowanej i odgazowanej UPW dodać 500 μL przefiltrowanej mieszaniny surfaktantów, aby otrzymać eluent (0.025% (v/v), pH około 9.4). 
		UWAGA: Szczegółowy opis składników mieszaniny surfaktantów znajduje się w Tabeli 1 (również w Tabeli materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standard AuNP o dowolnej wielkości do oznaczania odzysku masy
	<ol>
		<li>Standard AuNP o dowolnej wielkości (50 mg∙L-1) mieszać w vortexie przez 2 min, a następnie rozcieńczyć w UPW w stosunku 1:4, aby uzyskać końcowe stężenie masy 12.5 mg∙L-1. Po rozcieńczeniu mieszać w vortexie przez kolejne 2 min w celu homogenizacji otrzymanej zawiesiny. 
		OSTROŻNIE: Podczas pracy z odczynnikami chemicznymi, zwłaszcza z granulatem NaOH, wymagane jest stosowanie niezbędnych środków ostrożności oraz odpowiedniego sprzętu ochronnego. 
		UWAGA: W celu zapewnienia niskiego tła cząstek podczas eksperymentów AF4-UV-vis, ogólnie zaleca się odgazowanie i filtrowanie wszystkich niezbędnych roztworów (z wyjątkiem roztworu czyszczącego) za pomocą filtra membranowego 0.1 µm (hydrofilowy PVDF lub podobny). Można to przeprowadzić za pomocą dedykowanej jednostki do filtracji próżniowej lub filtrów strzykawkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kwalifikacja systemu AF4-UV-vis
<ol>
	<li>Przy zastosowaniu ustawień oprogramowania opisanych w kroku 1.4 należy przepłukać system roztworem czyszczącym przez 30 min (przepływ Tip 1 mL∙min-1, przepływ Focus 1 mL∙min-1 oraz przepływ Cross 1.5 mL∙min-1).</li>
	<li>Należy zmienić odpowiednią butelkę z eluentem i przepłukać system wodą UPW przez 20 min (przepływ Tip 1 mL∙min-1, przepływ Focus 1 mL∙min-1 oraz przepływ Cross 1.5 mL∙min-1).</li>
	<li>Należy wymienić odpowiednie filtry pomp liniowych.</li>
	<li>Należy otworzyć kartridż AF4 i wymienić membranę AF4. Następnie należy złożyć kartridż AF4 i ponownie podłączyć go do systemu AF4-UV-vis.</li>
	<li>Oczyszczony system AF4-UV-vis należy przepłukać eluentem przez co najmniej 30 min w celu równoważenia membrany i stabilizacji systemu (przepływ Tip 1 mL∙min-1, przepływ Focus 1 mL∙min-1 oraz przepływ Cross 1.5 mL∙min-1). Należy ponownie sprawdzić system pod kątem potencjalnych wycieków (patrz krok 1.4).</li>
	<li>Należy przeprowadzić kwalifikację systemu AF4-UV-vis poprzez wyznaczenie odzysku masy oraz zmienności czasu retencji przy użyciu dowolnego wzorca wielkości AuNP.
	<ol>
		<li>Należy przeprowadzić pomiar z bezpośrednim wtryskiem bez przyłożenia siły separacji.
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu sterującym AF4 należy utworzyć nowy plik pomiarowy, wybierając File | New | Run.</li>
			<li>W karcie Run należy zdefiniować opis próbki i pomiaru, a także objętość wtrysku i nazwę próbki. Warunki pomiarowe przedstawiono w Tabeli 2.</li>
			<li>W drugiej karcie FFF method należy ustawić parametry pomiarowe zgodnie z Tabelą 2.</li>
			<li>Należy kliknąć przycisk Run, aby rozpocząć pomiar.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Należy przeprowadzić pomiar frakcjonowania z przyłożeniem siły separacji (przepływ Cross).
		<ol>
			<li>Metodę frakcjonowania należy zdefiniować zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, stosując warunki frakcjonowania określone w Tabeli 3.</li>
			<li>Należy kliknąć przycisk Run, aby rozpocząć pomiar.</li>
			<li>Pomiar należy wykonać w czterech powtórzeniach. 
			UWAGA: Pierwszy pomiar służy kondycjonowaniu systemu (tj. membrany AF4) i zostanie wykluczony z końcowej oceny wyników kwalifikacji systemu. 
			UWAGA: Zaleca się zapisywanie wszystkich wygenerowanych plików pomiarowych poprzez wybór File | Save w oprogramowaniu sterującym AF4.</li>
			<li>System AF4-UV-vis uznaje się za zakwalifikowany, jeśli dla wybranego wzorca wielkości AuNP uzyskano odzysk masy &gt;80% oraz zmienność czasu retencji &lt;2%.</li>
			<li>W przypadku stosowania autosamplera jako systemu wtryskowego, należy napełnić butelkę z roztworem do mycia igły autosamplera tym samym roztworem, który jest pompowany przez system AF4-UV-vis (np. roztworem czyszczącym, wodą UPW lub odpowiednim eluentem), aby zapewnić optymalne warunki pomiaru. Przy zmianie eluentu zazwyczaj zaleca się monitorowanie sygnału detektora UV-vis aż do momentu stabilizacji linii bazowej na stałym poziomie, co potwierdzi ponowne równoważenie systemu AF4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza próbek metodą AF4-UV-vis
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie wzorce wielkości AuNP do zewnętrznej kalibracji wielkości poprzez mieszanie w wirówce (vortex) odpowiedniej zawiesiny AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, każda 50 mg∙L-1) przez 2 min, a następnie rozcieńczyć ją w stosunku 1:4 wodą UPW, aby uzyskać końcowe stężenie masowe 12,5 mg∙L-1. Po rozcieńczeniu mieszać w wirówce przez kolejne 2 min w celu homogenizacji uzyskanych zawiesin.</li>
	<li>Przygotować nieznaną próbkę AuNP do analizy, stosując tę samą procedurę, co w przypadku wzorców kalibracyjnych opisanych w kroku 4.1.</li>
	<li>Wykonać pomiar z bezpośrednim wtryskiem wszystkich wzorców wielkości AuNP, stosując metodę AF4 przedstawioną w Tabeli 2.
	<ol>
		<li>W tym celu wprowadzić odpowiednie wartości podsumowane w Tabeli 2 w odpowiednie miejsca w oprogramowaniu producenta, aby zdefiniować parametry rozdziału i próbki, a następnie nacisnąć przycisk Run, aby rozpocząć eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić frakcjonowanie każdego wzorca wielkości AuNP z osobna, stosując metodę AF4 przedstawioną w Tabeli 3, w celu ustalenia funkcji zewnętrznej kalibracji wielkości.
	<ol>
		<li>Wprowadzić odpowiednie wartości podsumowane w Tabeli 3 w odpowiednie miejsca w oprogramowaniu producenta. Metoda frakcjonowania składa się z etapu ogniskowania, kilku etapów elucji oraz etapu płukania. Po skonfigurowaniu metody nacisnąć przycisk Run, aby rozpocząć eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać pomiar z bezpośrednim wtryskiem nieznanej próbki AuNP, stosując metodę AF4 przedstawioną w Tabeli 2.</li>
	<li>Przeprowadzić frakcjonowanie nieznanej próbki AuNP, wykonując metodę AF4 wymienioną w Tabeli 3.</li>
	<li>Wszystkie pomiary wspomniane w Sekcji 3 i 4 przeprowadzić w trzech powtórzeniach, chyba że zaznaczono inaczej, aby zapewnić wiarygodne i istotne statystycznie wyniki.
	<ol>
		<li>Przechowywać zawiesiny AuNP o stężeniu 50 mg∙L-1 w temperaturze 4–8 °C przed użyciem. Rozcieńczone zawiesiny AuNP najlepiej przygotować w ciągu 30 min przed zastosowaniem. 
		UWAGA: Mieszanie w wirówce jest zazwyczaj wystarczające i nie ma potrzeby przeprowadzania sonikacji zawiesin.</li>
		<li>Aby umożliwić korelację czasu retencji nieznanej próbki AuNP z czasami retencji uzyskanymi dla wzorców wielkości AuNP, wszystkie próbki należy mierzyć przy użyciu tej samej metody AF4. 
		UWAGA: Aby zapewnić stałe i prawidłowe warunki rozdziału, należy dołączyć/powtórzyć etap frakcjonowania opisany w sekcji kwalifikacji systemu (patrz krok 3.6.2) po określonej liczbie pomiarów próbek (np. 10 pomiarów). Dodatkowo należy rejestrować ciśnienie systemu i stabilność linii bazowej detektora UV-vis. Powinny one pozostać stabilne i stałe podczas całego cyklu AF4-UV-vis. 
