Name: Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności przeciwgrzybiczej lotnych i nielotnych związków na różnych etapach rozwoju grzybów. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę produktów biokontroli roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni Frankowi Yatesowi za jego cenne rady. Prace te były wspierane przez Sup'Biotech.

1. Przygotowanie szczepionki
<ol>
	<li>Przed eksperymentem należy poskładać 5 μl Trichoderma spp. Zarodniki SBT10-2018 przechowywane w temperaturze 4 °C na podłożu agagowym z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) i inkubowane przez 4 dni w temperaturze 30 °C z regularną ekspozycją na światło w celu ułatwienia tworzenia konidiów42 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, panel A). 
	UWAGA: Trichoderma spp. SBT10-2018 został wyizolowany z drewna i jest używany jako model w tym badaniu ze względu na jego szybki wzrost i łatwość odzyskiwania zarodników. Szczep ten jest konserwowany przez nasze laboratorium.</li>
	<li>Odzyskaj konidia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, panel A)
	<ol>
		<li>Połóż 3 ml 0,05% Tween-20 na grzybni Trichoderma.</li>
		<li>Użyj grabi, aby uwolnić konidia z konidioforów; unikaj naciskania na grzybnię, aby zapobiec oderwaniu strzępek.</li>
		<li>Szybko odzyskać roztwór za pomocą mikropipety, aby uniknąć jego wchłonięcia przez podłoże agarowe, i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę zarodników za pomocą hemocytometru i przygotuj roztwór zawierający 3 x 106 zarodników/ml. 
		UWAGA: Ten krok należy wykonać ostrożnie, aby zapobiec ekstrakcji strzępek. Przygotowanie zarodników jest następnie sprawdzane pod mikroskopem. Ostatecznie, w przypadku szczepów prezentujących wysoce powietrzną i puszystą grzybnię, można dodać etap filtracji za pomocą filtra siatkowego 40 μM w celu wyeliminowania resztkowego fragmentu grzybni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek grzybowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, panel B)
<ol>
	<li>Umieścić 100 μl 3 x 106 zarodników/ml za pomocą mikropipety na szalce Petriego o średnicy 9 cm zawierającej pożywkę PDA, aby uzyskać 4 800 zarodników/cm2, co odpowiada 925 zarodnikom/zarodnikom o średnicy 5 mm.</li>
	<li>Dodać 10 g szklanych kulek o średnicy 2 mm za pomocą sterylnej szpatułki i wykonywać ruchy do przodu i do tyłu równolegle i prostopadle do ramienia operatora, aby równomiernie rozprowadzić zarodniki na powierzchni agaru.</li>
	<li>Obrócić płytkę o 90° i powtórzyć ruchy obrotowe (jak w ppkt 2.2); powtarzać te czynności, aż płyta zostanie całkowicie obrócona.</li>
	<li>Natychmiast należy użyć płytki do przeprowadzenia eksperymentów wymagających zarodników lub inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 17 godzin lub 24 godziny, gdy potrzebne są odpowiednio wczesne strzępki lub grzybnia. 
	UWAGA: Aby porównać aktywność przeciwgrzybiczą mierzoną po przeniesieniu czopa grzybni i transferze krążka grzybni, użyj sterylnej pęsety i umieść sterylne krążki celulozy o średnicy 5 mm losowo na powierzchni płytki agarowej po rozprzestrzenieniu się zarodników.</li>
</ol>
3. Przygotowanie związków przeciwgrzybiczych
<ol>
	<li>Przygotowanie produktu pochodzenia roślinnego: przygotowanie czosnku w proszku
	<ol>
		<li>Obierz ząbki świeżego czosnku i pokrój goździki w plastry o szerokości 2-3 mm za pomocą ostrza skalpela.</li>
		<li>Suszyć plastry na powietrzu przez 2 dni w temperaturze 40 °C.</li>
		<li>Miel plastry przez 3 x 15 sekund za pomocą młynka nożowego, aby uzyskać drobny proszek.</li>
		<li>Przed użyciem przechowywać czosnek w proszku w temperaturze 4 °C w probówkach o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Ponieważ czosnek nie jest sterylizowany w autoklawie (aby zapobiec degradacji wrażliwych na temperaturę związków przeciwgrzybiczych), przed użyciem wyczyść młynek, skalpel i suszarkę 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie olejków eterycznych
	<ol>
		<li>Przygotuj 0,5%, 1%, 2,5%, 5% i 20% roztwory olejku eterycznego z grasicy pospolitej w 0,5% Tween-80.</li>
		<li>Dobrze wymieszać w celu utworzenia emulsji przed dodaniem jej do podłoża PDA (patrz punkt 4.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat karbendazymu
	<ol>
		<li>Zważyć karbendazym, aby przygotować roztwór etanolu o stężeniu 200 mg/l (karbendazym jest słabo rozpuszczalny w wodzie).</li>
		<li>Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej przed dodaniem go do pożywki PDA (patrz sekcja 4.2). 
		UWAGA: Karbendazym stanowi zagrożenie dla zdrowia i środowiska. Podczas obchodzenia się z tym produktem noś rękawiczki i maskę. Przechowuj go w przewiewnym miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test inhibicji kontaktowej
<ol>
	<li>Przygotowanie płytek agarowych zawierających czosnek w proszku
	<ol>
		<li>Przygotuj i autoklawuj podłoże PDA.</li>
		<li>Zważ żądaną ilość czosnku w proszku do probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej szpatułki, aby uzyskać stężenia zwykle w zakresie od 0,25 mg/ml do 16 mg/ml.</li>
		<li>Dodać 10 ml palmtopa po uprzednim sprawdzeniu temperatury podłoża po wewnętrznej stronie nadgarstka. Temperatura musi być jak najniższa, aby zapobiec degradacji wrażliwych cząsteczek. Idealnie, temperatura ta powinna wynosić 45 °C.</li>
		<li>Ostrożnie homogenizować, obracając probówkę do góry nogami, aby równomiernie rozprowadzić proszek w pożywce PDA. Szybko przelej 10 ml na szalkę Petriego o średnicy 5 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, panel C).</li>
		<li>Po umieszczeniu szalki Petriego w temperaturze pokojowej poczekaj, aż agar zastygnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek agarowych zawierających olejek eteryczny lub karbendazym
	<ol>
		<li>Wprowadzić 10 ml PDA do probówki o pojemności 50 ml. Sprawdzić temperaturę jak w ppkt 4.1.3.</li>
		<li>Dodać 100 μl różnych roztworów olejku eterycznego z grasicy pospolitej w PDA, aby uzyskać roztwory 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% i 0,2% (patrz sekcja 3.2.1).</li>
		<li>Dodać wymaganą objętość karbendazymu z roztworu o stężeniu 200 mg/l, aby otrzymać roztwory o stężeniu 0,0625-2 mg/l (patrz sekcja 3.3.1).</li>
		<li>Homogenizować ostrożnie, obracając probówkę do góry nogami, szybko wlać 10 ml do szalki Petriego o średnicy 5 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, panel C).</li>
		<li>Po umieszczeniu szalki Petriego w temperaturze pokojowej poczekaj, aż agar zastygnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test inhibicji kontaktowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm narysuj okrąg w środku szalek Petriego zawierających PDA lub PDA, w tym związki przeciwgrzybicze. Wyrzuć cylinder z agarem za pomocą sterylnej wykałaczki (panel C).</li>
		<li>Za pomocą sterylnej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm narysuj losowo kręgi na płytkach grzybów z sekcji 2. Wydrukuj od 15 do 20 okręgów na płytkę (panel B).</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć cylindry agarowe pokryte zarodnikami, wczesnymi strzępkami lub grzybnią za pomocą sterylnej wykałaczki i umieścić zatyczki w pustej przestrzeni szalek Petriego zawierających PDA lub PDA, w tym związki przeciwgrzybicze (panel C).</li>
