Name: Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę biodrukowania sferoid nabłonkowych piersi na sieciach śródbłonka, tworząc szybko modele 3D do badań przesiewowych leków. Technika umożliwia natychmiastowe użycie w precyzyjnej medycynie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez NIH 1R01HL140239-01 dla AMC. Chcielibyśmy podziękować Centrum Obrazowania Komórkowego Uniwersytetu Drexel.

1. Wzrost komórek nabłonka piersi i pożywka testowa
<ol>
	<li>MCF10A Komórki nabłonka piersi 
	UWAGA: Nienowotworowa, unieśmiertelniona linia komórek nabłonka piersi pochodzi od pacjenta z chorobą włóknisto-torbielowatą43. Komórki nie wyrażają receptora estrogenowego.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 20 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), rozpuść 100 μg liofilizowanego EGF w 500 μl sterylnego dH2O, aby uzyskać 200 μg/ml EGF. Dodać 500 μl 200 μg/ml EGF do 4,5 ml sterylnego 0,1% BSA w dH2O, aby uzyskać roztwór podstawowy EGF o stężeniu 20 μg/mL. Przygotowane porcje EGF należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
		<li>Aby przygotować 500 μg/ml hydrokortyzonu, rozcieńczyć 1 mg hydrokortyzonu w 1 ml absolutnego etanolu (200 proof). Dodaj 1 ml sterylnego DMEM F:12 do tej mieszaniny, aby uzyskać roztwór podstawowy hydrokortyzonu o stężeniu 500 μg/ml. Porcje zapasu hydrokortyzonu należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
		<li>Aby przygotować 10 μg/ml toksyny, rozpuść 1 mg liofilizowanego proszku toksyny w 1 ml sterylnego dH2O, aby uzyskać 1 mg/ml roztworu podstawowego toksyny. Zapasy toksyny należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
		<li>Aby przygotować pożywkę wzrostową, dodać 500 μl EGF (20 μg/ml), 500 μl hydrokortyzonu (500 μg/ml), 5 μl toksyny (1 mg/ml), 500 μl insuliny bydlęcej (10 mg/ml), 10 ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ml surowicy końskiej do 500 ml DMEM F:12 dla końcowego stężenia 20 ng/ml EGF, 500 ng/ml hydrokortyzonu, 10 ng/ml toksyny, 10 ng/ml insuliny bydlęcej, 2% v/v penicyliny i streptomycyny oraz 5% v/v surowicy końskiej. Stężenie antybiotyku zwiększono do 2%, aby uwzględnić zmniejszoną sterylność w procesie biodrukowania; Jednak stężenie antybiotyku można obniżyć do 1%.</li>
		<li>W celu przygotowania pożywki oznaczającej dodać 500 μl hydrokortyzonu (500 μg/ml), 5 μl toksyny (1 mg/ml), 500 μl insuliny bydlęcej (10 mg/ml), 10 ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ml surowicy końskiej do 500 ml DMEM F:12 dla końcowego stężenia 500 ng/ml hydrokortyzonu, 10 ng/ml toksyny, 10 ng/ml insuliny bydlęcej, 2% v/v penicyliny i streptomycyny oraz 5% v/v surowicy końskiej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MDA-MB-231 
	UWAGA: Potrójnie ujemna (brak receptora estrogenowego, receptora progesteronu i receptora 2 naskórkowego czynnika wzrostu) linia komórek nabłonkowych raka piersi powstaje z wysięku opłucnowego u pacjentki z przerzutowym gruczolakorakiem sutka44. Komórki reprezentują agresywnego, inwazyjnego i słabo zróżnicowanego raka piersi.