		UWAGA: Zazwyczaj należy wymienić membranę ultrafiltracyjną, gdy detektor UV-vis (lub detektor wielokątowego rozpraszania światła (MALS), jeśli jest dostępny) wykazuje zwiększony poziom szumów lub gdy nie są spełnione określone kryteria kwalifikacji systemu, takie jak odzysk, kształt piku próbki lub powtarzalność (lub gdy system AF4-UV-vis został poddany dokładnej procedurze czyszczenia). W opisanych tutaj warunkach zakwalifikowany system AF4-UV-vis jest zazwyczaj stabilny przez co najmniej 50 pomiarów przy użyciu tej samej membrany; jednak liczba możliwych kolejnych pomiarów spełniających określone kryteria jakości może się znacznie różnić w zależności od próbki, matrycy próbki i składu eluentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ocena danych
<ol>
	<li>Oblicz odzysk masy, korzystając z oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta systemu AF4-UV-vis lub poprzez analizę w arkuszu kalkulacyjnym po eksporcie wszystkich niezbędnych danych surowych (tj. powierzchni piku UV-vis) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi producenta.
	<ol>
		<li>Oblicz odzysk masy AuNP, porównując powierzchnie pod odpowiednimi pikami UV-vis pomiaru frakcjonowania (Afractionation) i pomiaru bezpośredniego wtrysku (Adirect injection) przy użyciu następującego równania: 
		<img alt="Wzór na obliczenie odzysku, recovery % = (A_f/A_d) x 100, schemat równania, metoda analityczna." src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		UWAGA: Podczas pomiaru bezpośredniego wtrysku nie jest przykładana żadna siła separacyjna, w związku z czym można pominąć potencjalne oddziaływania gatunków analitu ze ścianką akumulacji. Powierzchnię pod odpowiednim pikiem UV-vis można bezpośrednio skorelować z masą AuNP, stosując prawo Beer-Lamberta, przy założeniu, że żadne inne gatunki w próbce nie absorbują przy danej długości fali i/lub i) eluuą w innym czasie retencji w warunkach frakcjonowania, ii) są usuwane przez membranę AF4.</li>
		<li>Zaimportuj pliki .dat uzyskane z obu przebiegów: bezpośredniego wtrysku oraz frakcjonowania.</li>
		<li>Wybierz ślad detektora UV-vis w karcie Overview.</li>
		<li>Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) oraz linię bazową w widoku sygnału i linii bazowej dla wszystkich pomiarów.</li>
		<li>Wstaw Direct Injection Calibration za pomocą opcji Insert.</li>
		<li>Wybierz wszystkie przebiegi bezpośredniego wtrysku w widoku Direct Injection Calibration Settings i wprowadź współczynnik ekstynkcji UV. 
		UWAGA: Ważne jest użycie tego samego współczynnika ekstynkcji UV-vis zarówno dla kalibracji, jak i dla pomiaru frakcjonowania.</li>
		<li>Ustal linię kalibracyjną, wykorzystując powierzchnię pod śladem sygnału UV-vis w obszarze ROI oraz ilość wstrzykniętą, obliczoną z wprowadzonego stężenia i objętości wtrysku. Uzyskana kalibracja zostanie wyświetlona w osobnym oknie Direct Injection Calibration Function.</li>
		<li>Przypisz funkcję kalibracyjną do odpowiednich pomiarów frakcjonowania. 
		UWAGA: Dla każdego standardu wielkości kalibracyjnej oraz dla nieznanej próbki AuNP należy ustanowić osobną funkcję kalibracyjną ze względu na zależność absorbancji UV-vis AuNP od wielkości. Tą wadą detektora UV-vis można uniknąć, stosując detektor czuły na masę, taki jak ICP-MS.</li>
		<li>Wykonaj analizy, wstawiając obliczenia Quantitative Results; wyniki zostaną wyświetlone w tabeli po prawej stronie jako wartości stężenia i ilości wstrzykniętej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz zmienność czasu retencji, korzystając z oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta systemu AF4 lub poprzez analizę w arkuszu kalkulacyjnym po eksporcie wszystkich niezbędnych danych surowych (tj. czasów retencji standardów kalibracyjnych AuNP w odpowiednich maksimach piku UV-vis oraz odpowiednich czasów martwych) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi producenta.
	<ol>
		<li>Otwórz okno Overview, aby wyświetlić odpowiednie ślady UV dla wszystkich zaimportowanych pomiarów.</li>
		<li>Detekcja piku zostanie wykonana automatycznie; dostosuj parametry detekcji piku w narzędziach przetwarzania sygnału, aby zoptymalizować wydajność. Wyodrębnij odpowiednie maksima piku, przeglądając wszystkie pliki pomiarowe.</li>
		<li>Oblicz względne odchylenie standardowe dla wszystkich pomiarów przy użyciu następującego równania: 
		<img alt="Równanie względnego odchylenia standardowego; analiza statystyczna; wzór na zmienność danych; obliczanie RSD." src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		Obliczenia można również wykonać za pomocą odpowiedniego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj oznaczenie wielkości, korzystając z oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta lub poprzez analizę w arkuszu kalkulacyjnym po eksporcie wszystkich niezbędnych danych surowych (czas retencji w maksimum piku UV-vis analitu oraz odpowiedni czas martwy) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi producenta. Zewnętrzną funkcję kalibracji wielkości można ustanowić, wykreślając czasy retencji skorygowane o czas martwy (netto czasy retencji, patrz Tabela 5) standardów wielkości AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) w funkcji ich wielkości hydrodynamicznej uzyskanej z wcześniej wykonanych pomiarów DLS (patrz Tabela 4). 
	UWAGA: Pomiary DLS powinny być idealnie przeprowadzone w tym samym dniu, co odpowiednie pomiary frakcjonowania, aby zapewnić porównywalne właściwości próbek.
	<ol>
		<li>Po zaimportowaniu plików .dat wszystkie pomiary są wyświetlane w karcie Overview. Z listy detektorów wyświetlanej poniżej okna nakładania wybierz sygnał detektora UV-vis. Zdefiniuj ROI i linię bazową dla każdego pomiaru, które można dostosować w widoku Signal and Baseline. Użyj narzędzi Signal processing po prawej stronie, aby wygładzić zaszumione sygnały. Użyj funkcji Assign Processing Parameters to other Runs, aby przypisać parametry do innych pomiarów lub sygnałów.</li>
		<li>Wybierz Particle Size Calibration z karty Insert.</li>
		<li>Wybierz wszystkie przebiegi kalibracyjne, klikając w odpowiedni pomiar w tabeli Select References for Calibration w prawym górnym rogu. Wszystkie wybrane pomiary zostaną wyświetlone w tabeli poniżej. Wprowadź promień hydrodynamiczny dla wszystkich pomiarów kalibracyjnych określonych w Tabeli 4. Funkcja zostanie wyświetlona w oknie Particle size calibration – Function, a wyświetlone zostanie również równanie. 
		UWAGA: Współczynnik korelacji (R2) ustanowionej funkcji kalibracji wielkości musi wynosić ≥0,990.</li>
		<li>Przypisz funkcję kalibracyjną do pomiarów nieznanej próbki AuNP, wybierając odpowiednie frakcjonowania z listy Select Runs for Assignment.</li>
		<li>Wyświetl wyniki, otwierając obliczenia particle size distribution w karcie insert. Wcześniej utworzona kalibracja wielkości cząstek zostanie wymieniona jako Calibration dla pomiarów nieznanej próbki AuNP, co jest wyświetlane w prawym oknie settings. Obliczona wielkość zostanie pokazana w oknie size distribution window z etykietą w maksimum piku. Zaznacz pole wyboru Average Signals for Sample, aby uśrednić wszystkie pomiary jednej próbki i wypisać wynik w etykiecie maksimum piku.</li>
		<li>Dodatkowo wykreśl linię kalibracyjną nad fraktogramem, zaznaczając pole wyboru Show calibration curve. Kumulatywny rozkład wielkości jest dostępny po zaznaczeniu pola wyboru Show cumulative distribution. 
		UWAGA: Przy użyciu oprogramowania producenta do oceny danych zaleca się dodanie wszystkich wyników do raportu, który można wygenerować, klikając Report w karcie Insert. Przycisk Report dodaje wszystkie wyniki, tabele i diagramy do dokumentu. W karcie Report ustawienia raportu można zmienić, otwierając Report setup w sekcji Document.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Wszyscy autorzy tego manuskryptu są pracownikami firmy Postnova Analytics GmbH, której produkty są wykorzystywane w tym protokole.