		<li>Inkubować płytki zawierające zarodniki przez 48 godzin w temperaturze 30 °C, 31 godzin w przypadku płytek zawierających wczesne strzępki i 24 godziny w przypadku płytek pokrytych grzybnią (panel C).</li>
		<li>Zmierz średnicę promieniowego wzrostu i oblicz procent zahamowania wzrostu grzybów w stosunku do kontroli, korzystając ze wzoru (panel D) 
		% zahamowania wzrostu grzybów = (C - A/C)* 100 
		gdzie C jest średnicą promienistego wzrostu w pożywce PDA, a A średnicą promienistego wzrostu w pożywce PDA zawierającej związki przeciwgrzybicze. 
		UWAGA: Aby porównać aktywność przeciwgrzybiczą mierzoną po przeniesieniu czopa grzybni i transferze krążka grzybni, za pomocą sterylnej pęsety, przenieś jeden krążek o średnicy 5 mm uprzednio osadzony na powierzchni płytek grzybów (uwaga sekcja 2) na środek szalek Petriego zawierających PDA lub PDA zawierające związki przeciwgrzybicze i postępuj dokładnie tak, jak w przypadku transferu czopu agarowego</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test inhibicji fazy gazowej
<ol>
	<li>Przygotowanie płytek agarowych zawierających czosnek w proszku
	<ol>
		<li>Postępować jak w sekcji 3.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytki agarowej zawierającej olejek eteryczny lub karbendazym
	<ol>
		<li>Postępować jak w sekcjach 3.2 i 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek grzybowych
	<ol>
		<li>Postępuj jak w punkcie 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test inhibicji przeciwgrzybiczej w fazie gazowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Wlać 10 ml pożywki PDA do pokrywki szalki Petriego o średnicy 5 cm zawierającej 10 ml pożywki PDA lub 10 ml pożywki PDA zawierającej związki przeciwgrzybicze na dno szalki. Poczekaj na całkowite zestalenie się agaru w temperaturze pokojowej (panel C).</li>
		<li>Użyj probówki odśrodkowej o pojemności 50 ml jako narzędzia do kalibracji, aby uzyskać okrąg PDA na środku pokrywy; usuń PDA wokół okręgu za pomocą sterylnej szpatułki (panel C).</li>
		<li>Narysuj okrąg w środku podłoża PDA umieszczonego w pokrywce ze sterylną rurką ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm. Wyrzucić cylinder z agarem za pomocą sterylnej wykałaczki (panel C).</li>
		<li>Uformować zatyczki ze sterylnej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm losowo w płytkach grzybowych, jak w sekcji 4.3.2 (panel B).</li>
		<li>Używając sterylnej wykałaczki, ostrożnie przenieś zatyczki pokryte zarodnikami, wczesnymi strzępkami lub grzybnią z płytek grzybowych do pokrywek płytek testowych (panel C).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 30 °C, jak w ppkt 4.3.4 (panel C).</li>
		<li>Zmierzyć średnicę promieniowego wzrostu i obliczyć procentowy stopień zahamowania wzrostu grzybów, korzystając ze wzoru podanego w sekcji 4.3.5 (panel D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>FAO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+food+losses+and+food+waste+-+Extent%2C+causes+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22FAO%22%5BJournal%5D)">Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention.</a> FAO. , Rome. (2011).</li>
<li>da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+plant+compounds+to+control+fungal+spoilage+and+mycotoxin+production+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods.</a> International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).</li>
<li>Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+biology+and+technology+integrated+management+of+postharvest+gray+mold+on+fruit+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).</li>
<li>Morton, V., Staub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+History+of+Fungicides%5BTitle%5D)+AND+%22APSnet+Feature+Articles%22%5BJournal%5D)">A Short History of Fungicides.</a> APSnet Feature Articles. (1755), 1-12 (2008).</li>
<li>Brandhorst, T. T., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncertainty+surrounding+the+mechanism+and+safety+of+the+post-+harvest+fungicide+Fludioxonil%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil.</a> Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).</li>
<li>Bénit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+susceptibility+of+the+mitochondrial+respiratory+chain+to+SDHI+pesticides+and+its+consequence+on+the+impact+of+SDHIs+on+human+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).</li>
<li>Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+of+postharvest+diseases+on+fruit%3A+a+suitable+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative.</a> Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).</li>
<li>Tripathi, P., Dubey, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+natural+products+as+an+alternative+strategy+to+control+postharvest+fungal+rotting+of+fruit+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables.</a> Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).</li>
<li>Abbey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofungicides+as+alternative+to+synthetic+fungicide+control+of+grey+mould+%28Botrytis+cinerea%29-prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges.</a> Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).</li>
<li>Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+antifungal+activities+of+the+essential+oils+of+various+plants+against+tomato+grey+mould+disease+agent+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea.</a> International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).</li>
<li>Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solidago+canadensis+L.+essential+oil+vapor+effectively+inhibits+botrytis+cinerea+growth+and+preserves+postharvest+quality+of+strawberry+as+a+food+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).</li>
<li>El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassia+oil+for+controlling+plant+and+human+pathogens+on+fresh+strawberries%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries.</a> Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).</li>
<li>Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+in+vitro+evaluating+antimicrobial+activity%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).</li>
<li>Arikan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+antifungal+susceptibility+testing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Current status of antifungal susceptibility testing methods.</a> Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).</li>
<li>Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+yield+performance+of+Pleurotus+ostreatus+%28Jacq.+Fr.%29+Kumm+%28oyster+mushroom%29+on+different+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates.</a> AMB Express. 6 (1), 87(2016).</li>
<li>Fischer, M. S., Glass, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicate+and+fuse%3A+how+filamentous+fungi+establish+and+maintain+an+interconnected+mycelial+network%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).</li>
