Name: Usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę usuwania i zastępowania endogennych ligandów w alergenach związanych z lipidami przy użyciu odwróconej fazy HPLC i wygrzewania termicznego. Technika ta umożliwia badanie struktury alergenów i ich immunogenności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Tomowi Kirby'emu, Scottowi Gabelowi i Dr. Robertowi Londonowi za ich pomoc i wsparcie podczas tej pracy, a także Dr. Bobowi Petrovichowi i Lori Edwards za użycie ich oprzyrządowania i pomoc w generowaniu konstruktów Bla g 1 użytych w tym badaniu. Dziękujemy Andrei Adams za pomoc w spektrometrii mas i dr Eugene'owi DeRose za pomoc w oprzyrządowaniu NMR. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym.

1. Klonowanie Bla g 1
<ol>
	<li>Otrzymaj gen dla alergenu karalucha Bla g 1.0101 (reszty 34-216), reprezentujący pojedyncze powtórzenie domeny MA. Dla uproszczenia, Bla g 1 będzie używane w całej pracy do reprezentowania tego pojedynczego powtórzenia, a nie całego transkrypcji Bla g 1.0101.</li>
	<li>Subklonuj gen Bla g 1 do pożądanego wektora. W tym badaniu gen zawierający N-końcowy znacznik S-transferazy glutationowej (GST) sprzężony z miejscem cięcia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) został wstawiony do wektora pGEX w celu ekspresji, jak opisano wcześniej11.</li>
	<li>Przekształć wektor Bla g 1 pGEX w komórki BL21 DE3 E. coli.
	<ol>
		<li>Przygotuj zapas 10 ng/μl żądanego wektora.</li>
		<li>Połącz 1 μl 10 ng/μl DNA z 50 μl komórek BL21 DE3 zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę BL21 DE3-DNA przez 30 minut na lodzie. Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 1 minutę, a następnie natychmiast przenieść z powrotem na lód na dodatkowy 1 minutę inkubacji.</li>
		<li>Dodać 200 μl pożywki LB do komórek i inkubować przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Ułożyć przekształcone komórki na płytkach LB-Agar zawierających 100 mg/l ampicyliny i hodować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Początkowe wyrażenie i oczyszczenie
<ol>
	<li>Zaszczepić 1 l pożywki LB zawierającej 100 mg/l ampicyliny pojedynczą kolonią komórek BL21 DE3 przekształconych za pomocą wektora Bla g 1, jak opisano w ppkt 1.3. Rośnie w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia zebrać komórki (OD600 ~ 1,5) przez wirowanie przy 6,000 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w 2 L pożywki 2x YT zawierającej 100 mg/L ampicyliny. Pozostawić komórki do wzrostu przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze 37 °C do OD600 > 0,6.</li>
	<li>Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie 0,5 mM IPTG. Przenieść komórki do temperatury 18 °C i inkubować przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia pobrać komórki zgodnie z opisem w ppkt 2.2. Otrzymany osad komórkowy można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad otrzymany z 1 l kultury w 50 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) zawierającego 1 tabletkę inhibitora proteazy (lub równoważną) i 1 μl nukleazy benzonazy.</li>
	<li>Lizuj ogniwa za pomocą sonografa sonicznego z sondą (500 W, 20 kHz) ustawionego na 30–50% mocy przez 4 minuty z 50% cyklem pracy. Utrzymuj lizat w łaźni lodowej podczas sonikacji</li>
	<li>Odwirować lizat przy 45 000 x g przez 20 minut. Wyrzucić nierozpuszczalną frakcję (osad).
	<ol>
		<li>Usuń 28 μl rozpuszczalnego białka. Połącz z 7 μL 5-krotnego bufora SDS-PAGE i przechowuj do analizy SDS-PAGE. Powtórz ten krok dla frakcji przepływowych, płuczących i elucyjnych kolumny GST przed i po inkubacji z TEV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić rozpuszczalne białka (supernatant) w kolumnie z żywicą glutationową (~10 ml całkowitej objętości złoża) w równowadze PBS pH 7,4.</li>
	<li>Wypłukać wszelkie niezwiązane białka za pomocą 50 ml PBS.</li>
	<li>Elute GST-Bla g 1 przy użyciu 50 ml PBS zawierającego 10 mM zredukowanego glutationu.</li>
	<li>Inkubować eluowane białko z proteazą TEV o stężeniu 0,2 kU przez noc w temperaturze 4 °C lub pokojowej przez 6 godzin w celu usunięcia znacznika GST.</li>
</ol>
3. Endogenne usuwanie lipidów za pomocą HPLC z odwróconą fazą
<ol>
	<li>Zebrać rozszczepiony Bla g 1 i zagęścić go do ~2 ml za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego z odciętą masą cząsteczkową <10 kDa.
