Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT
14 grudnia 2020
Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.
Znaczenie tego protokołu polega na tym, że oferuje on proste i powtarzalne ramy do ilościowego określania struktur biofilmu in vitro w różnych warunkach przeciwdrobnoustrojowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga wyeliminować subiektywne różnice związane z ręczną obsługą COMSTAT, co ostatecznie ułatwia standaryzację i przejrzystość eksperymentów we wszystkich ośrodkach badawczych. Aby zobrazować kultury Pseudomonas aeruginosa, należy umieścić płytkę na stoliku mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w odpowiednie długości fal wzbudzenia laserowego i zestawy filtrów.
Użyj soczewki zanurzonej w wodzie od 20 do 25x, aby uchwycić co najmniej sześć warstwowych obrazów stosu z od podłoża do góry każdego segmentu biofilmu w odstępach co 0,3 mikrometra. Następnie zapisz obrazy jako pliki OME-TIFF do analizy COMSTAT. Po pobraniu wszystkich obrazów otwórz pakiet COMSTAT2 w ImageJ i utwórz folder źródłowy na pulpicie.
Dodaj pojedynczy plik OME-TIFF do folderu i otwórz plik OME-TIFF z folderu źródłowego. Usuń wszystkie puste warstwy, które nie zawierają biomasy. Wybierz opcję Plik, Import i Sekwencja obrazu, aby zaimportować plik do ImageJ.
Zlokalizuj i zaznacz folder źródłowy bez otwierania go, a następnie kliknij przycisk Wybierz. Pojawi się okno opcji sekwencji, kliknij OK. Wybierz opcję Obraz, Przekształć i Odwróć Z, aby odwrócić orientację biofilmu tak, aby podłoże znalazło się na górze stosu. Aby zdefiniować właściwości obrazu, wybierz Obraz i właściwości, pojawi się okno źródłowe.
Określ jednostkę długości jako mikron, zdefiniuj głębokość woksela jako 0,3 i kliknij przycisk OK. Wybierz opcje Obraz, Dostosuj i Próg. Aby dostosować próg obrazu w oknie progu, przesuń dolny suwak maksymalnie w prawo, aby ręcznie ustawić maksymalną wartość progową, a następnie użyj górnego suwaka, aby ustawić minimalny próg. Następnie użyj suwaka w oknie obrazu, aby przewinąć każdą warstwę, aby upewnić się, że szum tła jest wystarczająco usunięty w całym stosie, a następnie wybierz opcję Ustaw, aby ustalić dolną wartość progową.
W oknie ustawianie poziomów progowych wybierz przycisk OK, a następnie ustaw i ustal maksymalną wartość progową w podobny sposób. Wybierz pozycję Zastosuj, kliknij przycisk OK w wyświetlonym oknie konwersji stosu na binarny i zamknij okno progu. Wybierz Wtyczki, Bio-Formaty i Eksporter Bio-Formatów, aby zapisać plik z nową nazwą pliku w folderze źródłowym.
Pojawi się okno z wieloma plikami Eksporter formatów biologicznych, wybierz OK. Pojawi się okno opcji eksportera formatów biologicznych, ponownie wybierz OK. Aby uruchomić COMSTAT, wybierz wtyczki i COMSTAT2, pojawi się okno informacji, wybierz OK.In oknie Obserwowane katalogi, wybierz Dodaj, zlokalizuj i zaznacz folder źródłowy, zaznacz i kliknij Wybierz. Pojawi się okno Images in Directories (Obrazy w katalogach) z listą plików OME-TIFF do analizy.
W oknie COMSTAT2.1 usuń zaznaczenie opcji Automatic Thresholding Otsu's Method (Metoda automatycznego progowania) i Connected Volume Filtering (Filtrowanie woluminów połączonych), aby upewnić się, że oprogramowanie używa wstępnie ustawionych wartości progowych dla poszczególnych formatów OME-TIFF. W oknie COMSTAT2.1 wybierz opcję Biomasa, Rozkład grubości i Pole powierzchni, a następnie kliknij przycisk Przejdź, aby uruchomić program. Dane wyjściowe zostaną wyświetlone w oknie dziennika.
Pomiary zostaną automatycznie zapisane jako pliki TXT w folderze źródłowym. W tej reprezentatywnej analizie wykorzystano izolat Pseudomonas aeruginosa, wyhodowany od zakażonego pacjenta z mukowiscydozą, aby zademonstrować mocne strony tego podejścia, niedokładnie określając ilościowo zmiany wywołane przez środki przeciwdrobnoustrojowe w architekturze biofilmu in vitro. Obrazowanie żywych komórek może również wizualizować zmiany w strukturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa przed i po leczeniu monoklonalnym i tobramycyną specyficzną dla biofilmu.
Analiza danych COMSTAT ujawniła istotne różnice między strukturami biofilmu poddanymi działaniu środka w porównaniu z kulturami kontrolnymi. W kulturach traktowanych tobramycyną zaobserwowano wyraźne zmniejszenie średniej grubości i biomasy. Jednak w obecności przeciwciał biofilm P.aeruginosa był odporny na te zmiany strukturalne wywołane przez tobramycynę.
Podczas badania stosunku powierzchni do objętości biologicznej zaobserwowano znaczne zmniejszenie obecności przeciwciał zarówno w biofilmach narażonych na działanie tobramycyny, jak i nieeksponowanych, co wskazuje na tworzenie się agregatów w kulturach poddanych działaniu przeciwciał. Procedurę tę można przeprowadzić w celu ilościowej oceny lub porównania działania różnych środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych do rozbijania matryc biofilmu. Wykorzystując tę technikę jako ogólne ramy, naukowcy mogą badać różne sposoby udoskonalenia protokołu w celu uwzględnienia nowych modeli matematycznych i wtyczek algorytmicznych w ImageJ, aby lepiej zobrazować heterogeniczność biofilmu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia powtarzalny schemat ilościowego określania struktur biofilmu Pseudomonas aeruginosa w różnych warunkach przeciwdrobnoustrojowych. Protokół ma na celu standaryzację oceny architektury biofilmu, zwiększając przejrzystość badań prowadzonych w różnych ośrodkach badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad biofilmem
- Skuteczność przeciwdrobnoustrojowa
Wstęp
- Pseudomonas aeruginosa jest powszechnym patogenem u pacjentów z mukowiscydozą.
