Name: Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj przezmaciczny model niedrożności tchawicy u myszy do badania przepukliny przeponowej i rozwoju płuc. Technika ta jest odwracalna, zmniejsza koszty utrzymania zwierząt oraz umożliwia szerokie badania genetyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie nie otrzymało żadnego konkretnego grantu od agencji finansujących w sektorze publicznym, komercyjnym lub non-profit. Wszyscy autorzy wnieśli znaczący wkład w koncepcję i projekt badania, pozyskiwanie, analizę i interpretację danych, przygotowanie artykułu i jego korektę pod kątem ważnych treści intelektualnych oraz ostateczne zatwierdzenie wersji, która ma zostać złożona. Autorzy dziękują Canowi Sabuncuoğlu za jego życzliwy wysiłek włożony w stworzenie dzieła sztuki techniki chirurgicznej.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications No. 80023, wersja z 1978 r.). Procedura została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Fundacji Badawczej Cincinnati Children's zgodnie z protokołem IACUC nr 2016-0068.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Aby skrzyżować myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego (WT) w tym samym wieku, umieść je w jednej klatce o godzinie 18:00 i rozdziel następnego dnia o godzinie 9:00.</li>
	<li>Aby wyznaczyć 0. dzień embrionalny (E0), sprawdź obecność czopa pochwowego, który posiada jednorodną strefę zewnętrzną przylegającą do ściany pochwy oraz wewnętrzną strefę włóknistą zawierającą plemniki tworzące splątane masy zmieszane z włóknami materiału czopa.</li>
	<li>Zapisz masę myszy w momencie kryzowania.</li>
	<li>Ponownie zważ myszy w dniu E10, aby potwierdzić trwanie ciąży.</li>
	<li>Przeprowadź zabieg chirurgiczny w dniu E16,5 (wczesny etap kanalikowy).</li>
	<li>Zesterylizuj narzędzia, które będą wykorzystywane podczas operacji: nożyczki, uchwyt igłowy, pęsety, zaciski oraz skalpele i uchwyty do skalpeli.</li>
	<li>Podgrzej platformę operacyjną do 24 °C i przed zabiegiem przygotuj ciepłą sól fizjologiczną (24 °C).</li>
	<li>Przygotuj ciepłe środowisko do rekonwalescencji i pozostaw w klatce mokrą karmę, aby umożliwić szybkie karmienie.</li>
	<li>Pozostań przy operowanych zwierzętach do czasu, aż będą w stanie samodzielnie się karmić.</li>
	<li>Po zabiegu utrzymuj operowane myszy pojedynczo w oddzielnych klatkach.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Podaj podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny ciężarnym samicom 1 h przed zabiegiem.</li>
	<li>Zastosuj izofluran drogą wziewną w dawce 5 mL/h do indukcji oraz 2 mL/h w sposób ciągły podczas zabiegu w celu utrzymania znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj ruchy podbródków ciężarnych myszy.</li>
</ol>
3. Laparotomia
<ol>
	<li>Oczyścić powierzchnię brzucha alkoholem i povidone-jodyną. Przez cały czas trwania operacji należy zachować warunki sterylne.</li>
	<li>Wykonać cięcie pionowe w celu przeprowadzenia laparotomii u ciężarnych matek. Wszystkie warstwy należy przeciąć oddzielnie.</li>
	<li>Zidentyfikować rogi macicy po każdej stronie.</li>
	<li>Wyznaczyć płody zakwalifikowane do zabiegu. 
	UWAGA: Nie operować płodów znajdujących się najbliżej pochwy.</li>
	<li>Operować dwa płody w każdym rogu macicy, jeśli po każdej stronie znajduje się parzysta liczba płodów (najczęściej 4), oraz jeden płód w każdym rogu macicy, jeśli w macicy znajduje się nieparzysta liczba płodów (najczęściej 3).</li>
</ol>
4. Zator tchawkowy
<ol>
	<li>Do wizualizacji należy użyć okularów powiększających 2,5x.</li>
	<li>Ustawić róg macicy w pozycji poprzecznej.</li>
	<li>Chwyć szczenięta dwoma palcami, ułożone grzbietem do góry, orientując się po ich oczach i ogonach, aby odpowiednio ustawić płód.</li>
	<li>Delikatnie uciśnij głowę szczeniaka, aby umożliwić jej wyprostowanie, a tym samym zapewnić widoczność szyi.</li>
	<li>Użyj szwy polipropylenowej 6.0 z igłą atraumatyczną, aby wykonać TO (Rycina 1). Utrzymać łożysko z boku, z dala od punktów wprowadzenia i wyjęcia igły.</li>
	<li>Wprowadź igłę poprzecznie przez ścianę macicy, z dala od łożyska, na wysokości 1/3rd przednia część szyi.</li>
	<li>Ostrożnie przesuń igłę do linii środkowej szyi i skieruj ją w stronę przedniej części, następnie wyprowadź ją z szyi pomiędzy tchawicą a przeciwległą pochewką szyjną i macicą.</li>
	<li>Zwiąż szew, dbając o zachowanie integralności błon oraz ściany macicy, i chroń pępowinę podczas wiązania węzła.</li>
</ol>
<img alt="Schemat i zdjęcia sekcji płodu przedstawiające kończynę, szyję, pępowinę, oczy i cechy anatomiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61772/61772fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zamknięcie tchawicy. (A) Szew transmaciczny przechodzący przez szyję. (B) Schematyczne przedstawienie struktur po przejściu szwu i przed zawiązaniem węzła. Skróty: C = tętnica szyjna; J = żyła szyjna; T = tchawica; E = przełyk; V = kręg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61772/61772fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Zamknięcie ściany brzucha
<ol>
	<li>Umieścić róg macicy z powrotem w jamie brzusznej.</li>
	<li>Przed zamknięciem rany wstrzyknąć do jamy otrzewnowej 2 mL ciepłego, sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Zastosować szew ciągły nicią z poliglaktyny 5/0 w celu zamknięcia ściany brzusznej, a skórę zamknąć szwem przerywanym z jedwabiu.</li>
	<li>W celu przeciwbólowczym podać 0,1 mg/kg buprenorfiny drogą otrzewnową, a następnie pozostawić matkę do wybudzenia w ciepłym inkubatorze.</li>
</ol>
6. Zbiór
<ol>
	<li>Zpodaj znieczulenie ciężarnej samicy i pobierz wszystkie płody w dniu E18.5 poprzez cięcie cesarskie.</li>
	<li>Sprawdź żywotność płodów, obserwując ich ruchy.</li>
	<li>Zastosuj co najmniej dwie różne techniki eutanazji: insuflację dwutlenkiem węgla oraz zwichnięcie stawów szyjnych.</li>
	<li>Usuń zwłoki zgodnie z regulaminem laboratorium weterynaryjnego.</li>
	<li>Zważ wszystkie płody.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie na klatce piersiowej w celu przeprowadzenia torakotomii i usunięcia płuc.</li>
	<li>Wypreparuj płuca embrionów i zważ je, aby obliczyć całkowity stosunek masy płuc do masy ciała (LBWR = (masa lewego płuca + masa prawego płuca)/masa ciała x100).</li>
</ol>
7. Histologia
<ol>
	<li>Przymroź tkanki w ciekłym azocie, medium OCT (optimal cutting temperature compound) oraz w suchym lodzie.</li>
	<li>Przygotuj skrawki próbek o grubości 10 µm przy użyciu kriostatu i osadź je na szkiełkach pokrytych poli-lizyną.</li>
	<li>Wysusz szkiełka w temperaturze 60 °C przez noc, a następnie zabarw je hematoksyliną i eozyną przed ich zamocowaniem w celu akwizycji obrazów przy powiększeniu 10-20x przy użyciu mikroskopu szerokopolowego.</li>
</ol>
8. Obróbka tkanek do analiz białek i DNA
<ol>
	<li>Wypreparowane płuca płodowe zamrozić gwałtownie i zhomogenizować w 300 µL buforu do testu radioimmunoprecypitacji. Wirować przy 4 °C przez 5 min przy 18,000 × g.</li>
	<li>Wyekstrahować i oznaczyć ilość białka, DNA oraz RNA10,12.</li>
</ol>