<li>Mohana, D. C., Raveesha, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+evaluation+of+some+plant+extracts+against+some+plant+pathogenic+field+and+storage+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+Technology%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi.</a> Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).</li>
<li>Balamurugan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+aurantifolia+plant+extracts+against+phytopathogenic+fungi+phaseolina%5BTitle%5D)+AND+%22International+Letters+of+Natural+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina.</a> International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).</li>
<li>Ameziane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+Moroccan+plants+against+citrus+fruit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+sustainable+development%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens.</a> Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).</li>
<li>Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+reliable+and+quantitative+method+-+%22SPOTi%22+for+testing+antifungal+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy.</a> Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).</li>
<li>Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+to+assess+susceptibilities+of+Aspergillus+isolates+to+caspofungin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin.</a> Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).</li>
<li>Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+several+medicinal+plants+extracts+against+the+early+blight+pathogen+%28Alternaria+solani%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani).</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).</li>
<li>Ng, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+proteins+and+peptides+of+leguminous+and+non-leguminous+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins.</a> Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).</li>
<li>Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+peptides+in+plant+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Plant peptides in plant defense responses.</a> Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).</li>
<li>Iriti, M., Faoro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+diversity+and+defence+metabolism%3A+How+plants+cope+with+pathogens+and+ozone+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).</li>
<li>Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+makes+Allium+species+effective+against+pathogenic+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">What makes Allium species effective against pathogenic microbes.</a> Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).</li>
<li>Kyung, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+properties+of+allium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial properties of allium species.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (2), 142-147 (2012).</li>
<li>Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+oils+in+food+preservation%3A+mode+of+action%2C+synergies%2C+and+interactions+with+food+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components.</a> Frontiers in microbiology. 3, 12(2012).</li>
<li>Bueno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+evaluation+of+antimicrobial+activity+of+essential+oils+in+vapour+phase%3A+a+promising+use+in+healthcare+decontamination%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Volatiles+%26+Essential+Oils%22%5BJournal%5D)">Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination.</a> Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).</li>
<li>Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+synergistic+effects+on+antimicrobial+activity+in+vapour-+and+liquidphase+of+cinnamon+and+oregano+essential+oils+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Food+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus.</a> International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).</li>
<li>Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vapour+phase+assay+for+evaluating+the+antimicrobial+activities+of+essential+oils+against+bovine+respiratory+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens.</a> Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).</li>
<li>Feyaerts, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+oils+and+their+components+are+a+class+of+antifungals+with+potent+vapour-phase-mediated+anti-Candida+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+antibacterial+potential+of+liquid+and+vapor+phase+phenolic+essential+oil+compounds+against+oral+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms.</a> PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Leadbeater, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+and+challenges+in+chemical+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Protection+Science%22%5BJournal%5D)">Recent developments and challenges in chemical disease control.</a> Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).</li>
<li>Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+imazalil+exposure+induces+gut+microbiota+dysbiosis+and+colonic+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice.</a> Chemosphere. 160, 349-358 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decay+mechanism+of+postharvest+pathogens+and+their+management+using+non-chemical+and+biological+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Postharvest+Technology%22%5BJournal%5D)">Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches.</a> Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+methods+for+the+control+of+postharvest+citrus+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).</li>
<li>Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+Aspects+of+Carbendazim+and+Sulfosulfuron%3A+Trends%2C+Scope+and+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).</li>
<li>European Food Safety Authority. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conclusion+on+the+peer+review+of+the+pesticide+risk+assessment+of+the+active+substance+carbendazim%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim.</a> EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).</li>
<li>Sakkas, H., Papadopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+basil%2C+oregano%2C+and+thyme+essential+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).</li>
<li>Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproduction+without+sex%3A+conidiation+in+the+filamentous+fungus+Trichoderma%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma.</a> Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).</li>
<li>Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+the+antibacterial+and+antifungal+activities+of+thiosulfinate+analogues+of+allicin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).</li>
<li>Scorzoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+standard+methodology+for+determination+of+antifungal+activity+of+natural+products+against+medical+yeasts+Candida+sp+and+Cryptococcus+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).</li>
</ol>