- Architektura biofilmu może wpływać na wyniki leczenia.
- Kwantyfikacja charakterystyki biofilmu jest niezbędna do oceny czynników przeciwdrobnoustrojowych.
- Oprogramowanie COMSTAT zapewnia metodę obiektywnej analizy biofilmów.
Cel badania
- Aby ilościowo określić różnice w architekturze biofilmu pomiędzy izolatami klinicznymi.
- Aby ocenić skuteczność różnych środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Aby wyeliminować subiektywne różnice w analizie biofilmu.
Zastosowane metody
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania struktur biofilmu.
- Oprogramowanie COMSTAT do ilościowego określania charakterystyki biofilmu.
- Zastosowanie obiektywu imersyjnego z wodą o powiększeniu od 20 do 25x do obrazowania.
- Pozyskiwanie obrazów w stosie z (z-stack) w odstępach 0.3 µm.
Główne wyniki
- Zaobserwowano różnice w architekturze biofilmu pomiędzy różnymi izolatami.
- Protokół umożliwił standaryzację analizy we wszystkich eksperymentach.
- Analiza COMSTAT dostarczyła obiektywnych wskaźników do oceny biofilmu.
- Skuteczność przeciwmikrobową oceniano na podstawie charakterystyki biofilmu.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa powtarzalność badań nad biofilmem.
- Standaryzacja poprawia wiarygodność wyników eksperymentalnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych ramach w celu prowadzenia dalszych analiz.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustandaryzowana kwantyfikacja efektów przeciwmikrobowych w odniesieniu do architektury biofilmu wspiera walidację celów w opracowywaniu leków przeciwzakaźnych. Obiektywne metryki biofilmu umożliwiają mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku potencjalnych terapeutyków poprzez powiązanie ekspozycji na związek z wynikami strukturalnymi. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych przedklinicznych, redukując zmienność w ocenie fenotypu biofilmu pomiędzy laboratoriami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów przeciwdrobnoustrojowych poprzez ilościowe określanie zmian w grubości biofilmu, masie biologicznej oraz stosunku powierzchni do biovolume.
- Wartość operacyjna: Redukuje subiektywną zmienność w analizie obrazów, wspierając powtarzalność ocen oddziaływania na cel w różnych ośrodkach.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie ilościowych progów skuteczności przeciwbiofilmowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje zestandaryzowane, ilościowe odczyty (biomasa, rozkład grubości, powierzchnia) dla kampanii przesiewowych związków chemicznych.
- Wartość operacyjna: Ustanawia wielokrotnego użytku schemat obrazowania i analizy kompatybilny z platformami konfokalnymi do analizy wysokotreściowej.
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biofilmu do dalszej oceny środków przeciwdrobnoustrojowych lub przeciwbiofilmowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy fenotypy biofilmu in vitro z klinicznie istotnymi izolatami Pseudomonas aeruginosa pochodzącymi z zakażeń w przebiegu mukowiscydozy.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Rozróżnia wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na strukturę biofilmu od ich wpływu na żywotność bakterii, co pozwala wyjaśnić mechanizm działania.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera priorytetyzację związków, które zaburzają architekturę biofilmu bez indukowania fenotypów oporności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację wiodącego związku, zapewniając ilościowe fenotypowanie biofilmu w celu określenia zależności struktura-aktywność.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie leczenia przeciwdrobnoustrojowego z mierzalnymi zmianami w architekturze biofilmu.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki stałym ustawieniom progowym i wyeliminowaniu segmentacji zależnej od użytkownika.
- Analityka: Dostarcza obiektywnych, ilościowych wyników (biomasa, grubość, powierzchnia), które pozwalają na bezpośrednie porównanie warunków przeciwdrobnoustrojowych.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje izolaty P. aeruginosa istotne dla przebiegu choroby, aby zwiększyć ciągłość przedkliniczną i spójność biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy standaryzowane ramy możliwe do dostosowania do innych patogenów tworzących biofilm lub innych klas środków przeciwdrobnoustrojowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie aktywności antybiofilmowej poprzez minimalizację błędnej interpretacji heterogenicznych struktur biofilmu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i porównywalność między laboratoriami dzięki wyeliminowaniu subiektywnych różnic w obsłudze programu COMSTAT.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez redukcję niepowodzeń w przejściu do fazy przedklinicznej wynikających ze słabo scharakteryzowanych efektów biofilmu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko, w oparciu o ilościowe progi rozpadu biofilmu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej oraz przetwarzania obrazów w celu akwizycji i preprocessingu stosów z (z-stack).
- Zależne od dostępu do konfokalnych mikroskopów skaningowych z odpowiednimi długościami fal wzbudzenia oraz obiektywami z imersją wodną o powiększeniu 20–25x.
- Wymaga standaryzacji formatu obrazów (OME-TIFF) oraz organizacji folderów w celu przeprowadzenia seryjnej analizy COMSTAT2.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy zastosowaniu w różnych modelach biofilmu lub różnych mechanizmach działania środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Ograniczone nakładem czasu wymaganym na ręczny preprocessing obrazów przed zautomatyzowaną analizą COMSTAT.