	<ol>
		<li>Dodać próbkę o objętości <12 ml do górnej części koncentratora i wirować z prędkością 5 000 x g przez 10–15 minut w wirniku obrotowym. 
		UWAGA: Objętość próbki i prędkość wirowania będą się różnić w zależności od konkretnego filtra i typu zastosowanego wirnika. Przed użyciem zapoznaj się z dokumentacją producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadować koncentrat do systemu HPLC o wymiarach 250 x 10 mm wyposażonego w kolumnę chromatografii odwróconych faz C18 zrównoważoną 97% buforem A (woda, 0,1% kwas trifluorooctowy) i 3% buforem B (acetonitryl, 0,1% kwas trifluorooctowy). 
	UWAGA: Można stosować mniejsze kolumny, ale może być konieczne ładowanie i elucja białka przy użyciu wielu cykli, aby dostosować się do zmniejszonej zdolności wiązania. Przy wyborze kolumny należy upewnić się, że kulki żywicy mają wielkość cząstek < 5 μm i wielkość porów >200 A, aby umożliwić skuteczne oddzielenie cząsteczek wielkości białka 
	UWAGA: Kwas trifluorooctowy jest silnie i powinien być dozowany w wyciągu przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (tj. rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów). Acetonitryl jest zarówno umiarkowanie toksyczny, lotny, jak i wysoce łatwopalny, powinien być używany i dozowany w okapie przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (tj. rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów).</li>
	<li>Elute Bla g 1 przy użyciu protokołu przedstawionego w tabeli 1 przy natężeniu przepływu 1,5–4,0 ml/min. Monitorować proces elucji za pomocą absorbancji fluorescencji przy 280 nm.
	<ol>
		<li>Zbierz i zbierz Bla g 1 frakcje. Bla g 1 zwykle wymywa się w >74% buforze B, czyli ~34–40 min. 
		UWAGA: Czas elucji będzie się nieznacznie różnił w zależności od natężenia przepływu lub wielkości kolumny. Zbieraj ułamki na podstawie A>280, aby uzyskać najlepsze wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>Bufor A (%)</td>
			<td>Bufor B (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>97 Rozdział 97</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>97 Rozdział 97</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>35</td> Rozdział
			<td>65</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>55</td> Rozdział
			<td>5</td>
			<td>95 Rozdział 95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65</td> Rozdział
			<td>5</td>
			<td>95 Rozdział 95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70</td> Rozdział
			<td>97 Rozdział 97</td>
			<td>3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Protokół elucji dla Bla g 1. Tabela ilustrująca gradient elucji zastosowany w izolacji Bla g 1 przy użyciu kolumny HPLC C18.
<ol start="4">
	<li>Porcjować próbkę do szklanych probówek, nie wypełniając żadnej probówki więcej niż do połowy (~ 4 ml). Przykryj rurki folią parafinową i przedziurawij pokrycie dwoma otworami, aby umożliwić wentylację.
	<ol>
		<li>Przygotować oddzielną porcję o objętości 1 ml (podwielokrotność testowaną). Zostanie to wykorzystane do określenia oczekiwanej wydajności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażać próbki i badać podwielokrotność, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 1 godzinę lub zanurzając w ciekłym azocie. W przypadku tego ostatniego probówka musi być obracana w sposób ciągły, aby uniknąć pęknięcia probówki z powodu rozszerzania się fazy ciekłej po zamrożeniu.</li>
	<li>Wysuszyć powstałe zdelipidowane próbki białek za pomocą liofilizatora. Suszone białko może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy w szczelnie zamkniętym pojemniku.</li>
</ol>
4. Odtworzenie Apo i załadowanych ładunkiem Bla g 1
<ol>
	<li>Określ przewidywany plon Bla g 1.
	<ol>
		<li>Zawiesić liofilizowaną, zdelipidowaną (po HPLC) porcję testową w 5 ml buforu do ponownego fałdowania (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).</li>
		<li>Podgrzać mieszaninę w łaźni wodnej (500 ml zlewki z 250 ml wody i mieszać batonik na płycie grzejnej) do temperatury 95 °C. Roztwory wirować z przerwami i inkubować w temperaturze 95 °C przez 0,5–1 godzinę.</li>
		<li>Usuń ogień i powoli pozwól, aby łaźnia wodna wyrównała się do temperatury pokojowej (~1 h). W razie potrzeby wyżarzone białko można przechowywać w tej postaci przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przepuścić wyżarzoną mieszaninę 1-lipidów Bla g przez filtr strzykawkowy 0,22 μM w celu usunięcia cząstek stałych.</li>
		<li>Bufor wymienia przefiltrowane białko 3x na PBS pH 7,4 za pomocą filtra odśrodkowego z odcięciem 10 kDa, jak omówiono w ppkt 3.1 w celu usunięcia pozostałości wolnych kwasów tłuszczowych i rozpuszczalnika organicznego.</li>
		<li>Oceń stężenie białka za pomocą testu BCA lub innej preferowanej metody, takiej jak absorbancja UV. Na tej podstawie można określić przewidywany plon dla pozostałych podwielokrotności Bla g 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odtworzenie Bla g g 1 załadowanego apo lub ładunkiem
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić podwielokrotności Bla g 1 w buforze ponownego składania, jak opisano w 4.1.1.</li>
		<li>Aby wyprodukować Apo-Bla g 1, powtórz kroki 4.1.2–4.1.6, aby uzyskać pożądany plon.</li>
		<li>Aby załadować Bla g 1 kwasami tłuszczowymi, przygotuj 20 mM roztworów podstawowych żądanego ładunku kwasów tłuszczowych w metanolu lub DMSO. Następnie przejdź do kroku 4.2.5.</li>
		<li>Aby załadować Bla g 1 fosfolipidami, należy przygotować zapas 10 mg/ml żądanego ładunku w chloroformie w szklanej probówce.