Przedstawione tu podejście pozwala na ocenę właściwości przeciwgrzybiczych minimalnie przetworzonych produktów pochodzenia roślinnego. W tym protokole jednorodne rozmieszczenie zarodników na powierzchni agaru uzyskuje się za pomocą szklanych kulek o średnicy 2 mm. Ten etap wymaga umiejętności obchodzenia się z koralikami, aby prawidłowo rozprowadzić kulki i uzyskać powtarzalne wyniki, co ostatecznie pozwala na porównanie działania przeciwgrzybiczego na różnych etapach rozwoju grzybów. Odkryliśmy, że szklane kulki o średn...

Globalne straty owoców i warzyw mogą sięgać nawet 50% produkcji1 i wynikają głównie z rozkładu żywności spowodowanego psuciem się grzybów na polu lub podczas przechowywania po zbiorach2,3, pomimo powszechnego stosowania syntetycznych fungicydów od połowy XX wieku4. Stosowanie tych substancji jest ponownie rozważane, ponieważ stanowi ono poważne zagrożenie dla środowiska i zdrowia. Ponieważ szkodliwe konsekwencje ich stosowania pojawiają się w ekosystemach i zgromadzono dowody na potencjalny wpływ na zdrowie5,6, opracowywane są nowe alternatywy dla starych strategii profilaktycznych dla zabiegów przed i po zbiorach7,8,9. Wyzwanie, przed którym stoimy, jest więc dwojakie. Nowatorskie strategie grzybobójcze muszą, po pierwsze, utrzymać poziom skuteczności ochrony żywności przed fitopatogenami, a jednocześnie, po drugie, przyczynić się do radykalnego zmniejszenia śladu środowiskowego praktyk rolniczych. Aby osiągnąć ten ambitny cel, zaproponowano strategie inspirowane naturalnymi mechanizmami obronnymi, które wyewoluowały w roślinach, ponieważ ponad 1000 gatunków roślin zostało wyróżnionych ze względu na ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe8. Na przykład rośliny, które rozwinęły naturalne fungicydy do zwalczania fitopatogenów, są nowym zasobem w badaniach nad rozwojem nowych produktów kontroli biologicznej2. Olejki eteryczne są flagowymi cząsteczkami tego typu. Na przykład wykazano, że olejek eteryczny z origanum chroni pomidory przed szarą pleśnią w szklarniach 10 oraz wykazano, że olejki eteryczne z Solidago canadensis L. i cassia chronią truskawki po zbiorach przed uszkodzeniem przez szarą pleśń11,12. Przykłady te ilustrują, że kontrola biologiczna, a w szczególności produkty pochodzenia roślinnego, stanowią rozwiązanie, które łączy w sobie skuteczność biologiczną i zrównoważenie środowiskowe.
Tak więc, rośliny są ważnym źródłem molekuł potencjalnie interesujących dla przemysłu ochrony roślin. Jednak tylko kilka produktów roślinnych zostało zaproponowanych do stosowania jako produkty kontroli biologicznej, mimo że są one ogólnie uznawane za bezpieczne, niefitotoksyczne i przyjazne dla środowiska2. Zaobserwowano pewne trudności w transpozycji z laboratorium do terenu, takie jak zmniejszanie się skuteczności po zastosowaniu in vivo2,9. W związku z tym ważne staje się zwiększenie zdolności testów laboratoryjnych do lepszego przewidywania skuteczności w terenie. W tym kontekście metody testowania przeciwgrzybiczego produktów pochodzenia roślinnego są niezbędne zarówno do oceny ich skuteczności przeciwgrzybiczej, jak i do określenia optymalnych warunków ich stosowania. W szczególności produkty do kontroli biologicznej są na ogół mniej skuteczne niż fungicydy chemiczne, dlatego lepsze zrozumienie ich sposobu działania jest ważne dla zaproponowania odpowiednich preparatów, określenia sposobu stosowania na polach oraz określenia, który etap rozwoju patogenu jest podatny na kandydujący produkt biologiczny.