<ol><li>Wright, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+PaedSurg+Research+Collaboration.+Management+and+outcomes+of+gastrointestinal+congenital+anomalies+in+low%2C+middle+and+high+income+countries%3A+protocol+for+a+multicentre%2C+international%2C+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study.</a> BMJ Open. 9, 030452(2019).</li>
<li>Aydin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approach+for+prenatally+diagnosed+congenital+anomalies+that+requires+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Clinics+Journal+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery.</a> Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).</li>
<li>Nolan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorrhage+after+on-ECMO+repair+of+CDH+is+equivalent+for+muscle+flap+and+prosthetic+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).</li>
<li>Aydin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+diaphragmatic+hernia%3A+the+good%2C+the+bad%2C+and+the+tough%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough.</a> Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).</li>
<li>Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+congenital+diaphragmatic+hernia-associated+musculoskeletal+deformities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities.</a> Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).</li>
<li>Aydın, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+primary+repair+is+not+enough%3A+a+comparison+of+synthetic+patch+and+muscle+flap+closure+in+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia.</a> Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).</li>
<li>Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+fetal+tracheal+ligation+prevents+the+pulmonary+hypoplasia+associated+with+fetal+nephrectomy%3A+Possible+application+for+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).</li>
<li>Mudri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+tracheal+occlusion+on+Wnt+signaling+in+a+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).</li>
<li>Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+occlusion%3A+a+review+of+obstructing+fetal+lungs+to+make+them+grow+and+mature%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+C%2C+Seminars+in+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li>
<li>Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+animal+models+to+human+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).</li>
<li>Varisco, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+reversal+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+ephrin+signaling+following+tracheal+occlusion+in+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta opisuje zabieg chirurgiczny niedrożności tchawicy płodu u myszy i jego wpływ na rozwój płuc. W protokole jest kilka krytycznych kroków, które należy dokładnie wykonać, aby zakończyć się sukcesem. Ciepło platformy, na której odbywa się operacja oraz sól fizjologiczna wprowadzana do jamy otrzewnej ma kluczowe znaczenie dla przebiegu ciąży. Ponadto należy lekko docisnąć głowę szczeniąt, aby zapewnić odsłonięcie szyi.
Szew polipropylenowy 6.0 jest jedynym szwem, który można zastosować do...

