Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

Protokół ten zapewnia metodę dokonywania dokładnych porównań względnej skuteczności lotnych i nielotnych związków przeciwgrzybiczych na różnych etapach rozwoju grzybów. Metoda ta doskonale nadaje się do oceny aktywności przeciwgrzybiczej produktów pochodzenia roślinnego stosowanych w postaci suszonej lub płynnej, która zawiera szeroką gamę cząsteczek. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat sposobu stosowania produktów pochodzenia roślinnego i jest szczególnie przydatna w dziedzinie kontroli biologicznej.

Procedurę zademonstruje Valentina Gligorijevic, asystentka inżyniera z laboratorium Sup'Biotech. W przypadku zbierania konidiów, ułóż trzy mililitry 0,05% Tween 20 na kulturę grzybni trichoderma i użyj grabi, aby uwolnić konidia z konidioforów, uważając, aby nie naciskać na grzybnię, aby zapobiec oderwaniu strzępek. Gdy wszystkie konidia zostaną uwolnione, użyj mikropipety, aby szybko odzyskać i dodaj roztwór konidiów do 15-mililitrowej probówki w celu policzenia.

Aby przygotować płytki grzybów, umieść 100 mikrolitrów zarodników w stężeniu trzy razy 10 do sześciu zarodników na mililitr na dziewięciocentymetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę PDA i użyj sterylnej szpatułki, aby dodać do płytki 10 gramów szklanych kulek o średnicy dwóch milimetrów. Następnie delikatnie potrząśnij płytką do przodu i do tyłu, a następnie obracaj i obracaj płytkę w segmentach o 90 stopni, aż zostanie całkowicie obrócona, aby równomiernie rozprowadzić zarodniki na powierzchni agaru. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza do analizy zahamowania wzrostu.

Aby wykonać test hamowania kontaktowego z czosnkiem w proszku, użyj sterylnej szpatułki, aby zważyć żądaną ilość proszku czosnku w pojedynczych 50-mililitrowych probówkach. Aby uzyskać stężenia zwykle w zakresie od 0,25 do 16 miligramów na mililitr. Dodaj 10 mililitrów PDA o temperaturze około 45 stopni Celsjusza do każdej probówki i ostrożnie odwróć każdą probówkę kilka razy, aby równomiernie rozprowadzić proszek w całym agarze.

Szybko wlej homogenizowane zawiesiny do szalek Petriego o średnicy pięciu centymetrów i pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić test inhibicji kontaktowej, użyj sterylnej probówki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby narysować okrąg w środku agaru w naczyniach kontrolnych i przeciwgrzybiczych poddanych działaniu związków i użyj sterylnej wykałaczki, aby pozbyć się cylindrów agarowych. Następnie użyj nowej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby losowo narysować od 15 do 20 okręgów na płytkach grzybów i użyj sterylnych wykałaczek, aby ostrożnie przenieść zarodniki, strzępki lub cylindry pokryte grzybnią do pustych obszarów płytek PDA.

Następnie włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Aby przygotować płytki do testu inhibicji przeciwgrzybiczej w fazie gazowej, wlej 10 mililitrów pożywki PDA do pokrywki szalki Petriego o średnicy pięciu centymetrów zawierającej 10 mililitrów pożywki PDA zawierającej związki przeciwgrzybicze lub samej pożywki PDA i pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej. Używając 50-mililitrowej rurki dośrodkowej jako narzędzia do kalibracji, wykonaj okrąg PDA na środku agaru i użyj sterylnej szpatułki, aby usunąć agar wokół koła.

Użyj sterylnej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby narysować okrąg na środku pożywki w pokrywce i użyj sterylnej wykałaczki, aby wyrzucić cylinder ślimaka. Następnie użyj sterylnej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby losowo wykonać zatyczki w przygotowanych płytkach grzybów i użyj sterylnej wykałaczki, aby ostrożnie przenieść zarodniki, strzępki lub zatyczki pokryte grzybnią do pokrywek płytek testowych. W niniejszej analizie zahamowanie wzrostu gatunku Trichoderma SBT 10-2018 wywołane przez trzy związki przeciwgrzybicze oceniono za pomocą testów hamowania fazy kontaktowej i gazowej, jak wykazano dla każdego stadium grzyba.

Zaobserwowano większą wrażliwość zarodników na karbendazym w porównaniu z wczesnymi sieciami strzępek i grzybni, gdy trichoderma i związki przeciwgrzybicze były w kontakcie. W przeciwieństwie do tego, karpendozim nie miał działania przeciwgrzybiczego na trichodermę, gdy grzyb był umieszczony w pewnej odległości od fungicydu zgodnie z niską lotnością tej substancji. Gdy olejek eteryczny z grasicy pospolitej był stosowany jako związek przeciwgrzybiczy, zaobserwowano wyższą wrażliwość na zarodniki i wczesne strzępki w porównaniu z zahamowaniem wzrostu grzybni po 0,025% olejku eterycznym.

Zgodnie z oczekiwaniami, olejek eteryczny z grasicy pospolitej wykazywał identyczną aktywność przeciwgrzybiczą niezależnie od odległości między grzybem a olejkiem. Gdy użyto czosnku w proszku, zaobserwowano wyższą skuteczność przeciwko kiełkowaniu zarodników i wczesnemu wydłużaniu strzępek niż w przypadku wzrostu grzybni. Podczas przygotowywania płytki grzybowej należy zwrócić szczególną uwagę, aby upewnić się, że zarodniki są równomiernie rozmieszczone na powierzchni płytki agarowej, aby zapewnić porównywalne wyniki.