	<ol>
		<li>Aby przygotować pożywkę do oznaczania wzrostu i testu, dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 10 ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ml surowicy końskiej do 500 ml DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 2% v/v penicyliny i streptomycyny oraz 5% v/v surowicy końskiej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórek nabłonka piersi
<ol>
	<li>Wysiewaj 500 000 komórek MCF10A lub MDA-MB-231 w 10-centymetrowym (P100) naczyniu do hodowli tkankowej z 10 ml pożywki wzrostowej MCF10A lub MDA-MB-231. Komórki MCF10A i MDA-MB-231 osiągają >90% konfluencji w ciągu 48 godzin.</li>
	<li>Aby przejść przez komórki nabłonka piersi, najpierw umyj komórki 10 ml ciepłego PBS.</li>
	<li>Odłącz komórki nabłonka piersi, dodając do naczynia 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 20-25 minut.</li>
	<li>Dodaj 5 ml pożywki wzrostowej MCF10A lub MDA-MB-231 do trypsynizowanych komórek, aby zneutralizować trypsynę. Pipetować mieszaninę komórka-pożywka w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki i rozbić klastry komórek.</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 200 x g przez 3 minuty. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej MCF10A lub MDA-MB-231.</li>
	<li>Płytka 1 ml zawiesiny komórkowej w 5 nowych 10-centymetrowych szalkach do hodowli tkankowych wraz z pożywką wzrostową MCF10A lub MDA-MB-231. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Komórki będą gotowe do ponownego przejścia za 2-3 dni. Komórki MCF10A mogą być utrzymywane do pasażu numer 35, po czym wykazują zmiany morfologiczne. Komórki MDA-MB-231 mogą być utrzymywane do pasażu numer 24, po czym wykazują zmiany morfologiczne.</li>
</ol>
3. Formacja sferoidowa nabłonka piersi
<ol>
	<li>Zamrozić końcówki pipet o pojemności 200 μl na 30 minut przed rozpoczęciem testu. Roztwór matrycy o obniżonym współczynniku wzrostu (np. Matrigel) (10 mg/ml) należy przechowywać na lodzie przez cały proces.</li>
	<li>Powoli odpipetować 30 μl lodowatego roztworu matrycowego za pomocą lodowatych końcówek pipet o pojemności 200 μl do każdej studzienki szkiełka z 8-dołkową komorą. Zacznij od boków i przeciągnij końcówkę pipety wzdłuż rogów, dodając ostatnią kroplę do środka studzienki, aby zapewnić równomierne pokrycie każdej studzienki. Na tym etapie należy unikać pęcherzyków powietrza, aby zapewnić jednolitą warstwę roztworu matrycy. Używaj nowych końcówek do pipet dla każdego dołka.</li>
	<li>Komora inkubacyjna wsuwa się do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15-20 minut w celu polimeryzacji roztworu matrycy.</li>
	<li>Ponownie zawieś trypsynizowane komórki MCF10A w pożywce testowej MCF10A przy 200 000 komórek/ml lub ponownie zawieś trypsynizowane komórki MDA-MB-231 w pożywce wzrostowej MDA-MB-231 przy 200 000 komórek/ml.</li>
	<li>W przypadku korzystania z komórek MCF10A należy przygotować świeżą sferoidalną pożywkę wzrostową MCF10A, dodając 5 μl EGF (20 μg/ml) i 100 μl roztworu matrycy do 5 ml pożywki testowej, aby uzyskać końcowe stężenie 2% roztworu matrycy.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora szkiełko komorowe wstępnie pokryte roztworem matrycy. Dodaj 50 μl zawiesiny komórek MCF10A lub MDA-MB-231 (10 000 komórek) do każdego dołka. Jeśli używasz komórek MCF10A, dodaj 450 μl sferoidalnej pożywki wzrostowej MCF10A. Jeśli używasz komórek MDA-MB-231, dodaj 450 μl pożywki wzrostowej MDA-MB-231 zmieszanej z 2% roztworem matrycy (9 μl). Natychmiast umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę co 4 cztery dni. Ostrożnie odpipetować 200 μl starych pożywek z jednego rogu każdej studzienki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Podczas tego procesu należy przechylić suwak komory pod kątem 45°, aby upewnić się, że sferoidy nie zostaną naruszone. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego spekieroidalnego podłoża wzrostowego MCF10A lub pożywki wzrostowej MDA-MB-231 uprzednio zmieszanego z 2% roztworem matrycy do każdej studzienki w rogu kroplami, aby upewnić się, że sferoidy pozostają przyczepione do warstwy matrycy. Tylko ~50% pożywki jest wymieniane, dzięki czemu wszystkie cytokiny wytwarzane przez sferoidy nie są całkowicie wyczerpane. 