		<ol>
			<li>Odparować chloroform, aby wytworzyć film lipidowy. Dodaj PBS do probówki, aby uzyskać końcowe stężenie fosfolipidów 20 mM. 
			UWAGA: Chloroform jest szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia. Stosować w dygestorium chemicznym lub stosować respirator, jeśli dostępna jest nieodpowiednia wentylacja. Podczas obsługi należy używać rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów. Przed użyciem skonsultuj się z kartą charakterystyki.</li>
			<li>Uwodnić film lipidowy, podgrzewając go powyżej temperatury przemiany fazowej ładunku lipidowego i wirując, aż roztwór stanie się mętny. Należy pamiętać, że sonikacja może być wymagana do pełnego zawieszenia i ponownego nawodnienia niektórych ładunków.</li>
			<li>Jeśli wymagana jest sonikacja, umieść probówkę w soniku kąpielowym (100 W, 42 kHz) i poddaj sonifikacji z maksymalną mocą, aż ładunek zostanie ponownie zawieszony. Alternatywnie, sonikator sondy (opisany w 2.6) może być używany z mocą 10-20% i 50% cyklem pracy. 
			UWAGA: Sonikacja wykorzystuje fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości, które mogą uszkodzić słuch. Stosować środki ochrony indywidualnej tłumiące hałas (zatyczki do uszu lub tłumiki). Jeśli to możliwe, umieść sonikator w obudowie lub komorze tłumiącej dźwięk.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać pożądany ładunek kwasów tłuszczowych lub fosfolipidów, aby uzyskać 20-krotny molowy nadmiar ligandów w stosunku do Bla g 1 w oparciu o przewidywaną wydajność określoną w ppkt 4.1. Całkowita objętość rozpuszczalnika organicznego dodanego na tym etapie nie powinna przekraczać 2%. Wir do mieszania. 
		UWAGA: 1 l komórek Bl 21 DE3 zwykle daje ~ 0,25–0,4 nmol białka, co odpowiada ~ 400 μM ligandowi na probówkę.</li>
		<li>Wyżarzać białko zgodnie z opisem w ppkt 4.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Potwierdzenie usunięcia/załadunku fosfolipidów za pomocą 31P-NMR
<ol>
	<li>Zagęścić próbki Bla g g 1 do >100 μM załadowanych Apo lub ładunkiem, używając odśrodkowego zespołu filtrującego, jak opisano w ppkt 3.1.</li>
	<li>Ponownie uwodnić fosfolipid odniesienia w buforze PBS do końcowych stężeń 2, 1,5, 1, 0,5 i 0,25 mM.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:1 buforem cholanowym (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholate) do całkowitej objętości ~600 μL. 
	UWAGA: Cholate jest stosowany na tym etapie w celu pełnego wyekstrahowania i rozpuszczenia lipidów z hydrofobowej jamy Bla g 1. Gwarantuje to, że środowisko chemiczne otaczające grupy główne fosfolipidów jest spójne między różnymi próbkami, co pozwala na jego ilościową ocenę przy użyciu 31P-NMR. Stosowanie cholanu można zastąpić chloroformem/metanolem, jak opisano wcześniej15.</li>
	<li>Uzyskaj widma 1D 31P-NMR próbek Bla g 1 rozpuszczonych w cholanach i wzorców fosfolipidów odniesienia za pomocą sondy szerokopasmowej. 
	UWAGA: Przedstawione w niniejszej pracy widma 31P-NMR uzyskano przy użyciu spektrometru 600 MHz. Jednak wcześniejsze badania wykorzystujące podobne techniki sugerują, że akceptowalną czułość można osiągnąć przy natężeniach pól tak niskich, jak 150-200 MHz15.</li>
	<li>Przetwarzaj wynikowe dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania16.</li>
	<li>Uzyskaj intensywność pików za pomocą preferowanego oprogramowania do przeglądania NMR17.</li>
	<li>Porównaj widma Bla g 1 31P-NMR z widmami uzyskanymi dla próbek referencyjnych fosfolipidów, aby potwierdzić usunięcie endogennie związanych ligandów i/lub wiązanie pożądanych ligandów w oparciu o chemiczne przesunięcia widocznych pików (lub ich brak).
