Usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami

Wiele alergenów wiąże cząsteczki hydrofobowe. Protokół ten umożliwia całkowite usunięcie i zastąpienie tych ligandów, co pozwala nam na systematyczne badanie ich wpływu na strukturę i immunogenność. Zastosowanie HPLC z odwróconymi fazami, w połączeniu z wyżarzaniem termicznym, ma dwie zalety.

Usuwa endogenne ligandy i pomaga rozpuszczać ligandy, aby otworzyć niedostępne w inny sposób miejsca wiązania. Jeśli uda nam się określić czynniki, które przyczyniają się do alergenności, być może będziemy w stanie zaprojektować terapie, które unikają tych czynników. Wiele białek wiąże ligandy lipidowe, które są silnie zatrzymywane i mogą wpływać zarówno na strukturę, jak i funkcję.

Nasza metoda pozwala na systematyczne badanie tych interakcji. Ograniczona rozpuszczalność i dostępność wielu ładunków lipidowych może hamować proces ładowania. Pamiętaj, aby zachować ostrożność podczas przygotowywania tych ligandów i wziąć pod uwagę potrzebę adaptacji specyficznych dla systemu.

Ponieważ praca z hydrofobowymi i nierozpuszczalnymi ligandami jest dostosowaniem dla niektórych alergologów i biochemików, przydatne może być sprawdzenie, jak próbki wyglądają na różnych etapach. Po sklonowaniu, wyrażeniu i oczyszczeniu, nanieść 12 mililitrów rozszczepionego Bla g 1 na odśrodkową jednostkę filtrującą o granicy masy cząsteczkowej mniejszej niż 10 kilodaltonów w celu wielokrotnego wirowania w wirniku kubełkowym wahadłowym, aż całkowita objętość zostanie zmniejszona do mniej niż dwóch mililitrów. Załadować otrzymany koncentrat do systemu HPLC o wymiarach 250 na 10 milimetrów wyposażonego w kolumnę chromatograficzną C18 z odwróconymi fazami, zrównoważoną 97% buforem A i 3% buforem B.Elute Bla g 1 przy natężeniu przepływu 1,5 do 4 mililitrów na minutę, jak wskazano w tabeli, wykorzystując absorbancję fluorescencji przy 280 nanometrach do monitorowania procesu elucji.

Zaczynając od około 34 do 40 minut i stężenia buforu B powyżej 74%, zbierz nie więcej niż cztery mililitry każdej frakcji Bla g 1. Podwielokrotność połączonej frakcji Bla g 1 rozmieścić w szklanych probówkach. Przykryj rurki folią parafinową i przedziurawij folię dwoma otworami.

Następnie zamroź próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę i użyj liofilizatora do wysuszenia powstałych odlipidowanych próbek białka. Aby określić przewidywaną wydajność Bla g 1, ponownie zawiesić liofilizowaną odlipidowaną podwielokrotność testową w pięciu mililitrach buforu do ponownego fałdowania. Podgrzej mieszaninę w 500-mililitrowej zlewce zawierającej 250 mililitrów wody do 95 stopni Celsjusza na gorącej płycie z mieszaniem i przerywanym wirowaniem.

Trzymaj roztwór w temperaturze 95 stopni przez 30 do 60 minut, a następnie pozwól łaźni wodnej powoli wyrównać się do temperatury pokojowej. Gdy roztwór ostygnie, przepuść wyżarzoną mieszaninę lipidów Bla g 1 przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona w celu usunięcia cząstek stałych i użyj nowego filtra odśrodkowego z odcięciem 10 kilodaltonów do buforowej wymiany przefiltrowanego białka trzykrotnie na PBS w celu usunięcia wszelkich pozostałości wolnych kwasów tłuszczowych i rozpuszczalnika organicznego. Następnie należy ocenić stężenie białka za pomocą standardowego testu analizy białka w celu określenia przewidywanej wydajności dla pozostałych podwielokrotności Bla g 1.

Aby odtworzyć Apo-Bla g 1, należy ponownie zawiesić podwielokrotności Bla g 1 w pięciu mililitrach buforu do ponownego składania na podwielokrotność i wyżarzać próbki, jak pokazano. Aby załadować Bla g 1 fosfolipidami, dodaj 10 miligramów pożądanego ładunku do szklanej probówki i rozpuść w chloroformie, a następnie odparuj chloroform, aby wytworzyć film lipidowy. Następnie dodaj PBS do probówki, aby uzyskać końcowe stężenie fosfolipidów 20 milimolów.