Obecne podejścia do działań przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych obejmują metody dyfuzji, takie jak dyfuzja krążka agarowego, rozcieńczanie, bioautografia i cytometria przepływowa13. Większość z tych technik, a dokładniej standardowe testy wrażliwości na leki przeciwgrzybicze - testy dyfuzji i rozcieńczania krążka agarowego - są dobrze przystosowane do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej rozpuszczalnych związków na zarodnikach bakterii i grzybów w płynnych zawiesinach14. Jednakże, metody te generalnie nie są odpowiednie do badania związków stałych, takich jak suszony proszek roślinny, ani do ilościowego określania aktywności przeciwgrzybiczej podczas wzrostu grzybni, ponieważ wymagają one rozcieńczenia zarodników lub rozprzestrzeniania się zarodników na płytkach agarowych i/lub rozcieńczenia związków przeciwgrzybiczych13. W metodzie zatrutej pokarmem, płytki agarowe zawierające środek przeciwgrzybiczy zaszczepia się dyskiem o średnicy 5-7 mm pobranym z 7-dniowej kultury grzybów bez uwzględnienia dokładnej ilości grzybni wyjściowej. Po inkubacji aktywność przeciwgrzybicza jest określana jako procent zahamowania wzrostu promieniowego17,18,19. Dzięki takiemu podejściu możemy ocenić działanie przeciwgrzybicze na wzrost grzybni. Natomiast metodę rozcieńczania agaru przeprowadza się w celu określenia aktywności przeciwgrzybiczej na zarodnikach bezpośrednio zaszczepionych na powierzchni płytki agarowej zawierającej związki przeciwgrzybicze13,20,21. Te dwa podejścia dają uzupełniające się wyniki dotyczące aktywności przeciwgrzybiczej. Są to jednak dwie niezależne techniki stosowane równolegle, które nie zapewniają dokładnego porównania względnej skuteczności związków przeciwgrzybiczych na zarodniki i grzybnię17,20,22, ponieważ ilość wyjściowego materiału grzybowego różni się w obu podejściach. Co więcej, aktywność przeciwgrzybicza produktu pochodzenia roślinnego często wynika z połączenia cząsteczek przeciwgrzybiczych syntetyzowanych przez rośliny w celu stawienia czoła patogenom. Cząsteczki te obejmują białka, peptydy23,24 oraz metabolity o dużej różnorodności chemicznej i należące do różnych klas cząsteczek, takich jak polifenole, terpeny, alkaloidy25, glukozynolany8 oraz związki siarkoorganiczne26. Niektóre z tych cząsteczek są lotne lub stają się lotne podczas ataku patogenu27. Czynniki te są najczęściej słabo rozpuszczalnymi w wodzie i wysokoprężnymi związkami parowymi, które muszą być odzyskiwane poprzez destylację wody jako olejki eteryczne, których niektóre z działań przeciwdrobnoustrojowych zostały dobrze poznane28. Opracowano testy wrażliwości za pośrednictwem fazy gazowej w celu pomiaru aktywności przeciwdrobnoustrojowej związków lotnych po parowaniu i migracji przez fazę parową29. Metody te opierają się na wprowadzaniu związków przeciwgrzybiczych w pewnej odległości od kultury drobnoustrojów29,30,31,32,33. W powszechnie stosowanym teście agarowym w fazie gazowej olejki eteryczne są osadzane na papierowym krążku i umieszczane na środku pokrywy szalki Petriego w pewnej odległości od zawiesiny zarodników bakterii lub grzybów, która jest rozprowadzana na podłożu agarowym. Średnicę strefy zahamowania wzrostu mierzy się następnie w taki sam sposób, jak w przypadku metody dyfuzji krążka agarowego20,24. Inne podejścia zostały opracowane w celu zapewnienia ilościowego pomiaru wrażliwości przeciwgrzybiczej olejków eterycznych w fazie gazowej, pochodzących z metody rozcieńczania bulionu, na podstawie której obliczono aktywność przeciwdrobnoustrojową za pośrednictwem hamującej fazy gazowej32, lub pochodzące z testów dyfuzji krążka agarowego31. Metody te są na ogół specyficzne dla badań aktywności w fazie gazowej i nie są odpowiednie dla testów inhibicji kontaktowej. Wyklucza to określenie względnego udziału czynników lotnych i nielotnych w działaniu przeciwgrzybiczym złożonej mieszaniny bioaktywnej.
Metoda ilościowa, którą opracowaliśmy, ma na celu zmierzenie przeciwgrzybiczego wpływu proszku z suszonych roślin na kontrolowane ilości zarodników i wyrośniętej grzybni zdeponowanej na powierzchni podłoża agarowego w celu odtworzenia wzrostu fitopatogenów podczas infekcji roślin15 jak również połączonej sieci grzybni16. Podejście to jest zmodyfikowanym zestawem doświadczalnym opartym na metodach rozcieńczania agaru i metod zatrucia pokarmowego, który pozwala również, w tym samym układzie doświadczalnym, na równoległe określenie ilościowe udziału zarówno lotnych, jak i nielotnych metabolitów przeciwgrzybiczych. W tym badaniu metoda została porównana z aktywnością trzech dobrze scharakteryzowanych preparatów przeciwgrzybiczych.

