Szybkie oznaczanie powinowactwa przeciwciało-antygen za pomocą fotometrii masowej

Przeciwciała są rutynowo stosowane w technikach laboratoryjnych, a ich zastosowania terapeutyczne i diagnostyczne szybko się rozszerzają. Szybka i dokładna charakterystyka wiązania antygen-przeciwciało jest niezwykle ważna dla tych zastosowań. Fotometria masowa szybko mierzy powinowactwo wiązania przy użyciu bardzo małych ilości materiału.

Nie jest wymagane znakowanie ani immobilizacja, a informacje na temat oligomeryzacji i czystości białek można uzyskać z tego samego eksperymentu. Protokół ten może być stosowany nie tylko do badania przeciwciał, ale także do pomiaru silnych wiązań białko-białko dla białek o masie cząsteczkowej większej niż 50 kilodaltonów. Zacznij od użycia kleszczyków z miękką końcówką i butelek do mycia, aby sekwencyjnie spłukać szkiełka nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów od góry do dołu wodą destylowaną, etanolem, wodą destylowaną, izopropanolem i wodą destylowaną.

Po ostatnim praniu osusz szkiełka nakrywkowe strumieniem czystego azotu w tym samym kierunku, aby uniknąć przenoszenia zanieczyszczeń z kleszczy. Szkiełka nakrywkowe o wymiarach 24 na 24 milimetry przepłukać wodą destylowaną i etanolem, jak pokazano, a następnie wysuszyć strumieniem czystego azotu. Po wyschnięciu umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 24 milimetry na kawałku folii aluminiowej i umieść paski taśmy dwustronnej na szkiełku nakrywkowym.

Następnie wytnij z folii szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 24 milimetry i delikatnie dociśnij folię do strony roboczej szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 50 milimetrów. Aby przygotować próbki przeciwciała-antygenu do pomiarów powinowactwa, przefiltruj co najmniej dwa mililitry PBS przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona w celu usunięcia cząstek kurzu i agregatów, a następnie odwiruj interesujące nas zapasy przeciwciał i antygenów. Zmierzyć absorbancję promieniowania UV o długości fali 280 nanometrów w przeciwciałach i antygenach w celu określenia ich rzeczywistych stężeń i przygotować serię miareczkowania mieszanin przeciwciało-antygen w odpowiednim zakresie stężeń antygenu w końcowej objętości 50 mikrolitrów na próbkę.

Następnie inkubować mieszaniny antygen-przeciwciało przez około 10 minut w temperaturze pokojowej, aby reakcja wiązania osiągnęła równowagę chemiczną. Aby ocenić powinowactwo przeciwciało-antygen za pomocą fotometrii masowej, nałóż kroplę mikroskopowego olejku immersyjnego na obiektyw instrumentu i umieść komorę przepływową na stoliku mikroskopu. Dodaj 10 mikrolitrów przefiltrowanego PBS do jednego końca kanału komory przepływowej.

Bufor wejdzie do kanału przez działanie kapilarne. Na karcie kontroli ostrości w oprogramowaniu do zbierania danych użyj przycisków ruchu zgrubnego stage w górę iw dół, aby dokonać początkowych regulacji i kliknij ostrość, aby view odczyt sygnału ostrości. Użyj przycisków precyzyjnej regulacji w górę i w dół, aby zmaksymalizować wartość ostrości, a następnie kliknij ustaw ostrość i zablokuj ostrość, aby aktywować funkcję śledzenia ostrości.

Obraz czystego szkiełka powinien mieć wartość sygnału równą lub mniejszą niż 0,05%Załaduj 20 mikrolitrów pierwszej próbki przeciwciała-antygenu, jak pokazano, osuszając płyn z drugiego końca małym kawałkiem bibuły. Natychmiast po załadowaniu kliknij przycisk Nagraj, aby uzyskać odpowiednią liczbę klatek odpowiadającą 100 sekundom danych. Pod koniec okresu zbierania danych wprowadź nazwę pliku danych i kliknij przycisk OK, a następnie wybierz próbkę, aby zapisać plik.

