Name: Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych. Technika umożliwia ocenę funkcjonalną in vitro i in vivo oraz badanie mechanizmów nowotworzenia i przerzutów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom naszego laboratorium za pomocne dyskusje i wsparcie. Nasze badania nad komórkami macierzystymi raka piersi i mikrośrodowiskiem guza są finansowane z grantów Instytutu Badawczego Kanadyjskiego Towarzystwa Badań nad Rakiem oraz Programu Walki z Rakiem Piersi Departamentu Obrony Armii Stanów Zjednoczonych (Grant #BC160912). V.B. jest wspierany przez Western Postdoctoral Fellowship (Western University), a zarówno A.L.A., jak i V.B. są wspierane przez Breast Cancer Society of Canada. CL jest wspierany przez stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship od rządu Kanady.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przerzuty raka piersi i oporność na terapię stały się główną przyczyną śmiertelności kobiet na całym świecie. Istnienie subpopulacji komórek macierzystych raka piersi (BCSC) przyczynia się do zwiększenia przerzutów 26,43,44,45,46 i oporności na terapię 21,47,48. W z...

Zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów komórek macierzystych ludzkiego raka piersi (BCSC) jest kluczowe dla sprostania wyzwaniom napotkanym w leczeniu raka piersi. Pojawienie się koncepcji BCSC datuje się na początek XXI wieku, gdzie stwierdzono, że niewielka populacja komórek raka piersi CD44 + CD24 / niskiego poziomu piersi jest zdolna do generowania heterogennych guzów u myszy 1,2. Następnie zaobserwowano, że ludzkie komórki raka piersi o wysokiej aktywności enzymatycznej dehydrogenazy aldehydowej (ALDH high) również wykazywały podobne właściwości podobne do komórek macierzystych3. Te BCSC reprezentują niewielką populację komórek zdolnych do samoodnawiania i różnicowania, przyczyniając się do niejednorodnego charakteru guzów masowych1,2,3. Coraz więcej dowodów sugeruje, że zmiany w ewolucyjnie zachowanych szlakach sygnałowych napędzają przetrwanie i utrzymanie BCSC4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14. Ponadto wykazano, że zewnętrzne mikrośrodowisko komórki odgrywa kluczową rolę w dyktowaniu różnych funkcji BCSC15,16,17. Te szlaki molekularne i czynniki zewnętrzne regulujące funkcję BCSC przyczyniają się do nawrotu raka piersi, przerzutów18 i rozwoju oporności na terapie19,20,21, przy czym szczątkowe istnienie BCSC po leczeniu stanowi poważne wyzwanie dla całkowitego przeżycia pacjentek z rakiem piersi22,23. Przedkliniczna ocena tych czynników jest zatem bardzo ważna dla identyfikacji terapii ukierunkowanych na BCSC, które mogą być korzystne dla osiągnięcia lepszych wyników leczenia i poprawy całkowitego przeżycia u pacjentek z rakiem piersi.
Kilka modeli linii komórkowych ludzkiego raka piersi in vitro oraz modeli ludzkich ksenoprzeszczepów in vivo zostało wykorzystanych do scharakteryzowania BCSCs24,25,26,27,28,29. Zdolność linii komórkowych do ciągłego zasiedlania po każdym kolejnym pasażu sprawia, że jest to idealny system modelowy do wykonywania badań omicznych i farmakogenomicznych. Jednak linie komórkowe często nie są w stanie oddać niejednorodności obserwowanej w próbkach pobranych od pacjentów. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić dane z linii komórkowych próbkami pochodzącymi od pacjentów. Izolacja BCSC w ich najczystszej postaci jest ważna dla umożliwienia szczegółowej charakterystyki BCSC. Osiągnięcie tej czystości zależy od wyboru markerów fenotypowych, które są specyficzne dla BCSC. Obecnie wysoki fenotyp komórek ALDH CD44 + CD24- jest najczęściej używany do rozróżniania i izolowania ludzkich BCSC z masowych populacji komórek raka piersi przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu uzyskania maksymalnej czystości1,3,26. Ponadto właściwości wyizolowanych BCSC, takie jak samoodnawianie, proliferacja i różnicowanie, można ocenić za pomocą technik in vitro i in vivo.
Na przykład, testy tworzenia kolonii in vitro mogą być użyte do oceny zdolności pojedynczej komórki do samoodnawiania się w celu utworzenia kolonii złożonej z 50 lub więcej komórek w obecności różnych warunków leczenia30. Testy mammosfery mogą być również wykorzystywane do oceny potencjału samoodnawiania się komórek raka piersi w warunkach niezależnych od zakotwiczenia. Ten test mierzy zdolność pojedynczych komórek do generowania i wzrostu jako kulek (mieszanina BCSC i nie-BCSC) przy każdym kolejnym pasażu w warunkach hodowli bez surowicy, nieprzylegających31. Dodatkowo, trójwymiarowe (3D) modele hodowli mogą być wykorzystywane do oceny funkcji BCSC, w tym interakcji komórka-komórka i komórka-macierz, które dokładnie odwzorowują mikrośrodowisko in vivo i umożliwiają badanie aktywności potencjalnych terapii ukierunkowanych na BCSC32. Pomimo różnorodnych zastosowań modeli in vitro, trudno jest modelować złożoność warunków in vivo przy użyciu wyłącznie testów in vitro. Temu wyzwaniu można sprostać, wykorzystując mysie modele ksenoprzeszczepów do oceny zachowania BCSC in vivo. W szczególności takie modele służą jako idealny system do oceny przerzutów raka piersi33, badania interakcji z mikrośrodowiskiem podczas progresji choroby34, obrazowania in vivo35, oraz do przewidywania specyficznej dla pacjenta toksyczności i skuteczności leków przeciwnowotworowych34.
Ten protokół zawiera szczegółowy opis izolacji ludzkich BCSCo wysokimpoziomie ALDH CD44+CD24- o maksymalnej czystości z dużych populacji heterogennych komórek raka piersi. Przedstawiamy również szczegółowy opis trzech technik in vitro (test tworzenia kolonii, test mammosfery i model hodowli 3D) oraz test ksenoprzeszczepu guza in vivo, który można wykorzystać do oceny różnych funkcji BCSC. Metody te byłyby odpowiednie do stosowania przez badaczy zainteresowanych izolacją i charakteryzacją BCSC z linii komórkowych ludzkiego raka piersi lub komórek raka piersi i tkanki nowotworowej pochodzących od pierwotnego pacjenta w celu zrozumienia biologii BCSC i / lub zbadania nowych terapii ukierunkowanych na BCSC.