Rozmiar hydrodynamiczny nieznanego AuNP został dokładnie oceniony za pomocą AF4 sprzężonego z detektorem UV-vis przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów wielkości AuNP w zakresie od 20 nm do 100 nm. Opracowana metoda AF4 została zoptymalizowana przy użyciu stałego profilu przepływu krzyżowego w celu ustalenia liniowej zależności między zmierzonym czasem retencji a rozmiarem AuNP, umożliwiając w ten sposób proste określenie wielkości na podstawie analizy regresji liniowej. Szczególny nacisk położono również na osiągnięcie wystarczająco wysokich wskaźników odzysku, które wskazują na brak znacznych strat próbki podczas frakcjonowania, oraz na to, aby opracowana metoda AF4, obejmująca zastosowany eluent i membranę, dobrze pasowała do wszystkich frakcjonowanych próbek AuNP.
Opracowanie metody jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym krokiem w AF4 i kilka parametrów, w tym wymiary kanału, parametry przepływu, a także eluent, membrana, wysokość przekładki, a nawet właściwości próbki, muszą być brane pod uwagę, aby poprawić frakcjonowanie w danym oknie czasowym elucji. Celem tego akapitu jest przeprowadzenie czytelnika przez krytyczne kroki, które zostały zoptymalizowane w celu pomyślnego określenia wielkości omawianej tutaj nieznanej próbki AuNP. Bardziej szczegółowy opis tego, jak ogólnie opracować metodę AF4, odsyłam czytelnika do sekcji AF4 w dokumencie "ISO/TS21362:2018 – Nanotechnologie – Analiza nanoobiektów z wykorzystaniem asymetrycznego przepływu i frakcjonowania w polu odśrodkowym"25. Po bliższym przyjrzeniu się zastosowanym warunkom frakcjonowania podanym w tabeli 3, pierwszym krytycznym krokiem jest wprowadzenie i rozluźnienie próbki AuNP w kanale AF4. Ten etap jest regulowany przez przepływ iniekcji, przepływ skupienia i przepływ krzyżowy, których wzajemne oddziaływanie zmusza próbkę do umieszczenia blisko powierzchni membrany i skoncentrowania jej w wąskim paśmie w pobliżu portu iniekcyjnego kanału AF4, zasadniczo określając punkt początkowy frakcjonowania. Konieczne jest odpowiednie rozluźnienie próbki, ponieważ na tym etapie składniki próbki o różnych rozmiarach znajdują się na różnych wysokościach kanału AF4, zapewniając w ten sposób podstawę do udanego frakcjonowania według wielkości. Niepełna relaksacja próbki jest zwykle widoczna jako zwiększona powierzchnia piku pustki wynikająca z niezatrzymanych (tj. niezrelaksowanych) składników próbki. Efekt ten można złagodzić poprzez wydłużenie czasu iniekcji i/lub zastosowanego natężenia przepływu krzyżowego. Oba parametry wymagają jednak starannej optymalizacji, szczególnie w przypadku próbek, które są podatne na aglomerację i adsorpcję na membranie AF4 i mogą być monitorowane za pomocą odpowiednich współczynników odzysku uzyskanych dla różnych ustawień parametrów36,37. Zastosowany czas iniekcji wynoszący 5 minut wraz z natężeniem przepływu krzyżowego 1,0 mL∙min-1 ujawnił wskaźniki odzysku >80% dla wszystkich próbek AuNP i znikomą powierzchnię piku pustego, co wskazuje na bliskie optymalnym warunkom relaksacji. Po wystarczającym rozluźnieniu próbki AuNP zatrzymano przepływ ogniskowania i zainicjowano transport próbki wzdłuż długości kanału AF4 do odpowiedniego detektora UV-vis, co stanowiło drugi krytyczny krok. W celu zapewnienia wystarczająco wysokiej mocy frakcjonowania w rozsądnych czasach analiz zastosowano stałe natężenie przepływu krzyżowego 1,0 ml∙min-1 przez 30–50 minut (w zależności od odpowiedniego wzorca frakcjonowanego rozmiaru AuNP), a następnie 10-minutowy liniowy zanik przepływu krzyżowego przy natężeniu przepływu detektora 0,5 mL.min-1. Zastosowanie stałego profilu przepływu krzyżowego w poprzek separacji wszystkich wzorców wielkości AuNP ujawniło liniową zależność między czasem retencji a rozmiarem AuNP zgodnie z teorią FFF22, umożliwiając w ten sposób określenie wielkości nieznanej próbki AuNP za pomocą prostej analizy regresji liniowej. Jednak profile inne niż stały przepływ krzyżowy zostały również wykorzystane do wymiarowania nanocząstek, co ostatecznie doprowadziło do nieliniowej zależności między czasem retencji a wielkością cząstek38,39. Ponadto oznaczanie wielkości w AF4 przy użyciu dobrze zdefiniowanych wzorców wielkości nie ogranicza się do AuNP, ale może być również stosowane do nanocząstek o innych rozmiarach i składzie pierwiastkowym (np. nanocząstki srebra38,40 lub krzemionki41,42). Ponadto, podczas pracy z rozcieńczonymi próbkami, ICP-MS jest bardzo czułym detektorem elementarnym, który może być sprzężony z AF4, co zwiększa wszechstronność tego podejścia analitycznego do wymiarowania dużej różnorodności nanocząstek w zawiesinie.
Pomimo szerokiego zastosowania, zewnętrzna kalibracja rozmiaru przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów rozmiaru w AF4 ma pewne cechy szczególne, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z niego w celu dokładnego wymiarowania nieznanych próbek. Przede wszystkim w dużym stopniu opiera się na zastosowaniu porównywalnych warunków podczas frakcjonowania odpowiednich wzorców wielkości i rzeczywistej próbki. W przedstawionym tutaj przypadku obowiązkowe jest zatem, aby zarówno wzorce wielkości AuNP, jak i nieznana próbka AuNP były frakcjonowane przy użyciu tej samej metody AF4, a także tego samego eluentu i tej samej membrany, co sprawia, że podejście to jest dość mało elastyczne. Ponadto, nie mając pod ręką detektorów wrażliwych na rozmiar, np. rozpraszania światła (MALS i DLS), trudno jest określić, czy dana metoda AF4 wykorzystująca wzorce wielkości działa wystarczająco dobrze, czy nie. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku nieznanych próbek, które wykazują bardzo szeroki rozkład wielkości, gdzie nie jest jasne, czy wszystkie składniki próbki przebiegają zgodnie z normalnym wzorcem elucji: frakcjonowanie od mniejszych do większych cząstek, czy też większe składniki próbki już eluują w trybie steryczno-hiperwarstwowym, co może potencjalnie koeluować z mniejszymi składnikami próbki43,44. Ponadto, mimo że teoria FFF podkreśla, że AF4 rozdziela się wyłącznie na podstawie różnic w rozmiarach hydrodynamicznych, przy czym cząstki są uważane za masy punktowe bez żadnych interakcji z ich otoczeniem22, rzeczywistość mówi co innego, ponieważ oddziaływania cząstka-cząstka i cząstka-membrana (takie jak przyciąganie/odpychanie elektrostatyczne lub przyciąganie van-der-Waalsa) mogą odgrywać znaczącą rolę i mogą potencjalnie wprowadzać mierzalne odchylenie do określania wielkości za pomocą zewnętrznych Kalibracja rozmiaru45,46. W związku z tym zaleca się stosowanie wzorców wielkości, które idealnie pasują do składu i właściwości powierzchniowych (potencjał Zeta) cząstki będącej przedmiotem zainteresowania40,42 lub, jeśli nie są one dostępne, przynajmniej stosowanie dobrze scharakteryzowanych wzorców wielkości cząstek (np. cząstki polistyrenu lateksowego) i staranną ocenę ich porównywalności z cząstką będącą przedmiotem zainteresowania, zwłaszcza pod względem ich powierzchniowego potencjału Zeta w danym środowisku, w którym przeprowadza się analizę41,47.
Wszechstronność AF4 jest często uważana za jego największą zaletę, ponieważ oferuje zakres zastosowań, który wykracza poza większość innych popularnych technik wymiarowania w tej dziedzinie 22,48,49. Jednocześnie, ze względu na związaną z tym przypuszczalną złożoność, może być również uważany za jego najważniejszą wadę, zwłaszcza w przypadku szybkich i pozornie łatwych w użyciu technik wymiarowania, takich jak DLS, Nanoparticle Tracking Analysis lub ICP-MS dla pojedynczych cząstek. Niemniej jednak, gdy spojrzymy na AF4 z perspektywy tych popularnych technik wymiarowania, staje się jasne, że wszystkie techniki mają swoje wady i zalety, ale wszystkie z nich przyczyniają się do bardziej wszechstronnego zrozumienia fizykochemicznej natury nanocząstek i dlatego powinny być uważane za komplementarne, a nie konkurencyjne.
Przedstawiona tutaj standardowa procedura operacyjna (SOP) podkreśla doskonałą przydatność AF4-UV-vis z zewnętrzną kalibracją wielkości do wymiarowania nieznanej próbki AuNP w zawiesinie i ostatecznie została zastosowana jako zalecana wytyczna do analizy AF4 nieznanej próbki AuNP w ramach międzynarodowego porównania międzylaboratoryjnego (ILC), które przeprowadzono w ramach projektu Horyzont 2020. ACEnano (wyniki tego ILC będą przedmiotem przyszłej publikacji). Protokół ten wpisuje się zatem w zachęcające i trwające międzynarodowe wysiłki na rzecz walidacji i standaryzacji metodologii AF4 25,50,51,52, podkreślając obiecujący potencjał AF4 w dziedzinie charakteryzacji nanocząstek.