	UWAGA: Sferoidy nabłonka piersi MCF10A potrzebują do 8 dni, aby spolaryzować i utworzyć puste środki. Sferoidy nabłonkowe piersi MDA-MB-231 tworzą się do 5 dni i nie mają pustych środków.</li>
</ol>
4. Tworzenie sieci komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Posiew komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC)
	<ol>
		<li>Dodaj zawartość pojedynczego zestawu Endothelial Growth Medium-2 zawierającego insulinowy czynnik wzrostu, czynnik wzrostu fibroblastów, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, kwas askorbinowy, naskórkowy czynnik wzrostu, heparynę i gentamycynę-amfoterycynę B, wraz z 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml penicyliny-streptomycyny i 5 ml 200 mM glutaminy do 500 ml Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2), aby uzyskać kompletne podłoże do wzrostu śródbłonka (EGM-2).</li>
		<li>Wysiewaj 500 000 komórek śródbłonka w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w 10 ml EGM-2. Umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, aż osiągną konfluencję >80% (około 48 godzin).</li>
		<li>Aby przejść komórki, przemyj komórki śródbłonka 10 ml ciepłego PBS. Odłącz HUVEC, dodając 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej. Ściśle monitoruj komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Komórki są gotowe, gdy są zwinięte w kulkę, ale pozostają przyczepione do naczynia.</li>
		<li>Ostrożnie odessaj trypsynę z naczynia. Dodaj 8 ml EGM-2 do naczynia. Zmyj komórki z naczynia, pipetując EGM-2 w górę iw dół po całej powierzchni naczynia.</li>
		<li>Alternatywnie dodaj 5 ml EGM-2 do trypsynizowanych komórek, aby zneutralizować trypsynę. Pipetować mieszaninę komórka-pożywka w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki i rozbić klastry komórek. Dodać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 200 x g przez 3 minuty. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml EGM-2.</li>
		<li>Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do 9 ml EGM-2 w 10 cm naczyniu do hodowli tkankowych. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wymieniać 2/3 podłoża na świeże NWZ-2 co 2 dni. Komórki będą gotowe do przejścia w ciągu 3-5 dni. HUVEC może być utrzymywany do przejścia 8, po którym nie udaje im się utworzyć sieci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie sieci komórek śródbłonka (HUVEC)</li>
	<li>Zamrozić końcówki pipet o pojemności 200 μl na 30 minut przed rozpoczęciem testu. Roztwór matrycy o obniżonym współczynniku wzrostu (10 mg/ml) należy przechowywać na lodzie przez cały proces.</li>
	<li>Powoli odpipetować 30 μl lodowatego roztworu matrycowego za pomocą lodowatych końcówek pipet o pojemności 200 μl do każdej studzienki szkiełka z 8-dołkową komorą. Zacznij od boków i przeciągnij końcówkę pipety wzdłuż rogów, dodając ostatnią kroplę do środka studzienki, aby zapewnić równomierne pokrycie każdej studzienki. Na tym etapie należy unikać pęcherzyków powietrza, aby zapewnić jednolitą warstwę roztworu matrycy. Używaj nowych końcówek do pipet dla każdego dołka.</li>
	<li>Komora inkubacyjna ślizga się w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15-20 minut w celu polimeryzacji Matrigel.
	<ol>
		<li>Wstępnie zabarwić 10-centymetrowe naczynie HUVEC 10 μl urządzenia do śledzenia krwinek czerwonych (1:1000) przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Umyj komórki śródbłonka 10 ml ciepłego PBS. Odłącz HUVEC, dodając 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej. Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 5 minut, aby całkowicie odłączyć komórki.</li>
		<li>Dodaj 5 ml EGM-2 do naczynia, aby zneutralizować trypsynę. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 25 ml. Wirować HUVEC przy 1 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml EBM-2 bez surowicy.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby określić żywe komórki. Utwórz roztwór 1 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodaj 100 000 HUVEC do każdej studzienki z 200 μl wolnego EBM-2 w surowicy. Jeśli dodasz więcej komórek, utworzą one monowarstwę powierzchniową, a nie sieć rur.</li>
		<li>Inkubować HUVEC w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 6 godzinach zobrazuj sieci HUVEC za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego. Sieci są teraz gotowe do kohodowli z sferoidami piersi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Bioprinting Sferoidy nabłonkowe piersi na wstępnie utworzonych sieciach HUVEC
UWAGA: Do procesu biofabrykacji powinien być używany system biodepozycji z dwiema dyszami. W tym przypadku system posiadał trzy ruchome ramiona, które umożliwiały przestrzenną kontrolę osadzania materiału w skali mikronów, a także dwa silniki napędzane do nanoszenia biotuszu ze strzykawek o pojemności 10 ml. System powinien być wyposażony w wysokowydajny system filtracji cząstek stałych, a także możliwość sterylizacji UV w celu utrzymania sterylnego środowiska podczas biodrukowania. Biodrukarka jest sterylizowana promieniami UV przez godzinę przed procesem drukowania.
<ol>
	<li>Utwórz sferoidy nabłonka piersi i sieci HUVEC, jak opisano wcześniej. Oszacuj liczbę sferoid nabłonka piersi w każdym dołku, licząc sferoidy na reprezentatywnych obrazach mikroskopii kontrastowej fazowej.</li>
	<li>Odetnij 0,5 cm od końca końcówki pipety o pojemności 1000 μl. Użyj odciętej końcówki pipety, aby ostrożnie odpipetować wszystkie sferoidy z szkiełka 8-dołkowej komory do probówki o pojemności 50 ml. Ponownie zawiesić sferoidy w wybranym biotuszu przy 100 sferoidach/100 μl. 