	<ol>
		<li>Potwierdzić pełną stechiometrię wiązania, porównując szczytową intensywność widma Bla g 1 z intensywnością referencyjnych wzorców fosfolipidów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Potwierdzenie złożenia Bla g 1
<ol>
	<li>Przygotować 0,5 μM próbki Bla g 1 w buforze CD (100 mM KH2PO4, pH buforu 7,5). Załadować 2 ml próbki do kuwety CD o średnicy 10 mm z mieszadłem magnetycznym.</li>
	<li>Zmierz widmo CD Bla g 1, aby potwierdzić rekonstrukcję struktury drugorzędowej. Upewnij się, że napięcie fotopowielacza (PMT) nie przekracza zaleceń producenta (zwykle 1 kV).
	<ol>
		<li>Pomiar sygnału CD od 260–200 nm w temperaturze 25 °C z odstępem danych 0,2 nm i szybkością skanowania 20 nm/s z czasem integracji danych wynoszącym 1 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwiększyć temperaturę w kuwecie CD z 25 °C do 95 °C z szybkością 0,5 °C/min. Aktywować mieszadło magnetyczne, aby zapewnić jednolitą temperaturę w całej próbce.</li>
	<li>Płyta CD monitora przy długości fali 222 nm, odczyty co 2 °C.</li>
	<li>Dopasuj wynikowe dane do 2-stanowej krzywej Boltzmana, aby określić temperaturę topnienia. Ze względu na wysoką stabilność Bla g 1, temperatura topnienia (MT25) została zdefiniowana jako temperatura, w której białko straciło 25% swojego początkowego CD przy 222 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li>
<li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li>
<li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li>
<li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li>
<li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556(2019).</li>
<li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li>
<li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1%2C+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily%2C+endorses+allergenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%3A+European+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li>
<li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%3A+European+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li>
<li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+ligands+influence+the+structure%2C+stability%2C+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294(2019).</li>
<li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%3A+European+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li>
<li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li>
<li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+birch+allergen+%2C+Bet+v+1+%2C+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li>
<li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1%3A+identification+of+the+physiological+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li>
<li>Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ligand+binding+of+As-p18%2C+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li>
<li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADP%2FATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin%2C+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li>
<li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li>
<li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+View%3A+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li>
<li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li>
<li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3%2C+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li>
<li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3%2C+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li>
<li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279(2016).</li>
<li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+%2C+and+its+biological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li>
<li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li>
<li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li>
<li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+%28nsLTP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li>
<li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and%2For+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li>
<li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+allergens+more+abundant+and%2For+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%3A+European+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li>
<li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li>
<li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+%28Ber+e1%29+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li>
<li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mal+d+2%2C+the+thaumatin-like+allergen+from+apple%2C+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li>
<li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1%2C+actinidin%2C+and+Act+d+2%2C+a+thaumatin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+and+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li>
<li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1%2C+the+major+allergen+of+whiff%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+and+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li>
<li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027(2020).</li>
<li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+complexes+in+lipocalins%3A+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+%28n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li>
<li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li>
<li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół opisany w tej pracy został z powodzeniem zastosowany do systematycznego badania właściwości wiązania lipidów przez Bla g 1. Ujawniło to korelację między wiązaniem ładunku, termostabilnością i przetwarzaniem endosomalnym, z których to ostatnie było skorelowane ze spadkiem wytwarzania znanego epitopu komórek T z potencjalnymi implikacjami dla immunogenności 9,18. Wykazano, że oprócz Bla g 1 inne alergeny, takie jak Pru p 3 i Bet v 1, zachowują swoje endoge...