Nanocząstki złota (AuNP) w postaci złota koloidalnego były częścią ludzkiej kultury na długo zanim zaczęto rozumieć, czym są nanocząstki i zanim termin nanocząstka znalazł drogę do współczesnego, naukowego słownictwa. Bez wyraźnej wiedzy na temat ich wyglądu w nanoskali, zawieszony AuNP był już używany do celów medycznych i innych w starożytnych Chinach, Arabii i Indiach w V–VI wieku p.n.e.1, a także starożytni Rzymianie wykorzystali ich rubinowy kolor, aby słynnie zabarwić swoją ceramikę na wystawie Pucharu Likurga w British Museum2. W świecie zachodnim, przez wieki od średniowiecza do ery nowożytnej, zawieszone AuNP były głównie używane jako środki barwiące do szkła i emalii (Purple of Cassius)3, a także do leczenia różnych chorób (Pitable Gold), zwłaszcza syfilis4.
Jednak wszystkie te badania skupiały się głównie na zastosowaniu zawieszonych AuNP i to Michael Faraday w 1857 roku wprowadził pierwsze racjonalne podejście do badania ich powstawania, natury oraz właściwości5. Chociaż Faraday już wtedy zdawał sobie sprawę, że te AuNP muszą mieć bardzo małe wymiary, dopiero rozwój mikroskopii elektronowej sprawił, że jawne informacje o ich rozkładzie wielkości stały się dostępne6,7, co ostatecznie umożliwiło korelację między rozmiarem a innymi właściwościami AuNP.
Obecnie, dzięki dość łatwej i prostej syntezie, niezwykłym właściwościom optycznym (powierzchniowy rezonans plazmonowy), dobrej stabilności chemicznej, a tym samym niewielkiej toksyczności, a także dużej wszechstronności pod względem dostępnych rozmiarów i modyfikacji powierzchni, AuNP znalazły szerokie zastosowanie w dziedzinach takich jak nanoelektronika8, diagnostics9, terapia raka10, czy dostarczanie leków11. Oczywiście, dla tych zastosowań, dokładna wiedza na temat wielkości i rozkładu wielkości zastosowanego AuNP jest podstawowym warunkiem zapewnienia optymalnej skuteczności12 i istnieje duże zapotrzebowanie na solidne i niezawodne narzędzia do określenia tego kluczowego parametru fizykochemicznego. Obecnie istnieje mnóstwo technik analitycznych zdolnych do wymiarowania AuNP w zawiesinie, w tym na przykład spektroskopia UV-vis (UV-vis)13, dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)14 lub spektrometria masowa plazmy sprzężonej indukcyjnie z pojedynczymi cząstkami (spICP-MS)15, przy czym frakcjonowanie przepływu pola (FFF) jest kluczowym graczem w tej dziedzinie16,17,18,19,20.
Po raz pierwszy opracowany w 1966 roku przez J. Calvina Giddingsa21, FFF obejmuje rodzinę technik frakcjonowania opartych na elucji, gdzie separacja odbywa się w cienkim, przypominającym wstęgę kanale bez fazy stacjonarnej22,23. W FFF separacja jest indukowana przez oddziaływanie próbki z zewnętrznym polem siłowym, które działa prostopadle do kierunku przepływu w kanale laminarnym, w którym próbka jest transportowana w dół zwykle w kierunku odpowiednich detektorów in-line. Wśród tych pokrewnych technik FFF, Asymetryczne Frakcjonowanie Pola Przepływu (AF4), w którym drugi przepływ (przepływ krzyżowy) działa jako pole siłowe, stał się najczęściej używanym podtypem24. W AF4 dno kanału (ściana akumulacyjna) jest wyposażone w półprzepuszczalną membranę ultrafiltracyjną, która jest w stanie zatrzymać próbkę, jednocześnie umożliwiając przepływ krzyżowy przez membranę i opuszczenie kanału przez dodatkowy wylot. W ten sposób przepływ krzyżowy może popchnąć próbkę w kierunku ściany akumulacji, przeciwdziałając w ten sposób jej strumieniowi indukowanemu dyfuzją (ruchy Browna). W wynikowej równowadze strumieni wywołanych polem i dyfuzją; Mniejsze składniki próbki wykazujące wyższe współczynniki dyfuzji ustawiają się bliżej środka kanału, podczas gdy większe składniki próbki wykazujące niższe współczynniki dyfuzji znajdują się bliżej ściany akumulacji. Ze względu na paraboliczny profil przepływu wewnątrz kanału, mniejsze składniki próbki są zatem transportowane w szybszych blaszkach przepływu kanału i eluują przed większymi składnikami próbki. Korzystając z parametru retencji FFF i równań współczynnika dyfuzji Stokesa-Einsteina, czas elucji i odpowiednio objętość elucji próbki w AF4 można następnie bezpośrednio przełożyć na jej rozmiar hydrodynamiczny22. Tutaj opisane zachowanie elucji odnosi się do normalnego trybu elucji i jest zwykle ważne dla AF4 w zakresie wielkości cząstek od około 1 do 500 nm (czasami do 2000 nm w zależności od właściwości cząstek i parametrów frakcjonowania), podczas gdy elucja steryczno-hiperwarstwowa zwykle zachodzi powyżej tego progu wielkości25.
Istnieją trzy popularne sposoby uzyskiwania informacji o rozmiarze po rozdzieleniu przez FFF. Ponieważ FFF jest instrumentem modułowym, można go łączyć z wieloma detektorami, takimi jak detektory rozpraszania światła wrażliwe na rozmiar oparte na zasadzie wielokątowego rozpraszania światła (MALS)26,27, Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)28,29, a nawet kombinację obu, aby uzyskać dodatkowe informacje o kształcie30,31. Jednakże, ponieważ zachowanie retencji próbki w kanale FFF jest generalnie regulowane przez dobrze zdefiniowane siły fizyczne, rozmiar można również obliczyć przy użyciu podejścia matematycznego (teoria FFF), gdzie prosty detektor stężenia (np. detektor UV-vis) jest wystarczający do wskazania obecności próbki elucyjnej32,33.
Jako trzecią opcję, tutaj zgłaszamy zastosowanie zewnętrznej kalibracji rozmiaru34,35 przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów AuNP w zakresie wielkości 20–100 nm do wymiarowania nieznanej próbki nanocząstek złota w zawiesinie za pomocą AF4 w połączeniu z detekcją UV-vis. Ta prosta konfiguracja eksperymentalna została wybrana celowo, aby umożliwić jak największej liczbie laboratoriów dołączenie do międzynarodowego porównania międzylaboratoryjnego (ILC), które zostało następnie przeprowadzone w ramach projektu Unii Europejskiej ACEnano w ramach programu Horyzont 2020 w oparciu o przedstawiony tutaj protokół.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mikro; m Filtry membranowe (hydrofilowe PVDF)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-FIL-TEF-002</td><td>Służy do filtracji roztworów wodnych</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtr strzykawkowy PVDF (d = 33 mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>Durapore Millex</td><td>Służy do filtracji pipet o regulowanej objętości NovaChem100</td></tr><tr><td>(1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>Research Plus</td><td>Służy do przygotowania rozcieńczonych zawiesin AuNP</td></tr><tr><td>Kartridż AF4</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF - Kanał analityczny AF4</td><td>Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako AF4-system</td></tr><tr><td>AF4 Membrana - Regenerowana celuloza (10 kDa MWCO)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td><td>Element zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako system AF4</td></tr><tr><td>Waga analityczna (dokładność 0,1 mg)</td><td>Sartorius</td><td>ENTRIS124I-1S</td><td>Służy do ważenia granulek SDS i NaOH do przygotowania roztworu czyszczącego</td></tr><tr><td>Automatyczny podajnik