	UWAGA: Wyższe stężenia sferoidów mogą powodować grupowanie sferoidów i uniemożliwiać wizualizację interakcji między sferoidami a sieciami śródbłonka.</li>
	<li>Przepuść mieszaninę sferoidów przez sitko do komórek o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie duże lub skupione sferoidy.</li>
	<li>Załaduj zebrane sferoidy do sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml i zakryj ją sterylną igłą o rozmiarze 25G. Podłączyć strzykawkę do systemu biodepozycji.</li>
	<li>Odessać pożywkę z sieci HUVEC w 8-dołkowym szkiełku komorowym.</li>
	<li>Wyciśnij 100 μl sferoid nabłonka piersi do 6 studzienek sieci HUVEC z natężeniem przepływu 1 ml/min. Utrzymuj 2 studzienki sieci HUVEC jako kontrole.</li>
	<li>Dodać 400 μl sferoidalnej pożywki wzrostowej MCF10A, jeśli używasz sferoidów MCF10A wydrukowanych w sieciach HUVEC lub dodać 400 μl pożywki wzrostowej MDA-MB-231 uprzednio zmieszanej z 2% roztworem matrycy, jeśli używasz sferoid MDA-MB-231 wydrukowanych w sieciach HUVEC. W studzienkach kontrolnych HUVEC należy stosować odpowiednią sferoidalną pożywkę wzrostową.</li>
	<li>Inkubować kokultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 – 96 godzin bez zmiany pożywki. Kokultury pozostaną żywotne w oryginalnym pożywce przez okres do czterech dni.</li>
</ol>
6. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Preparat immunofluorescencyjny i bufor płuczący PBS-glicyna
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor immunofluorescencyjny (IF) 10x roztwór podstawowy, dodając 2,5 g azydku sodu, 5 g albuminy surowicy bydlęcej, 10 ml Triton X-100 i 2,05 ml Tween-20 w 500 ml 10x PBS. Dostosuj pH do 7,4. Roztwór podstawowy należy przechowywać przez okres do roku w temperaturze 4 °C, aby uniknąć sedymentacji.</li>
		<li>Utwórz działający bufor IF, rozcieńczając 50 ml 10x buforu IF w 450 ml sterylnej wody dejonizowanej. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do jednego tygodnia.</li>
		<li>Przygotować 10x PBS-Glycine roztwór podstawowy buforowy, dodając 37,5 g glicyny do 500 ml 10x PBS. Dostosuj pH do 7,4. Roztwór podstawowy należy przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C, aby uniknąć sedymentacji.</li>
		<li>Stwórz działający roztwór PBS-Glycine, rozcieńczając 50 ml 10x buforu PBS-Glycine w 450 ml sterylnej wody dejonizowanej. Roztwór roboczy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie próbek biodrukowanych i obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę z biodrukowanych kokultur 3D i spłukać 3 razy ciepłym PBS. Utrwal biodrukowane kokultury 3D z 4% paraformaldehydem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać próbki 3 razy przez 20 minut 1x PBS-Glycine.</li>
		<li>Próbki blokowe z buforem IF zmieszanym z 10% surowicą kozią przez 90 minut (blok pierwotny), a następnie 40 minut z buforem IF plus 10% surowicą kozią i fragmentem Affinipure Fab (1:100, blok wtórny).</li>
		<li>W przypadku stosowania sferoidów MCF10A należy oznaczyć próbki pierwszorzędowym przeciwciałem dla integryny α6 (1:100) w wtórnym buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 (1:200) i Hoescht 33342 (1:1000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Linie komórkowe MCF10A wyrażają wysoki poziom integryny α6, która jest niezbędna do wykazania polaryzacji sferoidalnej i morfologii.</li>
		<li>W przypadku stosowania sferoid MDA-MB-231, które wyrażają niskie poziomy integryny α6, należy oznaczyć próbki falloidyną Alexa Fluor 488 (1:100) i Hoescht 33342 (1:1000) w wtórnym buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Falloidyna umożliwia wizualizację filamentu aktynowego, dzięki czemu można ocenić sferoidalną, amorficzną i inwazyjną morfologię.</li>
		<li>Umyj próbki 1X PBS-glicyną 3 razy przez 20 minut.</li>
		<li>Przygotuj próbki do montażu, wyjmując szkiełko studzienki za pomocą narzędzia producenta. Dodaj małą kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu do każdej studzienki. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 60 mm na każdym szkiełku komorowym i ostrożnie uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci.</li>
		<li>Obrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego jako stosy Z po ~10 warstw w krokach co 5 μm. W razie potrzeby skompresuj płaszczyzny Z do jednej płaszczyzny za pomocą polecenia Extended Focus w oprogramowaniu do obrazowania komórek.</li>
		<li>Określ ilościowo adhezję sferoidalną do sieci śródbłonka za pomocą obrazu J. Liczbę przylegających sferoid można określić ilościowo za pomocą wtyczki analitycznej z odpowiednią wielkością cząstek i kołowością. Normalizuje liczbę sferoid dołączonych do obszaru obrazu.</li>
		<li>Aby zapewnić odtwarzalność, określ ilościowo liczbę przylegających sferoid na kafelkowych obrazach 4 x 4 kokultur. Jeśli liczba sferoidalna jest statystycznie istotnie niższa niż w innych doświadczeniach, eksperyment należy powtórzyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten jest pierwszym w swoim rodzaju, który biodrukuje sferoidy w ich architekturze 3D w celu kohodowli z komórkami śródbłonka również w ich architekturze 3D. Krytyczne kroki protokołu obejmują początkowe tworzenie sferoid nabłonka piersi i sieci HUVEC. Należy zachować szczególną ostrożność podczas karmienia sferoidami nabłonkowymi piersi, ponieważ łatwo można je oderwać od roztworu matrycowego. Podobnie, sferoidy nabłonka piersi muszą być traktowane ostrożnie, gdy są pipetowane z roztworu matrycy i mieszane z sie...