Aby przeanalizować dane fotometrii masowej, otwórz interesujący Cię plik i kliknij przycisk Analizuj. Kliknij przycisk Załaduj, aby załadować funkcję kalibracji, a następnie kliknij plik i zapisz wyniki, aby zapisać analizowane dane. Aby uzyskać względne stężenia każdego gatunku w próbce, należy otworzyć dopasowane zdarzenia.

csv, skopiuj dane z kolumny M do odpowiedniego oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy, a następnie użyj funkcji histogramu statystyk wykresu, aby wykreślić rozkład masy cząsteczkowej. Kliknij dwukrotnie histogram, aby otworzyć okno właściwości wykresu, wyłącz automatyczne kategoryzowanie i wybierz rozmiar pojemnika 2,5 kilodaltonów. Aby utworzyć dane wyśrodkowań pojemników i inwentaryzacji, kliknij przycisk Zastosuj i przejdź.

Aby dopasować histogram do funkcji Gaussa, wybierz kolumny wyśrodkowania przedziału i zliczania, a następnie kliknij funkcję menu pików analizy i dopasowania wielu pików linii bazowej. Kliknij dwukrotnie, aby wskazać przybliżone pozycje pików na wykresie rozkładu, a następnie kliknij przycisk Otwórz dopasowanie NL. Zaznacz stałe pola wyboru dla centrów pików XC i ustaw ich wartości na oczekiwane masy cząsteczkowe wolnego przeciwciała oraz pojedynczych i podwójnych kompleksów antygen-przeciwciało.

Zaznacz opcję udostępniania dla parametrów szerokości i kliknij przycisk Dopasuj. Dopasowane wartości wysokości pików składowych Gaussa reprezentują względne stężenie każdego gatunku w próbce. Następnie użyj równania, aby obliczyć ułamek stężenia każdego gatunku na podstawie wartości wysokości piku.

Aby obliczyć stałe równowagi za pomocą arkusza kalkulacyjnego, otwórz arkusz dissociationconstantcalculation. xlsx. W tym arkuszu wyróżnione na żółto wartości komórek w wierszach od 1 do 10 można zmodyfikować w celu wykonania obliczeń stałej równowagi.

Wprowadź szacowane wartości stałej dysocjacji w jednostkach nanomolowych do komórek B1 i B2. Jeśli szacowane wartości stałej dysocjacji nie są znane, pozostaw wartości domyślne w komórkach B1 i B2 bez zmian. Wprowadź całkowite stężenie przeciwciał i całkowitego stężenia antygenu w jednostkach nanomolowych do komórek D2 i E2 i wprowadź obliczone wartości frakcji dla każdego gatunku do komórek F2, G2 i H2. Wykonując globalną analizę miareczkowania, dodaj odpowiednie wartości frakcji danych w wierszach od 2 do 10. W oknie parametrów solvera zaznacz komórkę B15 w polu Ustaw cel i komórki od B1 do B2 w polu Zmieniając komórki zmiennej.

Wybierz przycisk min dla opcji do i zaznacz pole wyboru ustaw zmienne nieograniczone jako nieujemne, a następnie wybierz GRG nieliniowe jako metodę rozwiązywania i kliknij rozwiąż. Najlepiej dopasowane wartości stałej dysocjacji zostaną pokazane w komórkach B1 i B2. A końcowa suma kwadratów błędów zostanie pokazana w komórce B15. W tym reprezentatywnym eksperymencie przeprowadzono serię miareczkowania przeciwciałem anty-ludzką trombiną o ustalonym stężeniu 25 nanomolowych i stężeniach ludzkiej alfa-trombiny 0, 7,5, 15, 30, 60 i 120 nanomolowych w celu uzyskania rozkładu masy cząsteczkowej mieszanin antygen-przeciwciało i próbki samej przeciwciała.

Najlepiej dopasowane parametry wysokości pików składowych Gaussa znormalizowano w celu uzyskania frakcji stężeń gatunkowych. Wartości frakcji stężeń zostały następnie dopasowane globalnie, aby uzyskać powinowactwo wiązania antygen-przeciwciało. Następnie można wykreślić eksperymentalne frakcje stężeń i globalne wyniki dopasowania dla wolnego przeciwciała, pojedynczego kompleksu antygen-przeciwciało i podwójnego kompleksu antygenowego.

Aby uzyskać dokładne wartości KD, stężenia białek muszą być starannie dobrane, aby wypełnić wszystkie gatunki reakcji. Zalecamy przygotowanie serii miareczkowania z wykorzystaniem różnych stężeń antygenu. Po dopasowaniu danych można użyć metody projekcji błędu, aby uzyskać błąd dopasowania, ale lepiej jest powtórzyć eksperyment i obliczyć odchylenia standardowe średnich wartości powinowactwa wiązania.