próbek</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN5300</td><td>Element zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Piece kanałowej</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN4020</td><td>Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako system AF4</td></tr><tr><td>Moduł Crossflow</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF Moduł sterujący</td> konfiguracji <td>AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Jednorazowe końcówki do pipet (1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>ep T.I.P.S</td><td>Służy do przygotowania rozcieńczonych zawiesin AuNP</td></tr><tr><td>Kolby (np. o objętości 2 litrów)</td><td>neoLab</td><td>1-0199</td><td>Używany do przechowywania eluentu</td></tr><tr><td>Pompa ostrości</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1131</td><td>Składnik zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Szklane fiolki (np. objętość 1,5 ml)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>VIA-002</td><td>Służy do przechowywania próbek</td></tr><tr><td>Złote wzorce wielkości nanocząstek (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaCal Gold</td><td>50 mg L-1 każdy, służy do ustalenia funkcji kalibracji wielkości</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>IKA</td><td>VIBRAX-VXR</td><td>Służy do przyspieszania rozpuszczania granulek SDS i NaOH w komputerze</td></tr><tr><td>osobistym (PC)</td> z wodą ultranową.Dell <td>Technologies</td><td>/</td><td>Jednostka do sterowania przebiegami AF4, nagrywania i oceny zebranych danych, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytnik jest odsyłany do instrukcji Postnova AF2000</td></tr><tr><td>Środki ochrony indywidualnej (rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary itp.)</td><td>/</td><td>/</td><td>Zgodnie z odpowiednim laboratorium" s zasady bezpieczeństwa pracy z chemikaliami, w tym z nanomateriałami inżynieryjnymi</td></tr><tr><td>Zakrętka do szklanych fiolek (np. o objętości 1,5 ml)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-VIA-09150868</td><td>Służy do przechowywania próbek</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS), &ge; 99 %, Klasa bibuły</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG</td><td>2326.1</td><td>Stosowany do przygotowania roztworu czyszczącego</td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu (NaOH), &ge; 98 %, p.a</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG</td><td>6771.1</td><td>Służy do przygotowania roztworu czyszczącego</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do sterowania i akwizycji danych</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaFFF AF2000 Oprogramowanie</td><td>Oprogramowanie do wykonywania przebiegów Af4 i akwizycji danych, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytnik jest odsyłany do instrukcji Postnova AF2000</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do oceny danych</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Oprogramowanie</td> <td>NovaAnalysisOprogramowanie do oceny danych AF4, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytelnik jest odsyłany do instrukcji obsługi Postnova NovaAnalysis</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do końcowego przetwarzania danych</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Origin 2019</td><td>Używany do końcowego przetwarzania danych</td></tr><tr><td>Solvent Degasser</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7520</td><td>Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie</td></tr> <tr><td>jest opisany jako system AF4Solvent Selector</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7310</td><td>Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Solvent Organizer</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7140</td><td>Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Mieszanina środków powierzchniowo czynnych</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaChem100</td><td>Mieszanina różnych środków powierzchniowo czynnych i soli stosowanych do przygotowania eluentu</td></tr><tr><td>Pompa końcówkowa</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1130</td><td>Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Nieznana próbka AuNP</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC60</td><td>60 nm Próbka AuNP używana do oznaczania wielkości za pomocą funkcji kalibracji wielkości</td></tr><tr><td>Detektor UV-vis</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Detektor UV-vis PN3211</td><td>Do dalszego sprzężenia z systemem AF4</td></tr><tr><td>Jednostka filtracji próżniowej</td> System <td>filtracji eluentów</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Służy do zapewnienia niskiej zawartości cząstek tła i usuwania rozpuszczonego powietrza w stosowanych eluentach w celu zapewnienia optymalnych warunków</td></tr> <tr>frakcjonowania AF4<td>Vortex</td><td>IKA</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Służy do homogenizacji rozcieńczonych zawiesin AuNP</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>Merck Millipore</td><td>Milli-Q Integral 5</td><td>Służy do wytwarzania wody ultraczystej (UPW, 18.2 M&Omega; cm rezystywności) do przygotowania roztworu czyszczącego, eluentów i rozcieńczania zawiesin AuNP</td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Wielkość cząstek jest prawdopodobnie najważniejszym parametrem fizykochemicznym związanym z pojęciem nanocząstki. Precyzyjna wiedza na temat wielkości i rozkładu wielkości nanocząstek ma ogromne znaczenie dla różnych zastosowań. Ważny jest również zakres rozmiarów, ponieważ określa on najbardziej "aktywny" składnik dawki nanocząstek.
Frakcjonowanie przepływu asymetrycznego (AF4) to potężna technika wymiarowania cząstek w zawiesinie w zakresie wielkości około 1–1000 nm. Istnieje kilka sposobów uzyskiwania informacji o rozmiarze z eksperymentu AF4. Oprócz sprzężenia AF4 online z detektorami wrażliwymi na rozmiar w oparciu o zasady wielokątowego rozpraszania światła lub dynamicznego rozpraszania światła, istnieje również możliwość skorelowania wielkości próbki z czasem jej retencji przy użyciu ugruntowanego podejścia teoretycznego (teoria FFF) lub poprzez porównanie jej z czasami retencji dobrze zdefiniowanych wzorców wielkości cząstek (kalibracja wielkości zewnętrznej).
Opisujemy tutaj rozwój i wewnętrzną walidację standardowej procedury operacyjnej (SOP) do wymiarowania nieznanej próbki nanocząstek złota za pomocą AF4 w połączeniu z detekcją UV-vis przy użyciu zewnętrznej kalibracji rozmiaru za pomocą wzorców nanocząstek złota w zakresie wielkości 20-100 nm. Procedura ta zawiera szczegółowy opis opracowanego przepływu pracy, w tym przygotowania próbki, konfiguracji i kwalifikacji przyrządu AF4, opracowania metody AF4 i frakcjonowania nieznanej próbki nanocząstek złota, a także korelacji uzyskanych wyników z ustaloną kalibracją wielkości zewnętrznej. Opisana tutaj procedura SOP została ostatecznie pomyślnie zwalidowana w ramach międzylaboratoryjnego badania porównawczego, podkreślając doskonałą wytrzymałość i niezawodność AF4 do wymiarowania próbek nanocząstek w zawiesinie.

