Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Peptoglycomics wykorzystuje zaawansowaną spektrometrię mas w połączeniu z analizą danych bioinformatycznych o dużej mocy w celu szczegółowego zbadania składu peptydoglikanu. Wykorzystanie algorytmów bioinformatycznych umożliwia analizę, ekstrakcję i porównywanie danych o specyfikacji masy w zbiorze plików danych jednocześnie, zmniejszając obciążenie pracą i zwiększając dokładność. Zrozumienie różnorodnych odmian i modyfikacji peptydoglikanu ma wpływ na zrozumienie procesów komórkowych, w tym wzrostu i podziału, unikania odporności gospodarza i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Zalecamy najpierw przygotowanie i przeanalizowanie małego podzbioru próbek, aby zapoznać się z protokołem i działać jako projekt pilotażowy w celu oceny parametrów eksperymentalnych. Ponieważ oprogramowanie do analizy danych spektrometrii mas często różni się definicjami używanymi do opisywania cech i funkcji, demonstracja wizualna pomoże użytkownikom w stosowaniu tego protokołu na różnych platformach. W przypadku ekstrakcji woreczków peptydoglikanu należy ponownie zawiesić zamrożone osady komórkowe w około 10 do 10 pierwotnej objętości kultury w 20 milimolowym fosforanie sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed dodaniem zawiesiny komórkowej kroplami do wrzącego 8% SDS w 20 milimolowym fosforanie sodu do końcowej objętości jeden do jednego.

Utrzymuj delikatne gotowanie przez 30 minut do trzech godzin, mieszając, aby zapewnić całkowitą dysocjację błony. Powstała mieszanina powinna być całkowicie klarowna, bez pozostałych grudek komórek lub lepkości. Gdy roztwór ostygnie do temperatury pokojowej, zbierz sakrówki przez ultra wirowanie, a następnie pięć do siedmiu płukań w około 50 mililitrach 20-milimolowego fosforanu sodu o temperaturze pokojowej na pranie, aż bufor do płukania będzie miał stężenie SDS około 0,001%, jak określono za pomocą barwnika kolorymetrycznego.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić woreczki w 5 do 10 mililitrach 20-milimolowego fosforanu sodu o temperaturze pokojowej i uzupełnić próbkę o 50 mikrogramów na mililitr amylazy, DNazy i RNazy w 10-milimolowym siarczanie magnezu na jednogodzinną inkubację z mieszaniem lub nutacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji trawić reakcję przez noc w ilości 100 mikrogramów na mililitr pronazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka po ultra odwirowaniu gotuj próbkę przez godzinę w 25 mililitrach 2% SDS i 20 milimolowym fosforanie sodu w parowarze.

Pod koniec inkubacji przemyć próbkę od pięciu do siedmiu razy 50 mililitrami podwójnie destylowanej wody o temperaturze pokojowej, jak pokazano. Gdy stężenie SDS osiągnie około 0,001%, ponownie zawiesić osad w wystarczającej ilości podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać zawiesinę sacculus i umyć pojemnik. Po całonocnym przechowywaniu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, liofilizuj zamrożoną próbkę przed rozcieńczeniem woreczków do 10 miligramów peptydoglikanu na mililitr stężenia podwójnie destylowanej wody.

W przypadku analizy LC-MS rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu przyrządu i przypisz odpowiednie pliki danych LC-MS QTOF do interesujących nas warunków eksperymentalnych. Uruchom kreatora przetwarzania danych, wsadową ekstrakcję cech rekurencyjnych i ustaw filtry przetwarzania danych tak, aby odpowiadały parametrom warunków LC-MS i oprzyrządowania, aby dokładnie zidentyfikować, grupować i weryfikować piki masy do ładunku reprezentujące poszczególne muropeptydy. Przejrzyj wyniki na końcu wyodrębniania funkcji.

Jeśli znaczna liczba obiektów nie została wyrównana w grupie, dostosuj parametry filtrowania cyklicznego, aby w razie potrzeby rozszerzyć lub ograniczyć okno wykrywania. Następnie wyeksportuj dane jako złożony plik wymiany. W celu różnicowej analizy cech spektralnych rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu systemowym i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi importu danych.