3D unaczynione modele guzów in vitro są niezbędnymi narzędziami do mechanistycznego badania wzrostu raka i przerzutów. W szczególności w przypadku raka piersi komórki nabłonka piersi hodowane w Matrigel organizują się w spolaryzowane sferoidy, które bardziej przypominają architekturę acinus sutka in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. Hodowla komórek nabłonka piersi 3D również wpływa na funkcję komórek, przy czym hodowle 3D wykazują różnice w modulacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)8,9; funkcja onkogenu, w tym ErbB210; sygnalizacja wzrostu i apoptozy<klasa SUP="xref">11,<klasa SUP="XREF">12; i oporność na chemioterapię<klasa SUP="xref">13,<klasa SUP="XREF">14. Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych podobnie inaczej reagują na bodźce środowiskowe w 3D w porównaniu z tradycyjną hodowlą 2D15,16,17,18. Jednak wiele wiedzy na temat interakcji śródbłonka naczyń krwionośnych i nabłonka piersi pochodzi z hodowli 2D przy użyciu kondycjonowanej pożywki lub wkładek Transwell lub modeli 3D, w których te dwa typy komórek są fizycznie oddzielone19,20,21,22,23. Te modele kohodowli zapewniają ograniczony wgląd fizjologiczny, ponieważ zarówno hodowla 3D, jak i kontakt komórka-komórka mają kluczowe znaczenie dla interakcji śródbłonka naczyniowego z komórkami nabłonka piersi24,25,26.
3D modele raka zostały stworzone przy użyciu różnych technik, w tym formowania sferoidów w wiszących kroplach, biodruku, montażu magnetycznego i hodowli w hydrożelach lub na rusztowaniach inżynieryjnych5,27,28,29. Niedawno stworzono modele 3D guzów z wieloma typami komórek ułożonymi w odpowiednich strukturach 3D. W jednym z przykładów platformy guza na chipie, komórki rakowe, śródbłonka i zrębu zostały zmieszane w matrycę, a następnie wstrzyknięte do trzech centralnych komór tkankowych w urządzeniu z polidimetylosiloksanu (PDMS). Komory tkankowe były otoczone dwoma zewnętrznymi kanałami, które reprezentowały tętnicę i żyłkę. Po 5-7 dniach hodowli komórki śródbłonka utworzyły sieć mikronaczyniową, a komórki rakowe namnażały się, tworząc małe guzy w pobliżu układu naczyniowego. Platforma ta została następnie wykorzystana do badań przesiewowych narkotyków i ich kombinacji30. Stworzono dodatkowe platformy typu tum-on-a-chip do badania przerzutów i typów nowotworów z określonymi bodźcami mechanicznymi (np. mechanicznym obciążeniem w płucach)31,32. Jednak platformy te na ogół nie obejmują zarówno układu krwionośnego, jak i raka w ich odpowiednich strukturach 3D.
Biofabrykacja jest bardzo obiecująca w rozwoju 3D unaczynionych modeli nowotworów in vitro, ponieważ umożliwia ścisłą kontrolę przestrzenną nad lokalizacją komórek. Pomimo rozwoju biodruku w ciągu ostatniej dekady, niewiele badań koncentruje się konkretnie na nowotworach33,34. W jednym z przykładów, druk 3D komórek HeLa w hydrożelu żelatyny/alginianu/fibrynogenu został wykorzystany do stworzenia modelu raka szyjki macicy in vitro. Komórki nowotworowe zostały poddrukowane biologicznie jako pojedyncze komórki, a następnie pozwolono im utworzyć sferoidy, które wykazały wyższy wskaźnik proliferacji, zwiększoną ekspresję metaloproteinazy macierzy i wyższą chemooporność niż komórki w kulturze 2D35. W tych badaniach, podobnie jak w wielu innych36,37, zdysocjowane zawiesiny komórek zostały poddane biodrukowaniu, a następnie hodowle komórkowe zostały wyposażone w wymagane mechaniczne i biochemiczne wskazówki, aby umożliwić komórkom utworzenie struktury 3D. Jednak samoorganizacja komórkowa może trwać dni lub tygodnie, może wymagać złożonych sygnałów przestrzennych i czasowych środowiskowych lub może nie wystąpić, gdy dwa typy komórek są jednocześnie hodowane. Na przykład komórki nabłonka piersi indukowały śmierć komórek w komórkach śródbłonka w kokulturze 2D, a zdysocjowane komórki nabłonka piersi nie tworzyły sferoid 3D po biodrukowaniu w hydrożelach alginianowych/żelatynowych38. Zdysocjowane komórki nabłonka piersi lub raka tworzyły sferoidy w biotuszach na bazie alginianów tylko wtedy, gdy były uwięzione w okrągłych formach PDMS. W innych przypadkach sferoidy zostały uformowane za pomocą zawieszonych kropelek w okrągłych płytkach studzienkowych o bardzo niskim mocowaniu, a następnie zmieszane z biotuszami na bazie alginianu39,40.
