Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego
22 stycznia 2021
Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.
Ta nowa metoda hodowli sferoidalnych może być wykorzystana do badania rakotwórczości w celu analizy obecności różnych populacji nowotworowych komórek macierzystych, a także może być dobrze zastosowana do badań przesiewowych o wysokiej wydajności dla nowych leków. Jest to solidny i powtarzalny system hodowlany do generowania dużej liczby sferoid o jednorodnych rozmiarach. Co więcej, sferoidy te mogą być wykorzystywane do badania nowotworowych komórek macierzystych.
Ta metoda jest skonfigurowana do badania biologii przewlekłych nowotworów, ale można ją łatwo skonfigurować do badania innych nowotworów, zmieniając warunki hodowli 3D. Należy uważać, aby w podłożu nie ma pęcherzyków, aby nie przesuwać zbyt mocno płytki podczas tworzenia sferoid i zachować ostrożność podczas zbierania sferoid do sitka. Zacznij od wstępnego potraktowania studzienek 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu na studzienkę.
Po kilku sekundach odwirować płytkę w wirniku z wiadrem wahadłowym i przepłukać każdą studzienkę 2 mililitrami ciepłego podłoża podstawowego. Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że pęcherzyki zostały całkowicie usunięte z mikrostudzienek. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych pęcherzyków, ponownie przepłucz studzienki przed dodaniem jednego mililitra ciepłego podłoża z matrycą membrany podstawnej DMEM do każdej studzienki.
Aby indukować tworzenie się sferoidów, zobacz pożądane stężenie komórek Caco-2 w monowarstwie 2D w 10-centymetrowej naczyniu w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% antybiotykami. Do hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze. Po osiągnięciu 80% konfluencji umyj komórki pięcioma mililitrami PBS, a następnie potraktuj kulturę dwoma mililitrami trypsyny-EDTA przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj trypsynę czterema mililitrami kompletnego DMEM. Po zliczeniu zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić paletę w odpowiedniej objętości pożywki z matrycą błony podstawnej DMEM, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek w jednym mililitrze pożywki na studzienkę. Dodaj jeden mililitr komórek do każdej studzienki przedpłaconej 24-dołkowej płytki, a następnie dodaj jeden mililitr pożywki z matrycą błony podstawnej DMEM do każdej studzienki.
Po wysianiu natychmiast odwiruj płytkę i użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone w mikrodołkach. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 48 godzin, nie naruszając komórek. Aby zebrać sferoidy, pod koniec inkubacji, użyj pipety serologicznej i połowy supernatantu w każdym dołku, aby delikatnie usunąć sferoidy z ich mikrodołków.
Gdy wszystkie sferoidy zostaną odłączone, użyj pipety, aby ostrożnie przenieść kultury 3D z każdej studzienki do odwracalnego sitka o średnicy 37 mikronów na 15-mililitrowej stożkowej probówce. Umyj każdą studzienkę trzy razy jednym mililitrem wstępnie podgrzanej pożywki podstawowej na pranie, aby zebrać pozostałe sferoidy i dodać te dodatkowe sferoidy do sitka. Po ostatnim myciu sprawdź płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie sferoidy zostały usunięte z mikrostudzienek.
Następnie odwróć sitko na nowej 15-mililitrowej probówce i umyj dno sitka świeżym podłożem z matrycą membrany podstawnej DMEM, aby zebrać sferoidy do probówki. Sferoidy wyrastają z 500 komórek, wykazując najbardziej jednorodny wzrost rozmiaru w czasie. Przy 500 i 600 komórkach na sferoidę określa się optymalną liczbę komórek, w których można osiągnąć dobry wzrost i niską zmienność.
Dodatek macierzy błony podstawnej zwiększa wzrost i jednorodność sferoidów. W hodowli długoterminowej komórki pojawiają się jako gęste, wielowarstwowe warstwy w trzecim dniu. Podczas gdy spłaszczone komórki ułożone w monowarstwy są wyraźnie widoczne w 10 dniu.
Co ciekawe, światło pojawia się w sferoidach od piątego dnia. Ponadto w piątym i siódmym dniu obserwuje się wyraźny wzrost liczby proliferujących komórek dodatnich antygenu jądrowego, który zmniejsza się do 10 dnia. Co zaskakujące, aktywowany Caspace 3 obserwuje się w bardzo niewielu komórkach dopiero w trzecim i piątym dniu.
Podczas gdy wysoki poziom ekspresji beta-kateniny obserwuje się w każdym punkcie czasowym. O potencjale sferoidów do różnicowania się w anterozyty świadczy ich fosfataza alkaliczna i ekspresja mRNA 2A5 z rodziny nośników substancji rozpuszczonych. Ponadto sferoidy te wyrażają typowe markery nowotworowych komórek macierzystych i reagują na chemioterapię skojarzoną rutynowo stosowaną u pacjentów z rakiem jelita grubego.
Tak więc sferoidy składają się z różnych populacji komórek. Następnie można je wykorzystać do analizy specyficznych dla komórek reakcji na bodźce, takie jak refraktory, i ostatecznie do odpowiedzi na leki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia niezawodny system hodowli służący do generowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Metoda ta umożliwia badanie biologii nowotworowych komórek macierzystych oraz ich odpowiedzi na chemioterapię.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie komórek macierzystych nowotworu jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
- Trójwymiarowe (3D) hodowle sferoidów naśladują środowisko guza in vivo.
- Metodę tę można dostosować do różnych typów nowotworów.