Podczas analizy danych wybierz istotność i zmianę krotności dla analizy różnicowej i ustaw dane bazowe na medianę intensywności we wszystkich plikach danych. Po zakończeniu analizy należy zapoznać się z wynikającymi analizami graficznymi i statystycznymi w celu zidentyfikowania muropeptydów, które wykazują znaczącą zmianę liczebności między badanymi warunkami eksperymentalnymi. W nawigatorze projektu kliknij prawym przyciskiem myszy na różne analizy i wybierz opcję eksportu, aby zapisać szczegóły cechy jako plik tsv.

Upewnij się, że zapisałeś wiele analiz, aby uzyskać wszystkie istotne dane. W oprogramowaniu do analizy różnicowej, w obszarze interpretacji wyników, wybierz przeglądarkę identyfikatorów, dodaj bibliotekę oczekiwanych struktur muropeptydowych i wybierz podobne parametry, jak pokazano dla ekstrakcji cech, aby utworzyć przewidywaną adnotację muropeptydu dla każdej zidentyfikowanej cechy. Aby ręcznie potwierdzić przewidywaną adnotację muropeptydu, należy porównać piki stosunku masy do ładunku chromatogramu tandemowej spektrometrii mas z przewidywanym stosunkiem masy do ładunku wszystkich możliwych fragmentacji znanej struktury muropeptydu.

Użyj edytora molekularnego, aby narysować przewidywaną strukturę muropeptydu za pomocą narzędzia do fragmentacji masy, aby pokazać stosunek masy do ładunku fragmentów spektrometrii mas, gdy każde wiązanie jest zrywane indywidualnie lub w połączeniu, a następnie porównaj wszystkie możliwe fragmentacje struktury muropeptydu z chromatogramem tandemowej spektrometrii mas. Aby potwierdzić adnotację muropeptydu, piki stosunku masy do ładunku wielu fragmentów powinny być znalezione na chromatogramie tandemowej spektrometrii mas z bardzo minimalnym oknem wyrównania stosunku masy do ładunku. Aby ocenić globalne zmiany w modyfikacjach muropeptydów, edytuj plik tsv statystycznie istotnych muropeptydów o dużej krotności, aby uwzględnić jedną kolumnę dla każdej modyfikacji muropeptydu.

Wypełnij tę kolumnę oznaczeniem dla każdego muropeptydu z adnotacją i prześlij zmodyfikowany plik tsv do Perseusa. W obszarze Dodawanie adnotacji do wierszy kliknij pozycję Kategorycznie dodawaj adnotacje do wierszy i dodaj pliki danych do każdego parametru eksperymentalnego. Następnie w obszarze test kliknij dwa przykładowe testy, aby wykonać test T ucznia i kliknij 1D, aby wykonać adnotację 1D.

Zwiększona czułość wykrywania maszyn do spektrometrii mas w połączeniu z oprogramowaniem do rozpoznawania pików o dużej mocy poprawiła możliwość izolowania, monitorowania i analizowania składu substancji złożonych próbek w bardzo najdrobniejszych szczegółach. Powiązanie każdego piku masy do ładunku wyodrębnionego z danych spektrometrii mas z konkretnym muropeptydem jest ułatwione dzięki powiązaniu z bazą danych znanych i przewidywanych struktur muropeptydowych. Chromatogram tandemowej spektrometrii mas z fragmentacją dla każdej wyodrębnionej cechy można porównać z profilem fragmentacji muropeptydu zaproponowanym przy użyciu bazy danych.

Wykresy wulkanów mogą być wykorzystane do podkreślenia muropeptydów, które wykazują statystycznie istotną dużą zmianę liczebności między badanymi warunkami. Badane razem, wiele muropeptydów posiadających tę samą modyfikację może być badanych pod kątem tendencji do jednego warunku eksperymentalnego, a cała grupa może być oceniana pod kątem istotności. Śledzenie modyfikacji muropeptydu w ten sposób może zidentyfikować określoną aktywność enzymatyczną, na którą wpływa parametr eksperymentalny.

Ponadto wartości odstające od tego trendu mogą ujawniać aktywność enzymatyczną o określonej specyficzności lub funkcji biologicznej. Procedura ta bada zmiany biochemiczne i wariacje biologiczne w polimerach, dostarczając w ten sposób wglądu w aktywność enzymatyczną działającą na PG in vivo. Badanie składu PG w celu weryfikacji szczegółów pomoże w zrozumieniu złożonych struktur komórkowych, które mają wpływ na wiele krytycznych procesów fizjologicznych.