<table><tbody><tr><td>7-Aminoaktynomycyna D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>sugerowane: 0,25 &mikro; Komórki g/1x106</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże dehydrogenazy aldehydowej (ALDH)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Sprzedawane komercyjnie jako część zestawu testowego ALDEFLOUR; postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania podłoża ALDH</td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Sprzedawany pod nazwą handlową Matrigel</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych: 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>877218</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych: 60 mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych: 96-dołkowe ultra niskie nasadki</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek: 40 mikronów</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>Przygotuj rozcieńczenie 3 mg / ml kolagenu w PBS</td></tr> <tr>w 1:30<td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe: 50 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet krystaliczny</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>Użyj 0,05% roztworu fioletu krystalicznego w wodzie do barwienia</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U / ml</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0,1 mg/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Probówki przepływowe: 5 ml</td><td>BD</td><td>352063</td><td>Polipropylenowe rurki okrągłodenne</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-ludzkie CD24</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-fikoerytryna i barwnik cyjaninowy sprzężone Klon: ML5</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-ludzkie CD44</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-fikoerytryna sprzężona, Klon: G44-26</td></tr><tr><td>N, N-dietyloaminobenzaldehyd (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Sprzedawany komercyjnie jako część zestawu do testów ALDEFLOUR; postępuj zgodnie z instrukcjami producenta Preparat DEAB</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, Bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mammosphere Media Skład</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>SIGMA</td><td>E9644</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>5 & mikro; g / ml</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D Skład podłoża organoidowego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>5 ng / ml</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Neuregulina &beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng / ml</td></tr><tr><td>R-spondyna3</td><td>R& D</td><td>3500</td><td>250 ng/ml</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &micro; M</td></tr></tbody></table>

izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Komórki macierzyste raka piersi (BCSC) to komórki rakowe z dziedzicznymi lub nabytymi cechami podobnymi do komórek macierzystych. Pomimo niskiej częstości występowania są głównym czynnikiem przyczyniającym się do inicjacji raka piersi, nawrotu, przerzutów i oporności na leczenie. Konieczne jest zrozumienie biologii komórek macierzystych raka piersi w celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych w leczeniu raka piersi. Komórki macierzyste raka piersi są izolowane i charakteryzowane w oparciu o ekspresję unikalnych markerów powierzchniowych komórek, takich jak CD44, CD24 i aktywność enzymatyczną dehydrogenazy aldehydowej (ALDH). Te komórki CD44 + CD24- o wysokiej zawartościALDH stanowią populację BCSC i mogą być izolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do dalszych badań funkcjonalnych. W zależności od kwestii naukowej, do oceny cech funkcjonalnych BCSC można stosować różne metody in vitro i in vivo. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół eksperymentalny izolacji ludzkich BCSC zarówno z heterogennych populacji komórek raka piersi, jak i pierwotnej tkanki nowotworowej uzyskanej od pacjentek z rakiem piersi. Ponadto zwracamy uwagę na dalsze testy funkcjonalne in vitro i in vivo, w tym testy tworzenia kolonii, testy mammosfery, modele hodowli 3D i testy ksenoprzeszczepów nowotworowych, które można wykorzystać do oceny funkcji BCSC.

Opisany protokół umożliwia izolację ludzkich komórek macierzystych raka piersi (BCSCs) z heterogennej populacji komórek raka piersi, pochodzących albo z linii komórkowych, albo z dysocjowanej tkanki nowotworowej. W przypadku każdej linii komórkowej lub próbki tkanki kluczowe jest przygotowanie jednorodnej zawiesiny pojedynczych komórek, aby wyizolować BCSCs z maksymalną czystością, ponieważ zanieczyszczenie populacjami niebędącymi BCSCs mogłoby prowadzić do zmiennych odpowiedzi komórkowych, zwłaszcza jeśli celem badania ...