Wrodzona przepuklina przeponowa (CDH) występuje w 1:2500 ciążach i skutkuje hipoplazją płuc oraz nadciśnieniem płucnym u noworodków1,2,3,4,5,6. Niedrożność tchawicy płodu (TO) jest uznaną terapią prenatalną u pacjentek z ciężkim CDH, obejmującą fetoskopię w 26-30tygodniu ciąży, w której balon umieszcza się tuż nad cariną, a następnie usuwa w 32.tygodniu ciąży. Ten tymczasowy TO indukuje wzrost płuc płodu i poprawia przeżywalność. Zespół wrodzonej niedrożności dróg oddechowych jest śmiertelnym stanem związanym z przerostem płuc, który zainspirował chirurgów do wykonania sztucznej okluzji tchawicy w celu ułatwienia zatrzymywania wydzielanego płynu nabłonkowego. Ta okluzja zwiększyła ciśnienie świetlne i indukowała wzrost płuc7. Jednak okluzja powinna zostać odwrócona, aby umożliwić dojrzewanie komórek nabłonka.
Różne modele zwierzęce CDH i TO - owiec, królika, szczura i myszy - zostały opracowane w celu zrozumienia patofizjologii CDH i TO. Wszystkie mają swoje zalety i wady, takie jak trudność techniki, wielkość zwierzęcia, koszt, wysoka śmiertelność i dostępność narzędzi genetycznych. Chociaż technika chirurgiczna zastosowana w modelu owczym jest bardzo podobna do tej stosowanej u ludzi i można ją odwrócić, głównymi wadami tego modelu są koszt zwierzęcia, długi okres ciąży i ograniczona liczba możliwych operacji. Model królika ma krótszy okres ciąży i jest tańszy niż model owiec. Jednak model królika jest nieodwracalny8,9. Model mysi charakteryzuje się najniższymi kosztami, największą liczbą płodów w jednej ciąży, najlepiej scharakteryzowanym genomem i szeroko dostępnymi narzędziami do analiz komórkowych i molekularnych. Jednak kluczową wadą jest brak odwracalności OT, co uniemożliwia pełne zrozumienie wpływu OT. W niniejszym artykule przedstawiono metodę, która łączy w sobie wszystkie zalety wcześniej wymienionych modeli i tworzy łatwy, potencjalnie odwracalny i minimalnie inwazyjny model TO gryzonia.