Podgrzej fosfolipid powyżej temperatury przemiany fazowej ładunku lipidowego, aby ponownie uwodnić film lipidowy i wirować, aż roztwór stanie się mętny. Następnie dodaj ładunek lipidów fosfonowych, aby wytworzyć 20-krotny molowy nadmiar ligandów w stosunku do Bla g 1 w oparciu o przewidywaną wydajność. Może powstać środek strącający.

Wirować do wymieszania przed wyżarzaniem białka, jak pokazano. Aby potwierdzić usunięcie lub załadunek ładunku za pomocą NMR fosforu-31, należy użyć filtra odśrodkowego w celu zagęszczenia próbki do temperatury większej niż 100 mikromolów, jak pokazano. Przygotować referencyjne próbki fosfolipidów o znanych stężeniach w buforze PBS, jak wskazano, i rozcieńczyć końcowe odniesienie Bla g 1 w stosunku 1:1 buforem cholanowym do całkowitej objętości około 600 mikrolitrów.

Za pomocą sondy szerokopasmowej uzyskać jednowymiarowe, 31-fosforowe widma NMR zestawianych solubilizowanych próbek Bla g 1 i wzorców referencyjnych fosfolipidów oraz porównać widma NMR fosforu Bla g 1 31 z widmami uzyskanymi dla referencyjnych próbek fosfolipidów w celu potwierdzenia usunięcia endogennie związanych ligandów i/lub wiązania pożądanych ligandów w oparciu o przesunięcia chemiczne widocznych pików, następnie porównać natężenie piku widma Bla g 1 z intensywnością referencyjnych wzorców fosfolipidów, aby umożliwić potwierdzenie pełnej stechiometrii wiązania. Za pomocą chromatografii powinowactwa rekombinowany GST Bla g 1 można łatwo wyizolować do wysokiego poziomu czystości, uzyskując wydajność od dwóch do czterech miligramów na litr hodowli komórkowej. Nocna inkubacja z proteazą TEV w temperaturze czterech stopni Celsjusza jest wystarczająca do usunięcia znacznika GST, uzyskując produkt końcowy o temperaturze około 24 kilodaltonów.

Zastosowanie Bla g 1 do kolumny C18 z odwróconą fazą daje charakterystyczny profil elucji, z dwoma dużymi pikami przy 50% buforze B i drugim dużym pikiem przy 75% buforze B. Widma NMR fosforu-31 Apo-Bla g 1 nie wykazują wykrywalnych fosfolipidów. Krzywą wzorcową można wytworzyć z NMR przy użyciu próbek referencyjnych o znanych stężeniach DSPC. Porównanie intensywności sygnału fosforu 31 uzyskanej z DSPC Bla g 1 z tą krzywą standardową można wykorzystać do uzyskania stechiometrii wiązania lipidów na białko.

Widma dichroizmu kołowego dla Bla g 1 obciążonego Apo i lipidami wykazują minima 220 i 210 nanometrów, co wskazuje na strukturę z przewagą alfa-helisy. Testy denaturacji termicznej oparte na dichroizmie kołowym wykazują również kooperatywną utratę struktury drugorzędowej alfa-helisy, co wskazuje na pofałdowaną domenę kulistą. Ponadto analiza wynikowych temperatur topnienia ujawnia znaczny wzrost po związaniu liganda nMix, zgodny z Bla g 1 uzyskanym z jego naturalnego źródła alergenu.

Sukces tego protokołu opiera się na zdolności do przezwyciężenia zarówno ograniczonej rozpuszczalności hydrofobowych ligandów, jak i niedostępnej natury wnęki wiążącej Bla g 1. Procedura ta stanowi podstawę do badań immunologicznych, takich jak testy proliferacji limfocytów T, w celu oceny wpływu ligandów lipidowych na uczulenie i mechanizmy molekularne, dzięki którym to zachodzi. Łącząc tę procedurę z dalszymi testami biofizycznymi, wykazaliśmy, że wiązanie hydrofobowych ligandów zwiększa stabilność Bla g 1, z potencjalnymi konsekwencjami dla generowania epitopów i alergenności.