Badanie bazy danych alergenów ujawnia, że alergeny występują tylko w 2% wszystkich znanych rodzin białek, co sugeruje, że wspólne właściwości funkcjonalne i biofizyczne przyczyniają się do alergenności1. Spośród tych właściwości, zdolność do wiązania ładunków lipidowych wydaje się być silnie nadreprezentowana wśród alergenów, co sugeruje, że ładunki te mogą wpływać na proces uczulania1. Rzeczywiście, wykazano, że alergen orzechów brazylijskich Ber e 1 wymaga jednoczesnego podawania z jego endogennym lipidem, aby w pełni wykorzystać swój potencjał uczulający2. Lipidy te mogą potencjalnie bezpośrednio stymulować układ odpornościowy, co ilustrują alergeny roztoczy Der p 2 i Der p 7, z których oba mają silną homologię strukturalną z białkami wiążącymi LPS3,4,5. Na podstawie tej obserwacji zaproponowano, że Derp 2 i Der p 7 mogą wiązać lipidy bakteryjne i bezpośrednio stymulować układ odpornościowy gospodarza poprzez sygnalizację za pośrednictwem TLR4, ułatwiając proces uczulania5,6. Możliwe jest również, że endogennie związane lipidy mogą zmieniać właściwości biofizyczne samych białek alergizujących. Na przykład zdolność Sin a 2 (musztarda) i Ara h 1 (orzeszki ziemne) do interakcji z pęcherzykami fosfolipidowymi znacznie zwiększyła ich odporność na degradację żołądkową i endosomalną7, podczas gdy wiązanie ligandu z głównym alergenem pyłku brzozy Bet v 1 zmieniło zarówno szybkość przetwarzania endosomalnego, jak i różnorodność powstałych peptydów8. Jest to szczególnie istotne dla alergenności, biorąc pod uwagę korelację, którą zaobserwowano między stabilnością, wytwarzaniem epitopów limfocytów T i alergennością białek takich jak Bet v 1 i Bla g 1; To ostatnie będzie przedmiotem tej pracy9,10.
Bla g 1 reprezentuje prototypowego członka rodziny białek głównych alergenów (MA) owadów i posiada unikalną strukturę złożoną z 12 amfipatycznych helis alfa, które otaczają nienormalnie dużą hydrofobową jamę9,11. Dostępna struktura krystaliczna promieniowania rentgenowskiego Bla g 1 wykazuje gęstość elektronów w tej jamie zgodną ze związanymi ligandami fosfolipidowymi lub kwasami tłuszczowymi; przypuszczenie potwierdzone przez 31P-NMR i spektrometrię mas. Ładunki te miały niejednorodny charakter, a ich skład był silnie zależny od źródła alergenu, przy czym różne profile lipidowe obserwowano dla rekombinowanego Bla g 1 ulegającego ekspresji w E. coli i P. pastoris. Co ciekawe, Bla g 1 oczyszczony ze swojego naturalnego źródła alergenów (frass karalucha) zawierał głównie kwasy tłuszczowe w miejscu wiązania, a mieszanina palmitynianu, oleinianu i stearynianu została zidentyfikowana jako "naturalne" ligandy9,11. Zdolność Bla g 1 do zatrzymywania lipidów i kwasów tłuszczowych po wielu etapach oczyszczania utrudnia badania białka w izolacji. Z drugiej strony, zasugerowano, że naturalne ligandy palmitynianowe, stearynianu i oleinianu Bla g 1 (odtąd określane jako nMix) odgrywają kluczową rolę zarówno w jego alergenności, jak i natywnej funkcji biologicznej9. Ligandy te nie są jednak obecne w Bla g 1 uzyskanym ze źródeł rekombinowanych, co utrudnia ocenę tej hipotezy. Podobne problemy zaobserwowano w przypadku innych alergenów wiążących lipidy, takich jak Bet v 112,13. Aby ułatwić systematyczne badanie interakcji lipid-alergen, opracowaliśmy protokół, dzięki któremu alergeny mogą być ilościowo pozbawione ich endogennie związanych lipidów i odtworzone w postaci Apo lub naładowane określonymi ligandami.
Alergeny są najczęściej oczyszczane ze swoich naturalnych lub rekombinowanych źródeł za pomocą chromatografii powinowactwa i/lub chromatografii wykluczania wielkości. Tutaj wprowadzamy dodatkowy etap oczyszczania w postaci wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wykorzystującej kolumnę C18 z odwróconą fazą, z której alergen jest eluowany do rozpuszczalnika organicznego, podobnie jak protokoły opracowane dla białek wiążących kwasy tłuszczowe<klasa sup = "xref">14. Otrzymane białko jest następnie poddawane etapowi wyżarzania termicznego pod nieobecność lub w obecności kwasów tłuszczowych i/lub fosfolipidów. Oprócz odzyskiwania natywnego Bla g 1 krotnie, podwyższone temperatury zwiększają rozpuszczalność i dostępność ładunków lipidowych, dając Bla g 1 w formie Apo lub równomiernie naładowaną pożądanym hydrofobowym ligandem. Rozdział 31Oczyszczone w ten sposób widma P-NMR Bla g 1 potwierdziły całkowite usunięcie endogennie związanych ligandów i równomierne zastąpienie ich pożądanymi związkami, natomiast dichroizm kołowy potwierdził pomyślne odzyskanie fałdy Bla g 1. Użyteczność tej metody została podkreślona w niedawnej pracy, w której stwierdzono, że wiązanie ładunku zwiększa termostabilność Bla g 1 i odporność proteolityczną, zmieniając kinetykę generowania epitopów komórek T, co może mieć wpływ na uczulenie i alergenność9.