W pierwszej kolejności standardy wielkości AuNP poddano frakcjonowaniu za pomocą AF4, a następnie wykryto je metodą UV-vis, mierząc absorbancję AuNP przy długości fali 532 nm (powierzchniowy rezonans plazmonowy AuNP). Nałożenie uzyskanych fraktogramów przedstawiono w Rysunek 1Czasy retencji każdej AuNP przy odpowiadającym jej maksimum piku w widmie UV-vis, uzyskane z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach, wymieniono w Tabela 5Względne odchylenie standardowe wszystkich czasów retencji było mniejsze niż 1,1%, przy czym wariancja pomiaru malała wraz ze wzrostem rozmiaru. Ogólnie osiągnięto doskonałą powtarzalność. Zastosowano stałą siłę separacji, co zaowocowało liniową zależnością między czasem elucji a rozmiarem hydrodynamicznym. Zewnętrzną krzywą kalibracji rozmiaru wyznaczono poprzez naniesienie określonego promienia hydrodynamicznego w funkcji czasu elucji skorygowanego o czas martwy (netto czasu retencji). Analiza regresji liniowej pozwoliła na wyznaczenie liniowej funkcji kalibracyjnej z wyrazem wolnym a = -3,373 nm ± 1,716 nm oraz nachyleniem b = 1,209 nm∙min-1 ± 0,055 nm∙min-1Liniowość procesu elucji została potwierdzona za pomocą współczynnika korelacji R²2 wynoszącej 0,9958. Odpowiednia funkcja kalibracyjna jest przedstawiona graficznie w Rycina 2.
Druga część dotyczyła analizy nieznanej próbki AuNP. Trzy alikwoty próbki przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w sekcji protokołu (sekcja 4.2). Każdy z trzech alikwotów badano w trzech powtórzeniach, stosując tę samą metodę frakcjonowania AF4, która została zastosowana dla wzorców wielkości AuNP. Wszystkie dziewięć fraktogramów AF4-UV-vis uzyskanych dla nieznanej próbki AuNP przedstawiono na Rysunku 3, a ich odpowiednie oceny podsumowano w Tabeli 6>. Względne odchylenie standardowe odpowiednich czasów retencji było znacząco niskie i mieściło się w przedziale od 0,1% do 0,5%. Wykorzystując funkcję kalibracji wielkości cząstek uzyskaną z frakcjonowania wzorców wielkości AuNP i korelując ją z uzyskanymi czasami retencji nieznanej próbki AuNP w maksimum piku UV-vis, obliczono ogólną średnią promień hydrodynamiczny wynoszący 29,4 nm ± 0,2 nm. Ponadto uzyskano zadowalający odzysk masy na poziomie 83,1% ± 1,2%, co wskazuje na brak istotnej aglomeracji lub rozpuszczania się próbki AuNP oraz brak znacznej adsorpcji cząstek na powierzchni membrany. Rysunek 4 przedstawia uzyskany rozkład wielkości cząstek z uśrednionymi wszystkimi dziewięcioma śladami sygnału UV-vis, co podkreśla doskonałą powtarzalność zastosowanej metody AF4.
<img alt="Wykres chromatografii wykluczania; znormalizowany sygnał UV-vis % w funkcji czasu, przedstawiający rozdział białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Fraktogramy AF4-UV-vis uzyskane z analizy trzech powtórzeń czterech indywidualnych wzorców kalibracyjnych wielkości AuNP z znormalizowaną intensywnością sygnału i zastosowaną stałą szybkością przepływu krzyżowego (linia czarna). Piki martwej objętości zaznaczono na szaro w okolicy 5,9 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres promienia hydrodynamicznego w funkcji czasu; analiza danych dyfuzji; dopasowanie liniowe; wyznaczanie rozmiaru cząstek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Uzyskana funkcja zewnętrznej kalibracji rozmiaru, zawierająca słupki błędów wyznaczone na podstawie odpowiednich odchyleń standardowych pomiarów DLS (Tabela 4) oraz wariancji uzyskanych czasów retencji AF4 (Tabela 5), po naniesieniu określonego promienia hydrodynamicznego w funkcji czasu retencji każdego poszczególnego standardu kalibracji rozmiaru AuNP w maksimum jego piku. Na podstawie analizy regresji liniowej obliczono liniową funkcję kalibracyjną z błędami standardowymi w formie y = a + bx, gdzie a = -3,373 nm ± 1,716 nm oraz b = 1,209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1. Wyznaczono współczynnik korelacji R2 = 0,9958, co wskazuje na liniową zależność. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres chromatografii UV-vis, pik martwy, ocena metody, analiza spektralna rozdziału związków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Fraktogramy AF4-UV-vis z pomiarów trzykrotnych trzech alikwotów zawierających nieznane AuNP. Zastosowana stała szybkość przepływu poprzecznego w czasie pomiaru przedstawiono czarną linią. Pik martwy w okolicach 5,9 min zaznaczono kolorem szarym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres rozkładu promienia hydrodynamicznego; krzywa rozkładu różnicowego w funkcji czasu, skala nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Nałożenie uzyskanego średniego rozkładu wielkości cząstek (kolor czerwony) dla nieznanej próbki AuNP oraz zastosowanej liniowej funkcji kalibracyjnej (linia przerywana). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Komponent</td>
			<td>Nr CAS</td>
			<td>Waga (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Woda</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Kwas 9-oktadecenowy (Z)-, związek z 2,2',2''-nitrilotris[etanolem](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Węglan sodu</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alkohole, C12-14, wtórne, etoksylowane</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Tetrasodowy EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Glikol polietylenowy</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Oleinian sodu</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Wodorowęglan sodu</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista składników mieszaniny surfaktantów użytej do przygotowania eluentu (patrz również Tabela materiałów).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Parametry AF4-UV-vis</td>
			<td >Jednostka</td>
			<td >Wartość</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Grubość dystansera</td>
			<td >µm</td>
			<td >350</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ detektora</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ krzyżowy</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0 (stały przez 8 min)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ ogniskujący</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas opóźnienia / czas stabilizacji</td>
			<td >min</td>
			<td >0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ wtrysku</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas przejścia</td>
			<td >min</td>
			<td >0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas wtrysku</td>
			<td >min</td>
			<td >0.1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Krok elucji</td>
			<td >min</td>
			<td >8</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas kroku płukania</td>
			<td >min</td>
			<td >0.1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ kroku płukania</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0.1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Objętość wtrysku</td>
			<td >µL</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Stężenie próbki</td>
			<td >mg L-1</td>
			<td >12.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Typ membrany</td>
			<td ></td>
			<td >Celuloza regenerowana</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próg odcięcia masy cząsteczkowej membrany</td>
			<td >kDa</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Eluent</td>
			<td ></td>