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Technika ta pozwoli naukowcom wyizolować komórki macierzyste raka piersi o maksymalnej czystości i żywotności w celu przeprowadzenia testów charakterystyki funkcjonalnej zarówno in vitro, jak i in vivo. Wyizolowane komórki macierzyste raka piersi mogą być również wykorzystane do wyjaśnienia zdarzeń molekularnych, które kontrolują rakotwórczość i przerzuty, a także do projektowania strategii terapeutycznych ukierunkowanych na te komórki. Przy niewielkich modyfikacjach specyficznych dla typów komórek i tkanek będących przedmiotem zainteresowania, metoda ta może być również stosowana do innych systemów.Aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki z hodowli komórkowej, należy przemyć 80% zlewającą się hodowlę komórek raka piersi PBS i potraktować komórki odpowiednim roztworem dysocjacji komórek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odłączeniu komórek dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej, aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny komórek i przenieś komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS w celu policzenia.Po zliczeniu ponownie odwiruj komórki, a następnie ponownie zawieś komórki w ilości od 10 do sześciu komórek na mililitr buforu substratu ALDH. Aby wygenerować zawiesinę pojedynczej komórki z próbki tkanki, użyj ostrzy chirurgicznych w technice krzyżowej, aby zmielić tkankę nowotworową na kawałki o wielkości około jednego milimetra. Umieść kawałki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów buforu dysocjacyjnego.Zamknąć probówkę parafilmem na 40-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce i rozprowadzić strawione kawałki tkanki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach trypsyny za pomocą pięciomililitrowej pipety i inkubować tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni przez pięć minut. Pod koniec inkubacji energicznie odpipetować tkankę kilka razy, aby uwolnić pojedyncze komórki i dodać wystarczającą ilość pożywki DMEM/F-12, aby uzyskać całkowitą objętość w probówce do 25 mililitrów.Zebrać komórki przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze wypartego DNA i inkubować przez pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji doprowadzić całkowitą objętość do 10 mililitrów za pomocą PBS. Wymieszaj komórki przez pipetowanie i przepuść je przez sitko o średnicy 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki.Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach świeżego PBS w celu zliczenia. Aby wykonać test tworzenia kolonii, po sortowaniu ponownie zawieś komórki w kompletnym pożywce i dodaj odpowiednią liczbę komórek macierzystych raka piersi do każdej z trzech probówek zawierających dwa mililitry pożywki na probówkę, oznaczonych jeden razy 10 do drugiej, dwa razy 10 do drugiej lub pięć razy 10 do drugiej komórki. Pipetować w górę i w dół pięć razy, aby dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i umieścić je w indywidualnych dołkach na płytce sześciodołkowej.Delikatnie obracaj płytką, aby uzyskać równomierny rozkład komórek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż pojawią się kolonie. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem PBS na studzienkę i zabarwić komórki 500 mikrolitrami 0,05% roztworu fioletu krystalicznego na studzienkę przez 30 sekund. Pod koniec inkubacji umyj studzienki dwa razy dwoma mililitrami wody na studzienkę, aby usunąć nadmiar barwnika, a następnie policz i zapisz całkowitą liczbę kolonii w studzience za pomocą mikroskopii świetlnej w cztero- lub dziesięciokrotnym powiększeniu.Aby przeprowadzić test mammosfery, po sortowaniu, ponownie zawieś komórki w kompletnej pożywce mammosfery i umieść je w gęstości osadzenia pięć razy 10 drugich komórek na centymetr kwadratowy powierzchni na studzience na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie. Przed policzeniem liczby mammosfer w basenie za pomocą mikroskopii świetlnej należy umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć do 10 dni. Aby skonfigurować model hodowli 3D, ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów ekstraktu z błony podstawnej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki bez pęcherzyków i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby umożliwić polimeryzację roztworu.Dodaj 100 mikrolitrów PBS po 10 minutach, aby uniknąć wysuszenia warstwy żelu. Pod koniec inkubacji zawiesić posortowane komórki na pięć do 50 razy 10 do trzecich komórek na 200 mikrolitrów stężenia pożywki hodowlanej 3D i zastąpić PBS w każdym dołku 96-dołkowej płytki 200 mikrolitrami pożywki zawierającej komórki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 do 14 dni przed oceną kultur pod kątem tworzenia organoidów.Ludzkie komórki raka piersi, które wykazują zwiększoną aktywność enzymatyczną ALDH, wyrażają wysoki poziom CD44 i niski do ujemnego poziom ekspresji CD24 i mogą być klasyfikowane jako komórki macierzyste raka piersi. Odsetek komórek macierzystych raka piersi w populacji masowej może się różnić w zależności od linii komórkowych lub pacjentów i często zależy od stadium choroby, przy czym bardziej agresywny rak piersi zazwyczaj wykazuje wyższy odsetek komórek macierzystych raka piersi. Zdolność pojedynczej komórki raka piersi do samoodnawiania się i generowania kolonii składających się z 50 komórek można ocenić za pomocą testów tworzenia kolonii.Zdolność komórek macierzystych raka piersi do samoodnawiania się w warunkach eksperymentalnych niezależnych od zakotwiczenia można ocenić za pomocą testów mammosfery. Hodowla komórek raka piersi i ekstrakt z błony podstawnej pozwalają komórkom macierzystym raka piersi tworzyć struktury 3D, które rekapitulują w warunkach vivo. Ponadto modele ksenoprzeszczepów myszy in vivo można wykorzystać do zrozumienia różnic we wzroście, samoodnowie, różnicowaniu i/lub zdolności komórek macierzystych raka piersi do inicjowania nowotworu w porównaniu z komórkami macierzystymi niezwiązanymi z rakiem piersi lub populacjami komórek masowych.Po tej procedurze wyizolowane komórki macierzyste raka piersi mogą być wykorzystane w badaniach transkryptomicznych, kinomicznych i metabolomicznych. Metoda ta daje naukowcom możliwość zbadania roli komórek macierzystych raka piersi w inicjacji guza, przerzutach, nawrocie i oporności na terapię.

isolation-functional-assessment-human-breast-cancer-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTICs), czyli rzadkich komórek w obrębie heterogennego guza posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy nowotworów mózgu u ludzi. Zoptymalizowaliśmy specyficzne warunki hodowli w celu wzbogacenia populacji BTICs, a do dalszej selekcji tych populacji rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową. Następnie w tych wyizolowanych komórkach można przeprowadzić testy samoodnawiania oraz analizę...

Opracowywanie tkanki pierwotnego guza mózgu do testów komórek macierzystych i sortowania przepływowego

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Ta procedura pokaże, jak zsyntetyzowaliśmy i scharakteryzowaliśmy aktywność anty-NFκB i przeciwnowotworowych komórek macierzystych proleku aspiryny-fumaranu.

Synteza i charakterystyka proleku fumaranu aspiryny, który hamuje aktywność NFκB i komórki macierzyste raka piersi

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.

Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych. Technika umożliwia ocenę funkcjonalną in vitro i in vivo oraz badanie mechanizmów nowotworzenia i przerzutów.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Przeglądaj więcej filmów