<table><tbody><tr><td>Bla g 1 Gen&nbsp;</td><td>Genescript</td><td>N/A</td><td>Niestandardowa usługa syntezy genów. Akcesja GenBank nr AF072219 Pozostałości 34-216</td></tr><tr><td>Powinowactwo oczyszczone naturalne Bla g 1 (nBla g 1)</td><td>Biotechnologie wewnętrzne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Na zamówienie</td></tr><tr><td>System HPLC serii Agilent 1100</td> Detektor, <td>pompa i odgazowywacz UV</td><td>Agilent</td><td>G1315B, G1311A, G1322A</td></tr><tr><td>Spektrometr Agilent DD2 600 MHz</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 Amicon</td><td></td><td>UFC-1008</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Szerokopasmowa sonda gradientowa 5 mm</td><td>Varian</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ChemStation dla LC (oprogramowanie)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Distearoylfosfatydylocholina (18:0 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365C</td><td></td></tr><tr><td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7750000</td><td></td></tr><tr><td>Żywica glutationowa</td><td>Genescript</td><td>L00206</td><td></td></tr><tr><td>Glutation, zredukowany</td><td>Fisher Scientific BP25211</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>Jasco&nbsp; Spektropolarymetr CD</td><td>Jasco</td><td>J-815</td><td></td></tr><tr><td>Millex Filtr strzykawkowy</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>NMRPipe (oprogramowanie)</td><td>Delaglio i wsp.&nbsp;</td><td>N/a</td><td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - wielowymiarowy system przetwarzania spektralnego oparty na rurach uniksowych. J. Biomol. NMR 6, 277&ndash; 293 (1995).</td></tr><tr><td>NMRViewJ (Oprogramowanie)</td><td>Johnson i wsp.&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Johnsona, B. A. & Blevins, RA. Widok NMR: Program komputerowy do wizualizacji i analizy danych NMR. J. Biomol. NMR 4, 603&ndash; 614 (1994).</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Test białka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Polaris 5 C18-A 250x10,0 mm Kolumna HPLC</td><td>Agilent</td><td>SKU: A2000250X100</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa SD-200</td><td>Varian</td><td>VP-195</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat cholanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>Palmitynian</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>P9767</td><td></td></tr><tr><td>Stearynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3381</td><td></td></tr><tr><td>VnmrJ (oprogramowanie)</td><td>Varian</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Wiele głównych alergenów wiąże się z hydrofobowymi cząsteczkami podobnymi do lipidów, w tym Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 i Fel d 1. Ligandy te są silnie zatrzymywane i mogą wpływać na proces uczulenia poprzez bezpośrednią stymulację układu odpornościowego lub zmianę właściwości biofizycznych białka alergizującego. W celu kontrolowania tych zmiennych wymagane są techniki usuwania endogennie związanych ligandów i, jeśli to konieczne, zastępowania lipidami o znanym składzie. Alergen karalucha Bla g 1 otacza dużą hydrofobową jamę, która po oczyszczeniu przy użyciu tradycyjnych technik wiąże niejednorodną mieszaninę endogennych lipidów. W tym miejscu opisujemy metodę, za pomocą której te lipidy są usuwane za pomocą HPLC z odwróconą fazą, a następnie wyżarzania termicznego w celu uzyskania Bla g 1 w postaci Apo lub ponownie załadowanej zdefiniowaną przez użytkownika mieszaniną kwasów tłuszczowych lub fosfolipidów. Sprzężenie tego protokołu z testami biochemicznymi ujawnia, że ładunki kwasów tłuszczowych znacząco zmieniają termostabilność i odporność proteolityczną Bla g 1, co ma dalsze implikacje dla szybkości wytwarzania epitopów komórek T i alergenności. Wyniki te podkreślają znaczenie protokołów usuwania/przeładowywania lipidów, takich jak ten opisany w niniejszym dokumencie, podczas badania alergenów pochodzących zarówno ze źródeł rekombinowanych, jak i naturalnych. Protokół można uogólnić na inne rodziny alergenów, w tym lipokaliny (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) i Uteroglobinę (Fel d 1), zapewniając cenne narzędzie do badania roli lipidów w odpowiedzi alergicznej.

을 Wykorzystując chromatografię powinowactwa, rekombinowany GST-Bla g 1 został łatwo wyizolowany z wysokim stopniem czystości (Rysunek 1A), dając wydajność na poziomie ~2–4 mg/L hodowli komórkowej. Inkubacja przez noc z proteazą TEV w temperaturze 4 ˚C jest wystarczająca do usunięcia znacznika GST, co pozwala uzyskać produkt końcowy o masie ~24 kDa. Należy zauważyć, że w tym przypadku w frakcjach przepływowych i płukanych znajduje się znaczna ilość GST-Bla g 1, co sugeruje przekroczenie pojemności wiązani...

Ten protokół opisuje usuwanie endogennych lipidów z alergenów i zastępowanie ich określonymi przez użytkownika ligandami poprzez HPLC z odwróconą fazą w połączeniu z wyżarzaniem termicznym. Rozdział 31P-NMR i dichroizm kołowy pozwalają na szybkie potwierdzenie usunięcia/obciążenia liganda i odzyskanie natywnej struktury alergenu.

Usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Wiele alergenów wiąże cząsteczki hydrofobowe. Protokół ten umożliwia całkowite usunięcie i zastąpienie tych ligandów, co pozwala nam na systematyczne badanie ich wpływu na strukturę i immunogenność. Zastosowanie HPLC z odwróconymi fazami, w połączeniu z wyżarzaniem termicznym, ma dwie zalety.Usuwa endogenne ligandy i pomaga rozpuszczać ligandy, aby otworzyć niedostępne w inny sposób miejsca wiązania. Jeśli uda nam się określić czynniki, które przyczyniają się do alergenności, być może będziemy w stanie zaprojektować terapie, które unikają tych czynników. Wiele białek wiąże ligandy lipidowe, które są silnie zatrzymywane i mogą wpływać zarówno na strukturę, jak i funkcję.Nasza metoda pozwala na systematyczne badanie tych interakcji. Ograniczona rozpuszczalność i dostępność wielu ładunków lipidowych może hamować proces ładowania. Pamiętaj, aby zachować ostrożność podczas przygotowywania tych ligandów i wziąć pod uwagę potrzebę adaptacji specyficznych dla systemu.Ponieważ praca z hydrofobowymi i nierozpuszczalnymi ligandami jest dostosowaniem dla niektórych alergologów i biochemików, przydatne może być sprawdzenie, jak próbki wyglądają na różnych etapach. Po sklonowaniu, wyrażeniu i oczyszczeniu, nanieść 12 mililitrów rozszczepionego Bla g 1 na odśrodkową jednostkę filtrującą o granicy masy cząsteczkowej mniejszej niż 10 kilodaltonów w celu wielokrotnego wirowania w wirniku kubełkowym wahadłowym, aż całkowita objętość zostanie zmniejszona do mniej niż dwóch mililitrów. Załadować otrzymany koncentrat do systemu HPLC o wymiarach 250 na 10 milimetrów wyposażonego w kolumnę chromatograficzną C18 z odwróconymi fazami, zrównoważoną 97% buforem A i 3% buforem B.Elute Bla g 1 przy natężeniu przepływu 1,5 do 4 mililitrów na minutę, jak wskazano w tabeli, wykorzystując absorbancję fluorescencji przy 280 nanometrach do monitorowania procesu elucji.Zaczynając od około 34 do 40 minut i stężenia buforu B powyżej 74%, zbierz nie więcej niż cztery mililitry każdej frakcji Bla g 1. Podwielokrotność połączonej frakcji Bla g 1 rozmieścić w szklanych probówkach. Przykryj rurki folią parafinową i przedziurawij folię dwoma otworami.Następnie zamroź próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę i użyj liofilizatora do wysuszenia powstałych odlipidowanych próbek białka. Aby określić przewidywaną wydajność Bla g 1, ponownie zawiesić liofilizowaną odlipidowaną podwielokrotność testową w pięciu mililitrach buforu do ponownego fałdowania. Podgrzej mieszaninę w 500-mililitrowej zlewce zawierającej 250 mililitrów wody do 95 stopni Celsjusza na gorącej płycie z mieszaniem i przerywanym wirowaniem.Trzymaj roztwór w temperaturze 95 stopni przez 30 do 60 minut, a następnie pozwól łaźni wodnej powoli wyrównać się do temperatury pokojowej. Gdy roztwór ostygnie, przepuść wyżarzoną mieszaninę lipidów Bla g 1 przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona w celu usunięcia cząstek stałych i użyj nowego filtra odśrodkowego z odcięciem 10 kilodaltonów do buforowej wymiany przefiltrowanego białka trzykrotnie na PBS w celu usunięcia wszelkich pozostałości wolnych kwasów tłuszczowych i rozpuszczalnika organicznego. Następnie należy ocenić stężenie białka za pomocą standardowego testu analizy białka w celu określenia przewidywanej wydajności dla pozostałych podwielokrotności Bla g 1.Aby odtworzyć Apo-Bla g 1, należy ponownie zawiesić podwielokrotności Bla g 1 w pięciu mililitrach buforu do ponownego składania na podwielokrotność i wyżarzać próbki, jak pokazano. Aby załadować Bla g 1 fosfolipidami, dodaj 10 miligramów pożądanego ładunku do szklanej probówki i rozpuść w chloroformie, a następnie odparuj chloroform, aby wytworzyć film lipidowy. Następnie dodaj PBS do probówki, aby uzyskać końcowe stężenie fosfolipidów 20 milimolów.Podgrzej fosfolipid powyżej temperatury przemiany fazowej ładunku lipidowego, aby ponownie uwodnić film lipidowy i wirować, aż roztwór stanie się mętny. Następnie dodaj ładunek lipidów fosfonowych, aby wytworzyć 20-krotny molowy nadmiar ligandów w stosunku do Bla g 1 w oparciu o przewidywaną wydajność. Może powstać środek strącający.Wirować do