			<td >0.025% (v/v) mieszanina surfaktantów</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Długość fali UV-vis</td>
			<td >nm</td>
			<td >532</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czułość UV-vis</td>
			<td >-</td>
			<td >0.001</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Podsumowanie parametrów metody frakcjonowania AF4-UV-vis w celu przeprowadzenia pomiaru z bezpośrednim wtryskiem bez zastosowania siły separacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Parametry AF4-UV-vis</td>
			<td >Jednostka</td>
			<td >Wartość</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Grubość dystansera</td>
			<td >µm</td>
			<td >350</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ detektora</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0,5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ krzyżowy</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >1 (60 min stały, 10 min liniowy)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ ogniskujący</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >1,3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas opóźnienia / czas stabilizacji</td>
			<td >min</td>
			<td >2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ wstrzykiwania</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0,2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas przejścia</td>
			<td >min</td>
			<td >0,2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas wstrzykiwania</td>
			<td >min</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Krok elucji</td>
			<td >min</td>
			<td >70 (60 min stały, 10 min liniowy)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Krok płukania</td>
			<td >min</td>
			<td >9</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przepływ w kroku płukania</td>
			<td >mL min-1</td>
			<td >0,5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Objętość wstrzykiwania</td>
			<td >µL</td>
			<td >50</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Stężenie próbki</td>
			<td >mg L-1</td>
			<td >12,5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Typ membrany</td>
			<td ></td>
			<td >Regenerowana celuloza</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próg odcięcia masy cząsteczkowej membrany</td>
			<td >kDa</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Eluent</td>
			<td ></td>
			<td >0,025% (v/v) mieszanina surfaktantów</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Długość fali UV-vis</td>
			<td >nm</td>
			<td >532</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czułość UV-vis</td>
			<td >-</td>
			<td >0,001</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Podsumowanie parametrów metody frakcjonowania AF4-UV-vis w celu przeprowadzenia procesu frakcjonowania z zastosowaniem przepływu krzyżowego jako siły separacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Wzorzec kalibracyjny</td>
			<td >Środek stabilizujący</td>
			<td >Średnia wielkość (TEM) (nm)</td>
			<td >CV (średnia wielkość TEM) (%)</td>
			<td >Potencjał zeta (mV)</td>
			<td >SD (potencjał zeta) (mV)</td>
			<td >Promień hydrodynamiczny (DLS) (nm)</td>
			<td >SD (promień hydrodynamiczny) (nm)</td>
			<td >PDI</td>
			<td >SD (PDI)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AuNP 20 nm</td>
			<td >Cytrynian</td>
			<td >20.1</td>
			<td >≤ 8</td>
			<td >-48.9</td>
			<td >1.5</td>
			<td >10.95</td>
			<td >0.12</td>
			<td >0.082</td>
			<td >0.009</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AuNP 40 nm</td>
			<td >Cytrynian</td>
			<td >40.8</td>
			<td >≤ 8</td>
			<td >-30.4</td>
			<td >1.0</td>
			<td >20.30</td>
			<td >0.13</td>
			<td >0.127</td>
			<td >0.006</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AuNP 80 nm</td>
			<td >Cytrynian</td>
			<td >79.2</td>
			<td >≤ 8</td>
			<td >-51.5</td>
			<td >1.3</td>
			<td >38.85</td>
			<td >0.23</td>
			<td >0.138</td>
			<td >0.013</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AuNP 100 nm</td>
			<td >Cytrynian</td>
			<td >102.2</td>
			<td >≤ 8</td>
			<td >-50.9</td>
			<td >0.9</td>
			<td >52.30</td>
			<td >0.37</td>
			<td >0.078</td>
			<td >0.009</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Podsumowanie parametrów fizykochemicznych zastosowanych wzorców kalibracyjnych AuNP, w tym czynnika stabilizującego, średniej wielkości w TEM, potencjału Zeta wyznaczonego w zawiesinie natywnej, a także promienia hydrodynamicznego DLS i indeksu polidyspersyjności (PDI) wyznaczonego w eluencie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Wzorzec kalibracyjny</td >
			<td >Pomiar</td >
			<td >Czas retencji w maksimum piku (min)</td >
			<td >Netto czas retencji w maksimum piku (min)</td >
			<td >Średni netto czas retencji (min)</td >
			<td >SD (%) (netto czas retencji)</td >
			<td >SD (min) (netto czas retencji)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="3" >AuNP 20 nm</td >
			<td >1</td >
			<td >17.368</td >
			<td >11.468</td >
			<td rowspan="3" >11.56</td >
			<td rowspan="3" >1.02</td >
			<td rowspan="3" >0.12</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td >17.409</td >
			<td >11.509</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td >
			<td >17.589</td >
			<td >11.689</td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="3" >AuNP 40 nm</td >
			<td >1</td >
			<td >25.316</td >
			<td >19.416</td >
			<td rowspan="3" >19.49</td >
			<td rowspan="3" >0.68</td >
			<td rowspan="3" >0.13</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td >25.32</td >
			<td >19.42</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td >
			<td >25.548</td >
			<td >19.648</td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="3" >AuNP 80 nm</td >
			<td >1</td >
			<td >42.095</td >
			<td >36.195</td >
			<td rowspan="3" >36.29</td >
			<td rowspan="3" >0.23</td >
			<td rowspan="3" >0.08</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td >42.219</td >
			<td >36.319</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td >
			<td >42.257</td >
			<td >36.357</td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="3" >AuNP 100 nm</td >
			<td >1</td >
			<td >50.975</td >
			<td >45.075</td >
			<td rowspan="3" >45.06</td >
			<td rowspan="3" >0.07</td >
			<td rowspan="3" >0.03</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td >50.924</td >
			<td >45.024</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td >
			<td >50.986</td >
			<td >45.086</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 5: Czasy retencji wzorców kalibracyjnych AuNP w odpowiednich maksimach piku UV-Vis, wyznaczone z odpowiednich fraktogramów AF4-UV-vis przy użyciu metody opisanej w Tabeli 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alikwot</td>
			<td>Pomiar</td>
			<td>Czas retencji maksimum piku (min)</td>
			<td>Średni czas retencji maksimum piku (min)</td>
			<td>Właściwy czas retencji maksimum piku (min)</td>
			<td>SD (%) czasu retencji</td>
			<td>Promień hydrodynamiczny (nm)</td>
			<td>Odzysk (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Podsumowanie czasów retencji przy odpowiednich maksimach piku UV-Vis, promienia hydrodynamicznego obliczonego z zewnętrznej kalibracji wielkości (Rysunek 2) oraz stopnia odzysku nieznanej próbki AuNP uzyskanych z analizy AF4-UV-vis.