- Solidność i powtarzalność są niezbędne dla ważności eksperymentalnej.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnej metody hodowli sferoidów z komórek Caco2.
- Zbadanie tumorigeniczności oraz populacji komórek macierzystych nowotworu.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego screeningu nowych leków.
Zastosowane metody
- Wstępne przygotowanie dołków za pomocą roztworu płuczącego przeciwprzywierającego.
- Ostrożna obsługa w celu uniknięcia powstawania pęcherzyków powietrza podczas formowania sferoidów.
- Zbiór sferoidów przy użyciu sitka.
- Monitorowanie warunków hodowli w celu zapewnienia optymalnego wzrostu.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie sferoidów o jednorodnej wielkości.
- Wykazana przydatność do badania komórek macierzystych nowotworów.
- Potencjał w zastosowaniach dotyczących przesiewania leków.
- Możliwość adaptacji do innych typów nowotworów poprzez modyfikację warunków hodowli.
Wnioski
- Metoda ta dostarcza nowego narzędzia do badań nad rakiem.
- Usprawnia ona zrozumienie dynamiki komórek macierzystych nowotworu.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten system do opracowania terapii.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten trójwymiarowy model sferoidy odpowiada na krytyczną potrzebę stworzenia systemów przedklinicznych, które odzwierciedlają heterogeniczność nowotworu oraz fenotypy komórek macierzystych raka (CSC), umożliwiając bardziej precyzyjną ocenę celów terapeutycznych i odpowiedzi na leki w badaniach nad rakiem jelita grubego. Dzięki zapewnieniu powtarzalnej platformy do długoterminowego wzbogacania populacji CSC i oceny odpowiedzi na chemioterapię, metoda ta wspiera wczesne etapy walidacji celów i identyfikacji wiodących związków z większą pewnością translacyjną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie heterogeniczności CSC oraz ich potencjału nowotworowego poprzez analizę różnicowych wzorców proliferacji i tworzenie struktur przypominających światło wewnątrz sferoidów.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez wzbogacanie populacji CSC wykazujących ekspresję uznanych markerów, co ułatwia merytoryczną weryfikację i ograniczanie ryzyka w hipotezach terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie sferoidów o jednorodnej wielkości z określonej liczby komórek, tworząc standaryzowany system do ilościowej analizy odpowiedzi na leki.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z przepływami pracy w wysokoprzepustowym przesiewaniu dzięki wytrzymałości, powtarzalności oraz łatwości zbioru sferoidów przy użyciu metod opartych na sitach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Demonstracja ekspresji markerów CSC oraz odpowiedzi na klinicznie istotną chemioterapię skojarzoną, co umożliwia przedkliniczne modelowanie oporności i wrażliwości na leczenie.
- Wartość operacyjna: Utrzymanie fenotypów CSC w długoterminowej hodowli, co wspiera podłużne badania nad skutecznością leków i mechanizmami nawrotów nowotworów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w programach onkologicznych skupionych na terapiach skierowanych przeciwko CSC oraz mechanizmach oporności.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie nisz CSC oraz zróżnicowanych odpowiedzi na leki w kontekście 3D.
- Screening: Umożliwia standaryzację testów dzięki tworzeniu jednorodnych pod względem rozmiaru sferoidów, co wspiera wiarygodny screening związków przeciwko populacjom wzbogaconym w CSC.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty poprzez ekspresję markerów CSC, markery proliferacji (PCNA) oraz markery apoptozy (aktywowana kaspaza-3) w celu porównania warunków terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie odpowiedzi na chemioterapię w systemie istotnym dla choroby, który odzwierciedla heterogeniczność gruczolakoraka jelita grubego.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do innych typów nowotworów poprzez modyfikację warunków hodowli 3D, co pozycjonuje tę metodę jako platformę wielokrotnego użytku w programach odkrywania leków onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez uwzględnienie heterogeniczności guza napędzanej przez CSC oraz funkcjonalnych właściwości macierzystości, które nie występują w modelach 2D.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzowanemu wysiewowi, wstępnej obróbce przeciwadhezyjnej oraz zbiorowi za pomocą sitka, co redukuje zmienność w generowaniu sferoidów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnej oceny związków ukierunkowanych na CSC oraz mechanizmów oporności, co zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków wiodących z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane dotyczące modulacji CSC i odpowiedzi na chemioterapię w fizjologicznie istotnym modelu.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w technikach 3D hodowli komórkowych, w tym w traktowaniu powierzchni antyadhezyjnymi oraz ostrożnym obchodzeniu się z próbkami, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas inicjacji sferoidów.
- Metoda zależy od dostępu do macierzy błony podstawnej (np. Matrigel) oraz standardowego sprzętu do hodowli komórkowych, w tym wirówek, sit (37 mikronów) oraz mikroskopów odwróconych do monitorowania procesu.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja gęstości wysiewu (500–600 komórek/sferoid) oraz czasu inkubacji, aby zapewnić homogeniczność i powtarzalność wyników w różnych eksperymentach.
- Adaptacja do innych typów nowotworów wymaga optymalizacji stężenia macierzy błony podstawnej oraz czasu hodowli w oparciu o swoistą dla danej linii komórkowej adhezję i kinetykę tworzenia sferoidów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność delikatnego obchodzenia się z próbkami podczas zbioru, aby uniknąć rozpadu sferoidów, oraz potencjalną zmienność czasu formowania się światła (lumen) między poszczególnymi partiami.