wymieszania przed wyżarzaniem białka, jak pokazano. Aby potwierdzić usunięcie lub załadunek ładunku za pomocą NMR fosforu-31, należy użyć filtra odśrodkowego w celu zagęszczenia próbki do temperatury większej niż 100 mikromolów, jak pokazano. Przygotować referencyjne próbki fosfolipidów o znanych stężeniach w buforze PBS, jak wskazano, i rozcieńczyć końcowe odniesienie Bla g 1 w stosunku 1:1 buforem cholanowym do całkowitej objętości około 600 mikrolitrów.Za pomocą sondy szerokopasmowej uzyskać jednowymiarowe, 31-fosforowe widma NMR zestawianych solubilizowanych próbek Bla g 1 i wzorców referencyjnych fosfolipidów oraz porównać widma NMR fosforu Bla g 1 31 z widmami uzyskanymi dla referencyjnych próbek fosfolipidów w celu potwierdzenia usunięcia endogennie związanych ligandów i/lub wiązania pożądanych ligandów w oparciu o przesunięcia chemiczne widocznych pików, następnie porównać natężenie piku widma Bla g 1 z intensywnością referencyjnych wzorców fosfolipidów, aby umożliwić potwierdzenie pełnej stechiometrii wiązania. Za pomocą chromatografii powinowactwa rekombinowany GST Bla g 1 można łatwo wyizolować do wysokiego poziomu czystości, uzyskując wydajność od dwóch do czterech miligramów na litr hodowli komórkowej. Nocna inkubacja z proteazą TEV w temperaturze czterech stopni Celsjusza jest wystarczająca do usunięcia znacznika GST, uzyskując produkt końcowy o temperaturze około 24 kilodaltonów.Zastosowanie Bla g 1 do kolumny C18 z odwróconą fazą daje charakterystyczny profil elucji, z dwoma dużymi pikami przy 50% buforze B i drugim dużym pikiem przy 75% buforze B. Widma NMR fosforu-31 Apo-Bla g 1 nie wykazują wykrywalnych fosfolipidów. Krzywą wzorcową można wytworzyć z NMR przy użyciu próbek referencyjnych o znanych stężeniach DSPC. Porównanie intensywności sygnału fosforu 31 uzyskanej z DSPC Bla g 1 z tą krzywą standardową można wykorzystać do uzyskania stechiometrii wiązania lipidów na białko.Widma dichroizmu kołowego dla Bla g 1 obciążonego Apo i lipidami wykazują minima 220 i 210 nanometrów, co wskazuje na strukturę z przewagą alfa-helisy. Testy denaturacji termicznej oparte na dichroizmie kołowym wykazują również kooperatywną utratę struktury drugorzędowej alfa-helisy, co wskazuje na pofałdowaną domenę kulistą. Ponadto analiza wynikowych temperatur topnienia ujawnia znaczny wzrost po związaniu liganda nMix, zgodny z Bla g 1 uzyskanym z jego naturalnego źródła alergenu.Sukces tego protokołu opiera się na zdolności do przezwyciężenia zarówno ograniczonej rozpuszczalności hydrofobowych ligandów, jak i niedostępnej natury wnęki wiążącej Bla g 1. Procedura ta stanowi podstawę do badań immunologicznych, takich jak testy proliferacji limfocytów T, w celu oceny wpływu ligandów lipidowych na uczulenie i mechanizmy molekularne, dzięki którym to zachodzi. Łącząc tę procedurę z dalszymi testami biofizycznymi, wykazaliśmy, że wiązanie hydrofobowych ligandów zwiększa stabilność Bla g 1, z potencjalnymi konsekwencjami dla generowania epitopów i alergenności.

removal-replacement-endogenous-ligands-from-lipid-bound-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej.

Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

W tej metodzie prezentujemy procedury biochemiczne do szybkiej i efektywnej izolacji pośrednich białek filamentowych (IF) z wielu tkanek myszy. Izolowane IFs mogą być wykorzystywane do badania zmian w modyfikacjach potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas i innych testów biochemicznych.

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Skład białkowy ludzkiej zastawki mitralnej jest nadal częściowo nieznany, ponieważ jego analiza jest skomplikowana przez niską komórkowość, a tym samym niską biosyntezę białek. Praca ta zapewnia protokół do efektywnej ekstrakcji białka do analizy proteomu zastawki mitralnej.

Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Poznaj metodę usuwania i zastępowania endogennych ligandów w alergenach związanych z lipidami przy użyciu odwróconej fazy HPLC i wygrzewania termicznego. Technika ta umożliwia badanie struktury alergenów i ich immunogenności.

Usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami

Przeglądaj więcej filmów