Teraz opisujemy alternatywną metodę bioprodukcji tkanek 3D w tym protokole. Zamiast zasiewać zdysocjowane komórki i czekać, aż te komórki utworzą struktury 3D, opisujemy, jak tworzyć i biodrukować sferoidy guza 3D w sieci rurki naczyniowej, aby stworzyć model wspólnej hodowli guza, który można wykorzystać niemal natychmiast. Sferoidy nowotworowe mogą być hodowane in vitro lub pozyskiwane z tkanek ludzkich (organoidów). Podobnie rurki naczyniowe mogą być hodowane lub mogą być pozyskiwane z fragmentów mikronaczyniowych tkanki tłuszczowej. Biotusze mogą obejmować zarówno biologicznie nieaktywny alginian, jak i wysoce aktywny biologicznie Matrigel41. Ponieważ ten model kohodowli guza 3D można stworzyć z różnymi strukturami komórkowymi i biotuszami, może on zawierać wiele typów komórek, matryc zewnątrzkomórkowych i gradientów chemokin15,42. Podczas gdy w obecnej formule sieci śródbłonka nie mogą być perfundowane, przyszłe iteracje mogą zintegrować tę metodę z mikropłynami lub systemami -on-chip. Biodrukowanie sferoid nabłonka piersi w 3D na sieciach śródbłonka umożliwia szybką biofabrykację modeli ludzkich piersi do testowania leków i spersonalizowanej medycyny precyzyjnej27.

<table><tbody><tr><td>37&stopnie; Inkubator C, 5% CO2 i 95% wilgotności</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Inkubacja komórek</td></tr><tr><td>3D Bio</td><td>drukarka na zamówienie</td><td>Brak</td><td>Służy do biodruku</td></tr><tr><td>8-dołkowe szkiełka komorowe</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>do wysiewu sferoid</td></tr><tr><td>igła o rozmiarze 25 Sigma</td><td>, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>igła do biodruku strzykawka do biodruku</td></tr><tr><td>Absolutny etanol (200 proof)</td> <td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>rekonstrukcja składników podłoża</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&prime;)2 fragmenty kozy anty-mysie IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>blok wtórny - Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Przeciwciało wtórne-immunofluorescencyjna</td></tr><tr><td>insulina bydlęca</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0,5ML</td><td>MCF10A Dodatek do podłoża</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Środek blokujący -Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro; m Sitko do komórek</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Usuń duże lub zgrupowane sferoidy</td></tr><tr><td>CellTracker&trade; Czerwony barwnik CMTPX Thermo</td><td>Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>wstępne barwienie do probówek HUVEC</td></tr><tr><td>Wirówka kompaktowa</td><td>Hermle- Labnet, Edison, NJ</td><td>Z206A</td><td>Do wirowania komórek</td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Dodatek do podłoża Probówki</td></tr><tr><td>stożkowe 15 ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Komory zbierające i zawieszające</td></tr><tr><td>Hrabina II-FL Licznik komórek</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>komórek zliczających</td></tr><tr><td>Pipety szklane (10 ml)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>Zawieszenie komórek</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>Pożywka podstawowa MCF10A</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>Śródbłonek Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC podłoże do</td></tr><tr><td>pomiaru śródbłonka Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>W zestawie zestaw pocisków (zawierający czynniki wzrostu)</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor&trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Etykietowanie sferoidy MDA-MB-231</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 dodatek do pożywki</td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Składnik znakujący immunofluorescencję</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>Immunofluorescencyjny składnik buforowy</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Immunofluorescencja plam jąder</td></tr><tr><td>Serum końskie</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Dodatek do podłoży</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Dodatek do pożywki</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Zastosowania komórkowe, San Diego, CA</td><td>200-05f</td><td>Linie komórkowe śródbłonka</td></tr><tr><td>Integryna i alfa; 6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Składnik do znakowania sferoidów immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Test żywych trupów</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Test barwienia żywych i martwych komórek pod kątem żywotności komórek</td></tr><tr><td>LSM 700 Mikroskop konfokalny Zeiss</td><td>, Thornwood, NY</td><td></td><td>Służy do wizualizacji komórek</td></tr><tr><td>Matrigel - czynnik wzrostu o zmniejszonej 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Spheroid