<table><tbody><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Par Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>Do znieczulenia regionalnego</td></tr><tr><td>Izofluran&nbsp;</td><td>&nbsp; Halocarbon Life Sciences</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>Do znieczulenia ogólnego</td></tr><tr><td>Okulary powiększające</td><td>USA Medyczno-chirurgiczna</td><td>SLR-250LBLK</td><td>Co najmniej 2.5x</td></tr><tr><td>mikroskop Nikon 90i</td><td>Nikon</td><td>3417</td><td>Zmotoryzowany zestaw fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>tkanek nukleospinowych&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel, D&uuml; ren, Niemcy</td><td>740952.5</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>do oznaczania białek Pierce BCA do izolacji&nbsp;</td><td>Thermo Fisher, IL, USA</td><td>23225</td><td>Kwantyfikacja białek</td></tr><tr><td>Szew poliglaktynowy</td><td>Ethicon</td><td>VCP451H</td><td>4-0, 24 mm, cięcie</td></tr><tr><td>Szkiełka polilizynowe&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>48382-117</td><td>Szkiełka adhezyjne mikroskopowe</td></tr><tr><td>Szew polipropylenowy</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6-0, 13 mm 1/2c Bufor Taperpoint</td></tr><tr><td>RIPA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>R0278-50ml</td><td>Izolacja białka</td></tr><tr><td>Jedwabny szew</td><td>Ethicon</td><td>VCP682G</td><td>4-0, 24 mm, cięcie</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15596026</td><td>izolacja RNA</td></tr></tbody></table>

przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Niedrożność tchawicy płodu (TO), uznana metoda leczenia, wspomaga wzrost płuc płodu i przeżycie w ciężkiej wrodzonej przepuklinie przeponowej (CDH). Po TO zatrzymanie wydzielanego płynu nabłonkowego zwiększa ciśnienie świetlne i indukuje wzrost płuc. Zdefiniowano różne modele zwierzęce, aby zrozumieć patofizjologię CDH i TO. Wszystkie mają swoje zalety i wady, takie jak trudność techniki, wielkość zwierzęcia, koszt, wysoka śmiertelność i dostępność narzędzi genetycznych. W tym artykule opisano nowy przezmaciczny model TO mysiego płodu. Ciężarne myszy znieczulono, a macica została odsłonięta za pomocą laparotomii w linii środkowej. Tchawicę wybranych płodów podwiązano pojedynczym szwem przezmacicznym umieszczonym za tchawicą, jedną tętnicą szyjną i jedną żyłą szyjną. Zapora została zamknięta i pozwolono jej się zregenerować. Płody pobrano tuż przed porodem. Stosunek płuc do masy ciała u płodów TO był wyższy niż u płodów kontrolnych. Model ten zapewnia naukowcom nowe narzędzie do badania wpływu zarówno OT, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.

W badaniu przeanalizowano 37 płodów: 20 (54,1%) w grupie TO oraz 17 (45,9%) w grupie kontrolnej. W związku z tym, że u 4 płodów z grupy TO nie udało się zamknąć tchawicy, zostały one wykluczone z badania. Nie stwierdzono istotnej różnicy w śmiertelności w obu grupach: 4 płody (25%) w grupie TO i 2 płody (12%) w grupie kontrolnej (p=0,334, iloraz szans (OR) 2,5, 95% przedział ufności (CI) 0,39-16,05). Średnia masa ciała, masa płuc oraz stosunek masy płuc do masy ciała (LBWR) były wyższe w ...

Różne modele zwierzęce wrodzonej przepukliny przeponowej i niedrożności tchawicy płodu prezentują zalety i wady dotyczące kwestii etycznych, kosztów, trudności chirurgicznych, rozmiaru, wskaźników przeżycia i dostępności narzędzi genetycznych. Model ten zapewnia nowe narzędzie do badania wpływu zarówno niedrożności tchawicy, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.

Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

Najważniejszymi zaletami tej techniki są odwracalność, obniżenie kosztów utrzymania zwierząt oraz krótszy okres ciąży. Co więcej, śmiertelność zwierząt jest zmniejszona, ponieważ nie ma potrzeby wykonywania histerektomii. Istnieją też szersze możliwości badań genetycznych.Technika ta może być wykorzystana do badania patofizjologii wrodzonej przepukliny przepony. Można go również zastosować do zrozumienia innych chorób płuc, takich jak krowy i hipoplazja płuc. Zacznij od umożliwienia myszom łączenia się w pary w tej samej klatce od 18:00 do 9:00 następnego dnia.Aby określić E0, obserwuj czop pochwowy, który ma jednorodną, zewnętrzną strefę przyczepioną do ściany pochwy i wewnętrzną strefę, która jest włóknista i zawiera niektóre plemniki, które tworzą splątane masy zmieszane z włóknami materiału zatyczki. Zapisz wagę myszy w czasie krycia i na E10, aby zapewnić ciągłą ciążę i wykonaj operację w E16.5. Wysterylizuj narzędzia, które będą używane podczas zabiegu.Rozgrzej platformę chirurgiczną do 24 stopni Celsjusza i przygotuj ciepłą sól fizjologiczną przed zabiegiem. Stwórz ciepłe środowisko do regeneracji i pozostaw mokrą karmę w klatce do wczesnego karmienia. Oczyść powierzchnię brzucha alkoholem i jodowidonem i utrzymuj sterylne warunki przez cały czas trwania operacji.Wykonaj pionowe nacięcie do laparotomii ciężarnych matek i odetnij wszystkie warstwy osobno. Zidentyfikuj rogi macicy po każdej stronie i określ potencjalne płody do operacji. Operować dwa płody w każdym rogu macicy, jeśli po każdej stronie jest parzysta liczba płodów.I na jednym płodzie w każdym rogu macicy, jeśli jest liczba nieparzysta. Używając okularów z 2-krotnym powiększeniem do wizualizacji, ustaw róg macicy w kierunku poprzecznym. Umieść szczenięta skierowane do góry między dwoma palcami, używając oczu i ogona jako przewodnika.Delikatnie dociśnij głowę szczeniaka, aby umożliwić wyprostowanie głowy i wizualizację szyi. Wykonaj okluzję tchawicy lub TO za pomocą atraumatycznej igły i szwu polipropylenowego 6 na 0. Łożysko należy trzymać z boku i z dala od punktów wejścia i wyjścia igły.Wbić igłę poprzecznie przez bok macicy, z dala od łożyska przez jedną trzecią przedniej części szyi. Następnie delikatnie przesuń igłę do linii środkowej szyi. Skieruj go do przedniej części.Następnie wyjdź z szyi między tchawicą i naprzeciwko pochewki tętnicy szyjnej i macicy. Zawiąż szew, dbając o zachowanie integralności błon i ściany macicy. Wymień róg macicy w jamie brzusznej i wstrzyknij dwa mililitry ciepłej sterylnej soli fizjologicznej do jamy otrzewnej przed zamknięciem.Umieść biegnący szew poliglaktynowy 5 na 0, aby zamknąć ścianę brzucha. I zamknij skórę niespływającym jedwabnym szwem. Zastosować dootrzewnowo 0,1 mikrograma na kilogram buprenorfiny w celu znieczulenia i pozwolić matce na regenerację w ciepłym inkubatorze.Zwróć uwagę, że operowane zwierzę może samo się odżywiać i trzymać je samo w swojej indywidualnej klatce. Zbierz wszystkie płody za pomocą E18.5 przez cesarskie cięcie i sprawdź ich żywotność, obserwując ich ruchy. Zważ wszystkie płody.Wykonaj pionowe nacięcie na klatce piersiowej w celu torakotomii w celu wypreparowania płuc. I zważ je, aby obliczyć całkowity stosunek masy płuc do masy ciała. Zatrzaskowo zamroź tkankę w ciekłym azocie, związku o optymalnej temperaturze cięcia i suchym lodzie.Pociąć próbki na odcinki po 10 mikrometrów za pomocą kriostatu i zamontować je na szkiełkach pokrytych polilizyną. Szkiełka pieczemy przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza i barwimy upieczone szkiełka hematoksyliną i eozyną. Obraz szkiełek w powiększeniu od 10 do 20x, przy użyciu mikroskopu szerokokątnego.W przypadku analiz białek i DNA należy zamrozić tkankę i zhomogenizować ją w 300 mikrolitrach buforu do testów radioimmunoprecypitacyjnych. Wirować przy 18 000 x g i 4 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie wyekstrahuj i określ ilościowo białko, DNA i RNA.Średnia masa ciała, masa płuc i LBWR były wyższe w grupie TO niż w grupie kontrolnej. Ilość DNA w płucach i stosunek DNA do białka były wyższe w grupie OT. Nie zaobserwowano różnic w RNA płuc, a ilość białka była niższa w grupie TO niż w grupie kontrolnej.Analizy histologiczne płuc kontrolnych E18.5 wykazały późne lub wczesne torkowate stadium rozwoju płuc z rozwijającymi się przestrzeniami powietrznymi i pogrubionym śródmiąższem między powierzchniami nabłonka. Płuca w grupie TO miały poszerzone centralne i dystalne przestrzenie powietrzne z subiektywnie większą liczbą jąder. Przystępując do tego protokołu, mocujemy szwy w taki sposób, aby oczy płodu były widoczne, a szyja była przedłużona, aby igła nie naruszała dostosowanych struktur.Usunięcie struktur do odrodzenia płodu w wentylatorze nitrylowym i modele nokautujące CDH będą przyszłymi zastosowaniami tej techniki.

transuterine-fetal-tracheal-occlusion-model-in-mice

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono i porównano dwa modele eksperymentalne służące do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych (OAD) u myszy: model heterotopowej oraz ortotopowej transplantacji tchawicy.

