Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Technika ta pozwoli naukowcom wyizolować komórki macierzyste raka piersi o maksymalnej czystości i żywotności w celu przeprowadzenia testów charakterystyki funkcjonalnej zarówno in vitro, jak i in vivo. Wyizolowane komórki macierzyste raka piersi mogą być również wykorzystane do wyjaśnienia zdarzeń molekularnych, które kontrolują rakotwórczość i przerzuty, a także do projektowania strategii terapeutycznych ukierunkowanych na te komórki. Przy niewielkich modyfikacjach specyficznych dla typów komórek i tkanek będących przedmiotem zainteresowania, metoda ta może być również stosowana do innych systemów.

Aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki z hodowli komórkowej, należy przemyć 80% zlewającą się hodowlę komórek raka piersi PBS i potraktować komórki odpowiednim roztworem dysocjacji komórek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odłączeniu komórek dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej, aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny komórek i przenieś komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS w celu policzenia.

Po zliczeniu ponownie odwiruj komórki, a następnie ponownie zawieś komórki w ilości od 10 do sześciu komórek na mililitr buforu substratu ALDH. Aby wygenerować zawiesinę pojedynczej komórki z próbki tkanki, użyj ostrzy chirurgicznych w technice krzyżowej, aby zmielić tkankę nowotworową na kawałki o wielkości około jednego milimetra. Umieść kawałki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów buforu dysocjacyjnego.

Zamknąć probówkę parafilmem na 40-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce i rozprowadzić strawione kawałki tkanki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach trypsyny za pomocą pięciomililitrowej pipety i inkubować tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni przez pięć minut. Pod koniec inkubacji energicznie odpipetować tkankę kilka razy, aby uwolnić pojedyncze komórki i dodać wystarczającą ilość pożywki DMEM/F-12, aby uzyskać całkowitą objętość w probówce do 25 mililitrów.

Zebrać komórki przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze wypartego DNA i inkubować przez pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji doprowadzić całkowitą objętość do 10 mililitrów za pomocą PBS. Wymieszaj komórki przez pipetowanie i przepuść je przez sitko o średnicy 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki.

Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach świeżego PBS w celu zliczenia. Aby wykonać test tworzenia kolonii, po sortowaniu ponownie zawieś komórki w kompletnym pożywce i dodaj odpowiednią liczbę komórek macierzystych raka piersi do każdej z trzech probówek zawierających dwa mililitry pożywki na probówkę, oznaczonych jeden razy 10 do drugiej, dwa razy 10 do drugiej lub pięć razy 10 do drugiej komórki. Pipetować w górę i w dół pięć razy, aby dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i umieścić je w indywidualnych dołkach na płytce sześciodołkowej.

Delikatnie obracaj płytką, aby uzyskać równomierny rozkład komórek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż pojawią się kolonie. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem PBS na studzienkę i zabarwić komórki 500 mikrolitrami 0,05% roztworu fioletu krystalicznego na studzienkę przez 30 sekund. Pod koniec inkubacji umyj studzienki dwa razy dwoma mililitrami wody na studzienkę, aby usunąć nadmiar barwnika, a następnie policz i zapisz całkowitą liczbę kolonii w studzience za pomocą mikroskopii świetlnej w cztero- lub dziesięciokrotnym powiększeniu.

Aby przeprowadzić test mammosfery, po sortowaniu, ponownie zawieś komórki w kompletnej pożywce mammosfery i umieść je w gęstości osadzenia pięć razy 10 drugich komórek na centymetr kwadratowy powierzchni na studzience na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie. Przed policzeniem liczby mammosfer w basenie za pomocą mikroskopii świetlnej należy umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć do 10 dni. Aby skonfigurować model hodowli 3D, ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów ekstraktu z błony podstawnej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki bez pęcherzyków i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby umożliwić polimeryzację roztworu.

Dodaj 100 mikrolitrów PBS po 10 minutach, aby uniknąć wysuszenia warstwy żelu. Pod koniec inkubacji zawiesić posortowane komórki na pięć do 50 razy 10 do trzecich komórek na 200 mikrolitrów stężenia pożywki hodowlanej 3D i zastąpić PBS w każdym dołku 96-dołkowej płytki 200 mikrolitrami pożywki zawierającej komórki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 do 14 dni przed oceną kultur pod kątem tworzenia organoidów.

Ludzkie komórki raka piersi, które wykazują zwiększoną aktywność enzymatyczną ALDH, wyrażają wysoki poziom CD44 i niski do ujemnego poziom ekspresji CD24 i mogą być klasyfikowane jako komórki macierzyste raka piersi. Odsetek komórek macierzystych raka piersi w populacji masowej może się różnić w zależności od linii komórkowych lub pacjentów i często zależy od stadium choroby, przy czym bardziej agresywny rak piersi zazwyczaj wykazuje wyższy odsetek komórek macierzystych raka piersi. Zdolność pojedynczej komórki raka piersi do samoodnawiania się i generowania kolonii składających się z 50 komórek można ocenić za pomocą testów tworzenia kolonii.

Zdolność komórek macierzystych raka piersi do samoodnawiania się w warunkach eksperymentalnych niezależnych od zakotwiczenia można ocenić za pomocą testów mammosfery. Hodowla komórek raka piersi i ekstrakt z błony podstawnej pozwalają komórkom macierzystym raka piersi tworzyć struktury 3D, które rekapitulują w warunkach vivo. Ponadto modele ksenoprzeszczepów myszy in vivo można wykorzystać do zrozumienia różnic we wzroście, samoodnowie, różnicowaniu i/lub zdolności komórek macierzystych raka piersi do inicjowania nowotworu w porównaniu z komórkami macierzystymi niezwiązanymi z rakiem piersi lub populacjami komórek masowych.

Po tej procedurze wyizolowane komórki macierzyste raka piersi mogą być wykorzystane w badaniach transkryptomicznych, kinomicznych i metabolomicznych. Metoda ta daje naukowcom możliwość zbadania roli komórek macierzystych raka piersi w inicjacji guza, przerzutach, nawrocie i oporności na terapię.