<table><tbody><tr><td>Autoklaw-vacuclav 24B+</td><td>Melag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbendazim</td><td>Sigma </td><td>378674-100G</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Eppendorf</td><td></td>do wody <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>destylowanej</td></tr> Sarstedt 72.706 1,5 ml <tr><td>Probówki Falcons</td><td>Sarstedt</td><td>547254</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Rurka ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów</td><td>sklep</td><td></td> detaliczny<td>/</td></tr><tr><td>Suszarka do żywności</td><td>Sancusto</td><td></td><td>sześć tac</td></tr><tr><td>Czosnek w proszku</td><td>Sklep</td><td></td><td></td>ekologiczny</tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>CLOUP</td><td>65020</td><td><img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png"></td></tr><tr><td>Cela zliczająca hemocytometr</td> 2 mm <td>Jeulin</td><td>713442</td><td>/</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td>  UM400</td><td>30 &amp; deg; C</td></tr><tr><td>Młyn nożowy</td><td>Bosch</td><td>TSM6A013B</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny licznik komórek</td><td>Labbox</td><td>HCNT-001-001</td><td>/</td></tr><tr><td>Linijka pomiarowa</td><td>sklep</td><td></td><td></td>detaliczny</tr><tr><td>Szafy bezpieczeństwa mikrobiologicznego</td><td>FASTER</td><td></td><td>FASTER BHA36, TYP II, Cat 2</td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014407</td><td>100 - 1000 µ L</td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014411</td><td>20 - 200 &amp; mikro; L</td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014412</td><td>2 - 20 &amp; mikro; L</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82-1194500</td><td><img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png"> 55 mm</td></tr><tr><td>szalka</td><td>Petriego Sarstedt</td><td>82-1473 </td><td><img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png"> 90 mm</td></tr><tr><td>Kontrolery do pipet-EASY 60</td><td>Labbox</td><td>EASY-P60-001</td><td>/</td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną</td><td>Sigma </td><td>70139-500G</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna RADWAG</td><td>Grosseron</td><td>B126698</td><td>AS220. R2-ML 220g/0,1mg </td></tr><tr><td>Grabie</td><td>Sarstedt</td><td>86-1569001</td><td>/</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrotny AE31E trójokularowy</td><td>Grosseron</td><td>M097917</td><td>/</td></tr><tr><td>Sterylna pipeta miarkowa</td><td>Sarstedt</td><td>1254001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Olejek eteryczny z grasicy</td><td>Drogeria</td><td></td><td>Olejek eteryczny 100%</td></tr><tr><td>Tips 1000 µ L </td><td>Sarstedt</td><td>70.762010</td><td></td></tr><tr><td>Porady 20 &amp; mikro; L </td><td>Sarstedt</td><td>70.760012</td><td></td></tr><tr><td>Wskazówki 200 &amp; mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.760002</td><td></td></tr><tr><td>Wykałaczka</td><td>do sprzedaży</td><td></td><td></td>detalicznej</tr><tr><td>szczep</td><td></td><td></td> Trichoderma spp <td>Szczep laboratorium LRPIA</td></tr><tr><td>Tween-20 </td><td>Sigma </td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma </td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Labbox</td><td>FORS-001-002</td><td>/</td></tr></tbody></table>

pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Opisany protokół opiera się na technice transferu wtyczki, która pozwala na dokładne określenie ilości mikroorganizmów i ich etapów rozwoju. Określona liczba zarodników jest rozprowadzana na płytce agarowej. Ta płytka agarowa jest inkubowana przez określony czas, aby umożliwić grzybom osiągnięcie oczekiwanego stadium rozwoju, z wyjątkiem zarodników, w przypadku których inkubacja nie jest wymagana. Zatyczki agarowe pokryte zarodnikami, strzępkami lub grzybnią są następnie pobierane i przenoszone na podłoże agarowe zawierające związek przeciwgrzybiczy do testu, umieszczane w pewnej odległości od grzybów lub w kontakcie. Metoda ta ma zastosowanie do badania zarówno ekstraktów płynnych, jak i próbek stałych (proszków). Szczególnie dobrze nadaje się do ilościowego określania względnego udziału czynników lotnych i nielotnych w mieszaninach bioaktywnych oraz do określania ich wpływu, w szczególności na zarodniki, wczesne strzępki i grzybnię.
Metoda jest bardzo istotna dla charakterystyki przeciwgrzybiczej aktywności produktów kontroli biologicznej, zwłaszcza produktów pochodzenia roślinnego. Rzeczywiście, w przypadku stosowania u roślin wyniki można wykorzystać do wyboru metody stosowania i ustalenia progów progowych.