Ten protokół opisuje użycie asymetrycznego frakcjonowania przepływu w połączeniu z detekcją UV-vis do określenia wielkości próbki nieznanej próbki nanocząstek złota.

Frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

Zastosowanie asymetrycznego frakcjonowania w polu przepływowym w połączeniu z zewnętrzną kalibracją wielkości jest potężnym narzędziem do dokładnego określania rozkładu wielkości nanocząstek złota w zawiesinie. AF4 obejmuje cały zakres rozmiarów, od jednego do 1000 nanometrów. Jest niezależny od składu próbki składników próbki i może być stosowany nawet do słabo zdyspergowanych i złożonych próbek.Piękno AF4 polega na jego bardzo szerokim zakresie zastosowań, który obejmuje nie tylko nanocząstki o różnym charakterze i wielkości, ale także białka, wirusy czy syntetyczne lub naturalne makrocząsteczki. Zacznij od wirowania 50 miligramów na litr dowolnego wzorca wielkości nanocząstek złota przez dwie minuty, a następnie rozcieńcz wzorzec w stosunku jeden do czterech ultraczystą wodą. Następnie wirować rozcieńczony roztwór przez dodatkowe dwie minuty, aby uzyskać homogenizowaną zawiesinę.Po wyczyszczeniu systemu otwórz wkład AF4, aby umożliwić wymianę membrany AF4. Przepłucz nową membranę za pomocą wody ultraczystej i ponownie zmontuj wkład. Następnie ponownie podłącz wkład do systemu AF4-UV-vis.Przepłukać oczyszczony system AF4-UV-vis przefiltrowanym i odgazowanym eluantem przez co najmniej 30 minut, stosując natężenie przepływu końcówki wynoszące jeden mililitr na minutę, natężenie przepływu ogniskowego jednego mililitra na minutę i natężenie przepływu krzyżowego 1,5 mililitra na minutę, aby zrównoważyć membranę, ustabilizować system i sprawdzić, czy nie ma potencjalnych wycieków. Ciśnienie w układzie powinno osiągnąć stały poziom od czterech do 12 barów. Aby zakwalifikować system AF4-UV-vis poprzez określenie odzysku masy i zmiany czasu retencji przy użyciu dowolnego wzorca wielkości nanocząstek złota, należy przeprowadzić wtrysk bezpośredni bez przyłożenia siły rozdzielającej.Następnie wykonaj przebieg frakcjonowania z zastosowaniem siły rozdzielającej. Aby przygotować wzorce wielkości nanocząstek złota do kalibracji rozmiaru zewnętrznego, należy wirować wszystkie wzorce wielkości nanocząstek złota o wielkości 50 miligramów na litr przez dwie minuty i rozcieńczyć każdą odpowiednią próbkę do analizy w wodzie ultraczystej w stosunku od jednego do czterech. Po przygotowaniu wzorców wielkości, w zakładce metoda FFF należy ustawić natężenie przepływu detektora na 500 mikrolitrów na minutę, natężenie przepływu wtrysku na 500 mikrolitrów na minutę, a czas wtrysku na 0,1 minuty.Ustaw czas trwania elucji na osiem minut bez zdefiniowanej siły separacji i wstrzyknij 10 mikrolitrów pierwszego wzorca do systemu. Po zmierzeniu wszystkich wzorców wielkości wstrzyknij do systemu 50 mikrolitrów pierwszego wzorca. Ustaw natężenie przepływu detektora na 500 mikrolitrów na minutę.Ustaw opóźnienie na dwie minuty, natężenie przepływu wtrysku na 200 mikrolitrów na minutę przez pięć minut, a czas przejścia na 0,2 minuty. Natężenie przepływu ostrości zostanie obliczone automatycznie. Ustaw czas elucji na 60 minut, a natężenie przepływu krzyżowego na jeden mililitr na minutę.Ta metoda AF4 wykorzystuje stałe natężenie przepływu krzyżowego, po którym następuje liniowy zanik w ciągu 10 minut do zera mikrolitrów na minutę. Ustaw etap płukania na dziewięć minut przy natężeniu przepływu końcówki 500 mikrolitrów na minutę. Po frakcjonowaniu wszystkich wzorców wielkości nanocząstek złota należy przygotować próbkę nieznanych nanocząstek złota i przeprowadzić bezpośredni pomiar wtryskowy i frakcjonowanie próbki nieznanej nanocząstki złota, jak właśnie pokazano.Aby przeanalizować dane, należy zaimportować pliki danych do oprogramowania systemowego. Wyświetl pomiary w zakładce przeglądu i wybierz sygnał detektora UV-vis z listy detektorów. Zdefiniuj obszar zainteresowania i linię bazową dla każdego pomiaru, dostosowując w razie potrzeby sygnał i widok linii bazowej.Użyj zestawu narzędzi do przetwarzania sygnału, aby wygładzić wszelkie zaszumione sygnały i użyj funkcji przypisywania parametrów przetwarzania do innych przebiegów, aby umożliwić przypisanie parametrów do innych pomiarów. Aby wykonać obliczenia odzysku masy, otwórz pomiary wtrysku bezpośredniego i dane frakcjonowania. Wstaw kalibrację wtrysku bezpośredniego i wybierz odpowiednie pomiary wtrysku bezpośredniego z widoku ustawień kalibracji wtrysku bezpośredniego.Objętość i stężenie iniekcji próbki zostaną wykorzystane do skorelowania obszaru piku z wstrzykniętą ilością. Następnie należy użyć funkcji przypisania do wybranych cząstek, aby przypisać uzyskaną funkcję kalibracji do odpowiednich pomiarów frakcjonowania. Następnie użyj równania, aby obliczyć odzysk masy nanocząstek złota, porównując obszar pod odpowiednimi pikami UV-vis pomiarów frakcjonowania i wtrysku bezpośredniego.Aby wyświetlić wyniki, otwórz obliczenie wyników ilościowych. Przedstawione zostanie stężenie masy w oparciu o powierzchnię piku. Odzysk masy można uzyskać, porównując tę wartość ze stężeniem wstrzykiwanym.W zakładce wielkości cząstek w oknie kalibracji wielkości cząstek kliknij każdy odpowiedni pomiar w tabeli wyboru referencji do kalibracji, aby wybrać wszystkie przebiegi kalibracji. Pomiary zostaną wyświetlone w tabeli w takiej postaci, w jakiej zostały wybrane. Wprowadź promień hydrodynamiczny dla wszystkich pomiarów kalibracyjnych.Funkcja i równanie zostaną wyświetlone w oknie funkcji kalibracji wielkości cząstek. Aby przypisać funkcję kalibracji do pomiarów nieznanej próbki nanocząstek złota, wybierz odpowiednie frakcjonowanie z listy wyboru przebiegów do przypisania i otwórz obliczenie rozkładu wielkości cząstek, aby wyświetlić wyniki. Obliczony rozmiar zostanie wyświetlony w oknie rozkładu rozmiarów, oznaczony etykietą do maksimum szczytu.Poprzednio utworzona kalibracja wielkości cząstek zostanie wymieniona jako kalibracja dla nieznanych pomiarów próbki nanocząstek złota. Aby uśrednić wszystkie pomiary jednej próbki, zaznacz pole wyboru uśrednianie sygnałów dla próbki. Wynik zostanie wyświetlony na etykiecie maksimum szczytu.Pokazano tu reprezentatywną nakładkę wzorców wielkości nanocząstek złota frakcjonowanych przez AF4 i wykrywanych za pomocą spektroskopii UV-vis pomiaru absorbancji cząstek przy długości fali 532 nanometrów. Względne odchylenie standardowe wszystkich czasów retencji dla każdej nanocząstki przy odpowiednim maksimum piku spektroskopii UV-vis uzyskane z potrójnych pomiarów wyniosło poniżej 1,1%Analiza regresji liniowej tych danych dała liniową funkcję kalibracyjną o kwadratowym współczynniku korelacji R-kwadrat wynoszącym 0,9958. Gdy następnie uzyskano dziewięć fraktogramów spektroskopii AF4-UV-vis z nieznanych próbek nanocząstek złota, względne odchylenie standardowe odpowiednich czasów retencji było znacznie niskie, wahając się od 0,1 do 0,5% Korzystając z funkcji kalibracji wielkości cząstek uzyskanej z frakcjonowania wzorców wielkości nanocząstek złota i korelując te dane z uzyskanymi czasami retencji nieznanej próbki nanocząstek złota przy maksimum piku spektroskopii UV-vis, Można obliczyć ogólny średni promień hydrodynamiczny.Ponadto można uzyskać rozsądny odzysk masy wskazujący na brak znaczącej aglomeracji lub rozpuszczenia próbek nanocząstek złota lub znacznej adsorpcji cząstek na powierzchni membrany. W przypadku korzystania z zewnętrznej kalibracji wielkości i analizy AF4 niezwykle ważne jest, aby ta sama metoda AF4 była konsekwentnie stosowana do wszystkich wzorców wielkości i samej próbki. AF4 umożliwia naukowcom lepsze zrozumienie właściwości próbek nanocząstek.Jest to zatem ważne narzędzie kontroli jakości, które ostatecznie przyczynia się do poprawy skuteczności produktów wykorzystujących nanotechnologie.

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ultrafiltracja przepływem stycznym (TFU) to metoda recyrkulacji stosowana do separacji próbek biologicznych na podstawie masy. Metodę TFU zaadaptowano w celu selekcji rozmiarów (średnica 1-20 nm) i silnego zagęszczenia dużej objętości polidyspersyjnych nanocząsteczek srebra (z 4 L o stężeniu 15.2 μg ml-1 do 4 ml o stężeniu 8,539.9 μg ml-1) przy minimalnej agregacji.

Ultrafiltracja przepływem stycznym: „zielona” metoda selekcji rozmiaru i zagęszczania koloidalnych nanocząstek srebra

W tym filmie najpierw opisujemy procedury produkcji i obsługi akustycznego urządzenia przeciwprądowego powierzchniowej fali akustycznej (SAW). Następnie demonstrujemy eksperymentalną konfigurację, która pozwala zarówno na jakościową wizualizację przepływu, jak i analizę ilościową złożonych przepływów w urządzeniu pompującym SAW.

Wytwarzanie, eksploatacja i wizualizacja przepływu w mikrofluidyce akustyczno-przeciwprądowej opartej na powierzchniowych falach akustycznych

Urządzenia milifluidyczne są wykorzystywane do kontrolowanej syntezy nanomateriałów, czasowo-rozdzielczej analizy mechanizmów reakcji i katalizy ciągłego przepływu.

Millifluidyka do syntezy chemicznej i czasowo-rozdzielczych badań mechanistycznych

Mikroskopia konfokalna służy do obrazowania spoczynkowych i przepływających mieszanin koloidowo-polimerowych, które są badane jako układy modelowe dla atrakcyjnych zawiesin. Algorytmy analizy obrazu służą do obliczania wskaźników strukturalnych i dynamicznych dla cząstek koloidalnych, które mierzą zmiany spowodowane ograniczeniem geometrycznym.

Obrazowanie konfokalne ograniczonych mieszanin koloidalno-polimerowych w stanie spoczynku i przepływu

Mikroprzepływowe wytwarzanie podwójnych emulsji zazwyczaj obejmuje urządzenia o wzorzystej zwilżalności lub specjalnie wykonane elementy szklane. W tym miejscu opisujemy wytwarzanie i testowanie generatora podwójnej emulsji z polidimetylosiloksanu (PDMS), który nie wymaga obróbki powierzchni ani skomplikowanych procesów produkcyjnych i jest w stanie wytwarzać podwójne emulsje do 14 μm.

Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

Ten protokół opisuje wykorzystanie strategii wymiany opartej na inercyjnej mikroprzepływowości do oczyszczania komórek inżynierii mikro/nanocząsteczkowej z efektywnym usuwaniem niezwiązanych cząstek.

Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przedstawiono protokół badania dyfuzji pasywnych znaczników w przepływie napędzanym ciśnieniem laminarnym. Procedura ma zastosowanie do różnych geometrii rur kapilarnych.

Dyfuzja pasywnych znaczników w laminarnym przepływie ścinającym

Opisany tutaj protokół ma na celu zmierzenie hydrodynamicznej średnicy sferycznych nanocząstek, a dokładniej nanocząstek złota, w środowisku wodnym za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Ta ostatnia polega na śledzeniu ruchu cząstek spowodowanym ruchami Browna i implementacji równania Stokesa-Einsteina w celu uzyskania średnicy hydrodynamicznej.

Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Przedstawiono protokół syntezy nanocząstek złota o średnicy ~12 nm (nanocząstek Au) w rozpuszczalniku organicznym. Nanocząstki złota są pokryte ligandami oleiloaminy, aby zapobiec aglomeracji. Nanocząstki złota są rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak toluen.

Synteza nanocząstek złota

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Poznaj metodę AF4 z detekcją UV-vis do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę rozmiarów od 1 do 1000 nm dla złożonych próbek.

Frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie

Przeglądaj więcej filmów