Heterotopowe i ortotopowe przeszczepy tchawicy u myszy wykorzystywane jako modele do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Myszy transgeniczne okazały się niezwykle użyteczne w przypisywaniu funkcji fizjologicznych konkretnym genom. W związku z tym badania ogólne, a w szczególności studia funkcjonalne dróg oddechowych, przeszły znaczący zwrot w stronę modeli mysich. W niniejszym materiale przedstawiamy protokoły badań skurczu tchawicy in vitro w celu oceny funkcji mięśni gładkich w drogach oddechowych myszy.

In vitro pomiary skurczu tchawki u myszy

Opracowaliśmy nową metodę chirurgiczną podawania czynników bioaktywnych drogą wewnątrz tchawiczną do płodu myszy. Ta droga podania jest bardziej efektywna w celowaniu w płuca płodu myszy niż powszechnie stosowane wstrzyknięcia do jamniówki. Procedura ta nie była dotychczas opisana w modelu mysim.

Nowatorskie podejście chirurgiczne do wewnątrztrachealnego podawania substancji bioaktywnych w płodowym modelu mysim

Ten film pokazuje procedurę przezmacicznego zamknięcia tchawicy u płodu myszy u ciężarnej myszy. Model ten można wykorzystać do badania wpływu niedrożnej tchawicy na rozwój płuc.

Modelowanie przezmacicznej niedrożności tchawicy płodu w modelu mysim: zabieg chirurgiczny podwiązania tchawicy płodu u ciężarnej myszy

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Tutaj prezentujemy protokół poprzecznego zwężenia aorty (TAC) za pomocą torakotomii bocznej. Technika ta jest minimalnie inwazyjnym, zamkniętym zabiegiem chirurgicznym klatki piersiowej, mającym na celu symulację przeciążenia ciśnieniem i niewydolności serca u myszy wykorzystujących standardowe warunki laboratoryjne TAC.

Model z zamkniętą klatką piersiową do wywoływania poprzecznego zwężenia aorty u myszy

Zwężenie przeszczepu stanowi krytyczną przeszkodę w wymianie dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej. Aby zbadać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw zwężenia, wykorzystujemy mysi model wymiany tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej z wysiewanymi komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego (BM-MNC). Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół, w tym produkcję rusztowań, izolację BM-MNC, siew przeszczepu i implantację.

Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Celem tego artykułu jest opisanie wyrafinowanej metody intubacji myszy laboratoryjnej. Metoda jest nieinwazyjna i dlatego idealnie nadaje się do badań, które wymagają seryjnego monitorowania funkcji oddechowych i/lub wkraplania leków do płuc.

Wielokrotna intubacja jamy ustnej i tchawicy u myszy

Mysi model chirurgiczny do tworzenia uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia lewego płuca (IR) przy jednoczesnym utrzymaniu wentylacji i unikaniu niedotlenienia.

Mysi model intubacji jamy ustnej i tchawicy i wentylowanej operacji reperfuzji niedokrwienia płuc

Model mysiego przeszczepu wewnątrzpłucnego tchawicy (IPTT) jest cenny do badania choroby zarostowej dróg oddechowych (OAD) po przeszczepie płuc. Oferuje wgląd w specyficzne dla płuc zachowania immunologiczne i angiogenne w znoszeniu dróg oddechowych po allotransplantacji z wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu opisujemy procedurę IPTT i jej oczekiwane efekty.

Mysi przeszczep wewnątrzpłucnej tchawicy: model do badania choroby zarostowej dróg oddechowych po przeszczepie płuc

Poznaj przezmaciczny model niedrożności tchawicy u myszy do badania przepukliny przeponowej i rozwoju płuc. Technika ta jest odwracalna, zmniejsza koszty utrzymania zwierząt oraz umożliwia szerokie badania genetyczne.

Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy

Przeglądaj więcej filmów