Aby ocenić zdolność metody ilościowej do rozróżniania mechanizmu działania różnych rodzajów związków przeciwgrzybiczych, porównano skuteczność trzech znanych środków przeciwgrzybiczych. Karbendazim jest nieulotnym syntetycznym fungicydem, który był szeroko stosowany w zwalczaniu szerokiego spektrum chorób grzybowych roślin39,40. Olejek eteryczny z Thymus vulgaris został w dużej mierze opisany pod kątem jego aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybicz...

Opisujemy zmodyfikowaną metodę opartą na agarze, zaprojektowaną do ilościowego określenia przeciwgrzybiczego działania produktów pochodzenia roślinnego. Za pomocą tego protokołu można ocenić zarówno lotny, jak i nielotny wkład w aktywność przeciwgrzybiczą. Ponadto skuteczność przeciwko grzybom można zmierzyć na kluczowych etapach rozwoju w jednym zestawie eksperymentalnym.

Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

Protokół ten zapewnia metodę dokonywania dokładnych porównań względnej skuteczności lotnych i nielotnych związków przeciwgrzybiczych na różnych etapach rozwoju grzybów. Metoda ta doskonale nadaje się do oceny aktywności przeciwgrzybiczej produktów pochodzenia roślinnego stosowanych w postaci suszonej lub płynnej, która zawiera szeroką gamę cząsteczek. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat sposobu stosowania produktów pochodzenia roślinnego i jest szczególnie przydatna w dziedzinie kontroli biologicznej.Procedurę zademonstruje Valentina Gligorijevic, asystentka inżyniera z laboratorium Sup'Biotech. W przypadku zbierania konidiów, ułóż trzy mililitry 0,05% Tween 20 na kulturę grzybni trichoderma i użyj grabi, aby uwolnić konidia z konidioforów, uważając, aby nie naciskać na grzybnię, aby zapobiec oderwaniu strzępek. Gdy wszystkie konidia zostaną uwolnione, użyj mikropipety, aby szybko odzyskać i dodaj roztwór konidiów do 15-mililitrowej probówki w celu policzenia.Aby przygotować płytki grzybów, umieść 100 mikrolitrów zarodników w stężeniu trzy razy 10 do sześciu zarodników na mililitr na dziewięciocentymetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę PDA i użyj sterylnej szpatułki, aby dodać do płytki 10 gramów szklanych kulek o średnicy dwóch milimetrów. Następnie delikatnie potrząśnij płytką do przodu i do tyłu, a następnie obracaj i obracaj płytkę w segmentach o 90 stopni, aż zostanie całkowicie obrócona, aby równomiernie rozprowadzić zarodniki na powierzchni agaru. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza do analizy zahamowania wzrostu.Aby wykonać test hamowania kontaktowego z czosnkiem w proszku, użyj sterylnej szpatułki, aby zważyć żądaną ilość proszku czosnku w pojedynczych 50-mililitrowych probówkach. Aby uzyskać stężenia zwykle w zakresie od 0,25 do 16 miligramów na mililitr. Dodaj 10 mililitrów PDA o temperaturze około 45 stopni Celsjusza do każdej probówki i ostrożnie odwróć każdą probówkę kilka razy, aby równomiernie rozprowadzić proszek w całym agarze.Szybko wlej homogenizowane zawiesiny do szalek Petriego o średnicy pięciu centymetrów i pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić test inhibicji kontaktowej, użyj sterylnej probówki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby narysować okrąg w środku agaru w naczyniach kontrolnych i przeciwgrzybiczych poddanych działaniu związków i użyj sterylnej wykałaczki, aby pozbyć się cylindrów agarowych. Następnie użyj nowej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby losowo narysować od 15 do 20 okręgów na płytkach grzybów i użyj sterylnych wykałaczek, aby ostrożnie przenieść zarodniki, strzępki lub cylindry pokryte grzybnią do pustych obszarów płytek PDA.Następnie włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Aby przygotować płytki do testu inhibicji przeciwgrzybiczej w fazie gazowej, wlej 10 mililitrów pożywki PDA do pokrywki szalki Petriego o średnicy pięciu centymetrów zawierającej 10 mililitrów pożywki PDA zawierającej związki przeciwgrzybicze lub samej pożywki PDA i pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej. Używając 50-mililitrowej rurki dośrodkowej jako narzędzia do kalibracji, wykonaj okrąg PDA na środku agaru i użyj sterylnej szpatułki, aby usunąć agar wokół koła.Użyj sterylnej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby narysować okrąg na środku pożywki w pokrywce i użyj sterylnej wykałaczki, aby wyrzucić cylinder ślimaka. Następnie użyj sterylnej rurki ze stali nierdzewnej o średnicy pięciu milimetrów, aby losowo wykonać zatyczki w przygotowanych płytkach grzybów i użyj sterylnej wykałaczki, aby ostrożnie przenieść zarodniki, strzępki lub zatyczki pokryte grzybnią do pokrywek płytek testowych. W niniejszej analizie zahamowanie wzrostu gatunku Trichoderma SBT 10-2018 wywołane przez trzy związki przeciwgrzybicze oceniono za pomocą testów hamowania fazy kontaktowej i gazowej, jak wykazano dla każdego stadium grzyba.Zaobserwowano większą wrażliwość zarodników na karbendazym w porównaniu z wczesnymi sieciami strzępek i grzybni, gdy trichoderma i związki przeciwgrzybicze były w kontakcie. W przeciwieństwie do tego, karpendozim nie miał działania przeciwgrzybiczego na trichodermę, gdy grzyb był umieszczony w pewnej odległości od fungicydu zgodnie z niską lotnością tej substancji. Gdy olejek eteryczny z grasicy pospolitej był stosowany jako związek przeciwgrzybiczy, zaobserwowano wyższą wrażliwość na zarodniki i wczesne strzępki w porównaniu z zahamowaniem wzrostu grzybni po 0,025% olejku eterycznym.Zgodnie z oczekiwaniami, olejek eteryczny z grasicy pospolitej wykazywał identyczną aktywność przeciwgrzybiczą niezależnie od odległości między grzybem a olejkiem. Gdy użyto czosnku w proszku, zaobserwowano wyższą skuteczność przeciwko kiełkowaniu zarodników i wczesnemu wydłużaniu strzępek niż w przypadku wzrostu grzybni. Podczas przygotowywania płytki grzybowej należy zwrócić szczególną uwagę, aby upewnić się, że zarodniki są równomiernie rozmieszczone na powierzchni płytki agarowej, aby zapewnić porównywalne wyniki.

measuring-volatile-non-volatile-antifungal-activity-biocontrol

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Niniejszy artykuł demonstruje i omawia techniki stosowane do badania wrażliwości na pestycydy oraz wykrywania oporności na pestycydy kontaktowe i systemiczne u szkodników z grupy stawonogów.

Bioanalizy w monitorowaniu oporności na insektycydy

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

Ten film demonstruje test in vitro do badania związków przeciwgrzybiczych za pomocą testu mikrorozcieńczenia bulionu. Badane związki rozcieńcza się seryjnie na płytce do mikromiareczkowania i inkubuje z inokulum grzybów. Po inkubacji płytkę bada się pod kątem studzienek, w których nie stwierdzono wzrostu grzybów, w celu oceny potencjału przeciwgrzybiczego badanych związków i ich minimalnego stężenia hamującego (MIC).

Test mikrorozcieńczenia bulionu in vitro do badań przesiewowych związków przeciwgrzybiczych

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

Opisujemy użycie chromatografii cienkowarstwowej, bezpośredniego testu bioautografii i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas do identyfikacji naturalnych produktów mikrobiologicznych, które wykazują antagonizm wobec patogenów grzybowych, używając patogenu Sclerotinia sclerotiorum i biopestycydowych izolatów Bacillus jako systemu modelowego.

Identyfikacja produktów naturalnych pod kontrolą biologiczną za pomocą chromatografii cienkowarstwowej - bioautografia bezpośrednia

Celem niniejszego protokołu jest ilościowe określenie produkcji violaceiny przez Chromobacterium violaceum ATCC 12472 jako wskaźnika zastępczego do oceny hamowania przez quorum sensing przez związki bioaktywne.

Kwantyfikacja violaceiny w Chromobacterium violaceum i jej hamowanie przez związki bioaktywne

Poznaj metodę pomiaru aktywności przeciwgrzybiczej lotnych i nielotnych związków na różnych etapach rozwoju grzybów. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę produktów biokontroli roślinnych.

Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

Przeglądaj więcej filmów