tworzenie</td></tr><tr><td>komórek MCF10A</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Linia komórek piersi</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 komórki</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Linia komórek piersi</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>utrwalacz komórek</td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Dodatek do podłoża</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Saline 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Bufor do płukania komórek przed trypsynizacją</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td> Składnik <td>buforowy immunofluorescencji</td><td>AM9625</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade Thermo</td><td>Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>pożywka do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ składnik pożywki testowej</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td> bufor <td>immunofluorescencyjny</td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka (10 ml)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>proces biodruku</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych (10 cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>jednowarstwowa hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td> składnik <td>buforowy immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>dodatek do licznika komórek</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td> <td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>odwarstwienie komórek</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>składnik buforowy immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF165)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>Dodatek do rurek HUVEC</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania komórek Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z kompresor stosu</td></tr></tbody></table>

bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3d na sieciach śródbłonka

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting wyłania się jako obiecujące narzędzie do tworzenia 3D modeli ludzkiego raka, które lepiej oddają najważniejsze cechy architektury tkanek in vivo. W obecnym biodruku wytłaczanym warstwa po warstwie, pojedyncze komórki są wytłaczane w biotuszu wraz ze złożonymi wskazówkami przestrzennymi i czasowymi, aby promować hierarchiczną samoorganizację tkanek. Jednak ta technika biofabrykacji opiera się na złożonych interakcjach między komórkami, biotuszami oraz wskazówkami biochemicznymi i biofizycznymi. W związku z tym samoorganizacja może trwać dni, a nawet tygodnie, może wymagać określonych biotuszy i nie zawsze może wystąpić, gdy w grę wchodzi więcej niż jeden typ komórek. W związku z tym opracowaliśmy technikę bezpośredniego biodruku wstępnie uformowanych sferoid nabłonka piersi 3D w różnych biotuszach. Biodrukowane, wstępnie uformowane sferoidy nabłonkowe piersi 3D zachowały swoją żywotność i spolaryzowaną architekturę po wydrukowaniu. Dodatkowo wydrukowaliśmy sferoidy 3D na sieciach komórkowych śródbłonka naczyń krwionośnych, aby stworzyć model wspólnej hodowli. W ten sposób nowatorska technika biodruku szybko tworzy bardziej fizjologicznie istotny model 3D ludzkiej piersi przy niższych kosztach i większej elastyczności niż tradycyjne techniki biodruku. Ta wszechstronna technika biodruku może być ekstrapolowana w celu tworzenia modeli 3D innych tkanek w dodatkowych biotuszach.

Komórki nabłonka piersi powinny samoorganizować się w sferoidy 3D po 5-8 dniach hodowli na roztworze macierzy i w pożywce hodowlanej z 2% roztworem macierzy. Nietumorogenne sferoidy nabłonka piersi MCF10A powinny mieć okrągły kształt i pusty środek, z integryną α6 spolaryzowaną ku zewnętrznej krawędzi sferoidu (Rycina 1, wstawka pokazuje puste środki). Silnie inwazyjne komórki nabłonka raka piersi MDA-MB-231 tworzą nieregularne sferoidy. Sferoidy należy wykorzystać, gdy ich średnica wynosi o...

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Nasz protokół ułatwia drukowanie wstępnie uformowanych struktur komórkowych 3D, takich jak sferoidy nabłonka piersi, umożliwiając szybkie tworzenie biologicznie istotnych modeli i różnych biotuszów. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona biodrukowanie sferoid guza 3D na sieci naczyniowej, która może być wykorzystana niemal natychmiast do dowolnego badania eksperymentalnego. Te biodrukowane w 3D modele tkanek zapewniają szybką platformę in vitro, którą można rozszerzyć na potrzeby spersonalizowanej medycyny precyzyjnej.Ta wysoce wszechstronna metoda biodruku 3D może być stosowana do innych układów fizjologicznych, w których ważne są interakcje 3D z naczyniami krwionośnymi. W celu utworzenia sferoidów nabłonka piersi najpierw zamroź końcówki pipet o pojemności 200 mikrolitrów na 30 minut i umieść na lodzie roztwór matrycy o zmniejszonej liczbie czynników wzrostu. Po zamrożeniu końcówek, używając jednej nowej lodowatej końcówki pipety na studzienkę, dodaj 30 mikrolitrów lodowatego roztworu matrycowego na bok i wzdłuż rogów każdego dołka ośmiodołkowego szkiełka podstawowego, dodając ostatnią kroplę do środka, aby zapewnić równomierną powłokę.Gdy wszystkie studzienki zostaną pokryte, inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 15 do 20 minut. Podczas polimeryzacji matrycy należy ponownie zawiesić komórki MCF 10A w pożywce testowej MCF 10A w stężeniu dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitr. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów komórek i 450 mikrolitrów sferoidalnej pożywki wzrostowej MCF 10A do każdej studzienki i natychmiast zwrócić szkiełko do inkubatora.Co cztery dni przechylaj szkiełko komory pod kątem 45 stopni, aby umożliwić zastąpienie 200 mikrolitrów supernatantów świeżą sferoidalną pożywką wzrostową na studzienkę. W celu utworzenia sieci HUVEC należy przygotować ośmiodołkowe szkiełko z ośmiodołkową powłoką pokrytą roztworem matrycy, jak pokazano, i wstępnie wybarwić 10-centymetrową miskę HUVEC 10 mikrolitrami matrycy śledzącej krwinki czerwone przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji umyj komórki śródbłonka 10 mililitrami ciepłego PBS, a następnie potraktuj je dwoma mililitrami 0,05% trypsyny EDTA.Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla zneutralizuj trypsynę pięcioma mililitrami pożywki do wzrostu śródbłonka dwa i przenieś komórki do 25-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Zawiesić osad w pięciu mililitrach śródbłonka bez surowicy dwa do liczenia i rozcieńczyć komórki do stężenia jeden razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie dodaj jeden razy 10 do pięciu HUVEC do każdej studzienki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na sześć godzin.Po pięciu do ośmiu dniach hodowli policz liczbę sferoid w każdym studzience na reprezentatywnych obrazach mikroskopii kontrastowej fazowej i użyj końcówki do pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów z usuniętymi ostatnimi 0,5 centymetra końcówki, aby ostrożnie zebrać wszystkie sferoidy z każdej studzienki szkiełka z ośmiodołkową komorą do probówki o pojemności 50 mikrolitrów. Ponownie zawiesić sferoidy w odpowiednim biotuszu przy stężeniu 100 sferoid na 100 mikrolitrów atramentu i załadować zebrane sferoidy do sterylnej strzykawki o pojemności 10 mililitrów. Wyposażyć strzykawkę w sterylną igłę o rozmiarze 25 i podłączyć strzykawkę do systemu biodepozycji.Usunąć pożywkę z każdej studzienki sieci HUVEC i wycisnąć 100 mikrolitrów sferoid nabłonka piersi do każdej z sześciu studzienek szkiełka komorowego sieci HUVEC przy natężeniu przepływu jednego mililitra sferoid na minutę. Następnie dodaj 400 mikrolitrów sferoidalnej pożywki wzrostowej MCF 10A do każdej studzienki i umieść kokultury w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 96 godzin. Po pięciu do ośmiu dniach hodowli, jak wykazano, nienowotworowe sferoidy nabłonkowe piersi MCF 10A powinny pojawić się okrągłe z pustym środkiem z integryną alfa-6 spolaryzowaną do zewnętrznej krawędzi sferoidy.Wysoce inwazyjne komórki nabłonkowe raka piersi MDA-MB-231 tworzą nieregularne sferoidy, które mogą wykazywać komórki migrujące ze sferoid, jeśli są utrzymywane w hodowli Matrigel zbyt długo. Po sześciu do ośmiu godzinach rzadkiej hodowli bez surowicy, jak wykazano, sieci HUVEC można obrazować za pomocą kontrastu fazowego lub mikroskopii konfokalnej. Po biodrukowaniu sferoidów nabłonka piersi w sieciach HUVEC, zarówno sferoidy, jak i sieci powinny zachować swoją pierwotną morfologię przez co najmniej 24 godziny.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu, jest ostrożne obchodzenie się ze sferoidami przed drukowaniem, aby uniknąć grupowania. Po biodrukowaniu i wspólnej hodowli można zmierzyć żywotność komórek nowotworowych, proliferację, migrację i inne interakcje biochemiczne z siecią śródbłonka z leczeniem farmakologicznym i bez niego. Wykazaliśmy, że testowanie leków można rozpocząć już dwie godziny po biodrukowaniu w kokulturze i przetestowaliśmy dodatek sferoidowy do sieci śródbłonka za pomocą leku przeciwnowotworowego paklitakselu.

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film wyjaśnia magnetyczny biodruk 3D hodowanych komórek raka trzustki i fibroblastów. Komórki raka trzustki i aktywowane komórki fibroblastów trzustki są hodowane i magnetyzowane przy użyciu biokompatybilnego zestawu nanocząstek, w celu wytworzenia sferoid pod wpływem sił magnetycznych.

Magnetycznie biodrukowane kokultury sferoidalne 3D: metoda kohodowli komórek rakowych i fibroblastów

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę biodrukowania sferoid nabłonkowych piersi na sieciach śródbłonka, tworząc szybko modele 3D do badań przesiewowych leków. Technika umożliwia natychmiastowe użycie w precyzyjnej medycynie.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów