Name: Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj półilościową analizę peptydoglikanu metodą LC-MS z bioinformatyką. To podejście szczegółowo profiluje muropeptydy, zwiększając dokładność i redukując obciążenie pracą w badaniach mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Jennifer Geddes-McAlister i dr Anthony'emu Clarke'owi za ich wkład w udoskonalenie tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z CIHR przyznane C.M.K (PJT 156111) oraz NSERC Alexander Graham Bell CGS D przyznane E.M.A. Figury powstały w dniu BioRender.com.

<ol><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li>
<li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).</li>
<li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant%3F+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li>
<li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor%3A+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94(2019).</li>
<li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac%3A+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li>
<li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li>
<li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforsdig%22%5BJournal%5D)">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li>
<li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li>
<li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).</li>
<li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li>
<li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li>
<li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li>
<li>Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li>
<li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%3A+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics%3A+state+of+the+art+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).</li>
<li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin%3A+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li>
<li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li>
<li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li>
<li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li>
<li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).</li>
<li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li>
<li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+%CE%B2-lactam-antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li>
<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje metodę oczyszczania peptydoglikanu z kultur bakteryjnych, procesu wykrywania LC-MS i analizy składu przy użyciu technik bioinformatycznych. Tutaj skupiamy się na bakteriach Gram-ujemnych i wymagana będzie niewielka modyfikacja, aby umożliwić analizę bakterii Gram-dodatnich.
Przygotowanie muropeptydów pozostało praktycznie takie samo od czasu jego pierwszej produkcji w latach 60. 9,11,15.<sup class="xref"...

Peptydoglikan (PG) jest cechą charakterystyczną bakterii, która służy do utrzymania morfologii komórki, zapewniając jednocześnie wsparcie strukturalne dla białek i innych składników komórkowych1,2. Szkielet PG składa się z naprzemiennie połączonych β-1,4 kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) i N-acetyloglukozaminy (GlcNAc)1,2. Każdy MurNAc posiada krótki peptyd związany z resztą ᴅ-laktylu, który może być usieciowany z sąsiednimi peptydami połączonymi z disacharydem (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A,B). To sieciowanie tworzy strukturę przypominającą siatkę, która obejmuje całą komórkę i jest często określana jako worek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Podczas syntezy PG prekursory są generowane w cytoplazmie i transportowane przez błonę cytoplazmatyczną przez flippazy. Prekursory są następnie włączane do dojrzałego PG przez enzymy transglikozylazy i transpeptydazy, które wytwarzają odpowiednio wiązania glikozydowe i peptydowe3. Jednak po złożeniu bakterie wytwarzają liczne enzymy, które modyfikują i/lub degradują PG w celu przeprowadzenia szeregu procesów komórkowych, w tym wzrostu i podziału. Ponadto wykazano, że różne modyfikacje PG nadają adaptacje specyficzne dla szczepu, warunków wzrostu i stresu środowiskowego, które są związane z sygnalizacją komórkową, opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe i unikaniem odporności gospodarza4. Na przykład powszechną modyfikacją jest dodanie grupy acetylowej C6 do MurNAc, która nadaje odporność poprzez ograniczenie dostępu do wiązań glikanowych β-1,4 do enzymów lizozymowych wytwarzanych przez gospodarza, które degradują PG4,5,6. W enterokokach zastąpienie końcowego ᴅ-Ala łańcucha bocznego peptydu przez ᴅ-Lac nadaje większą odporność na środek przeciwdrobnoustrojowy, wankomycyna7,8.
Ogólna procedura izolacji i oczyszczania PG pozostała względnie niezmieniona od czasu, gdy została opisana w latach 60. XX wieku9. Błony bakteryjne rozpuszcza się poprzez obróbkę cieplną SDS, a następnie enzymatyczne usuwanie związanych białek, glikolipidów i pozostałego DNA. Oczyszczony nienaruszony woreczek może być następnie trawiony na poszczególne składniki w wyniku hydrolizy wiązania β-1,4 między GlcNAc i MurNAc. W wyniku tego trawienia powstają disacharydy GlcNAc-MurNAc z nienaruszonymi modyfikacjami strukturalnymi i/lub usieciowaniami krzyżowymi, nazywane są muropeptydami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).
Analiza składu PG została początkowo przeprowadzona za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) w celu oczyszczenia każdego muropeptydu, a następnie ręcznej identyfikacji muropeptydów10,11. Od tego czasu została ona zastąpiona przez tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej (LC-MS), która zwiększa czułość wykrywania i zmniejsza nakład pracy ręcznej związanej z oczyszczaniem każdego pojedynczego muropeptydu. Jednak czasochłonny i złożony charakter ręcznej identyfikacji muropeptydów pozostał czynnikiem ograniczającym, zmniejszając liczbę prowadzonych badań. W ostatnich latach, wraz z pojawieniem się technologii "omicznych", zautomatyzowana ekstrakcja cech LC-MS stała się potężnym narzędziem, pozwalającym na szybkie wykrywanie i identyfikację pojedynczych związków w złożonych próbkach z bardzo dużych zbiorów danych. Po zidentyfikowaniu cech oprogramowanie bioinformatyczne statystycznie porównuje różnice między próbkami za pomocą analizy różnicowej, izolując nawet minimalne różnice w złożonym zbiorze danych i wyświetlając je graficznie użytkownikowi. Dopiero zaczęto badać zastosowanie oprogramowania do ekstrakcji cech do analizy składu PG12,13,14 i sprzężone z analizą bioinformatyczną12. W przeciwieństwie do analizy proteomicznej, która korzysta z łatwo dostępnych baz danych białek, które przewidują fragmentację peptydów, co pozwala na w pełni zautomatyzowaną identyfikację, obecnie nie istnieje biblioteka fragmentacji dla peptydoglikomiksów. Jednak ekstrakcja cech może być połączona ze znanymi i przewidywanymi strukturalnymi bazami danych w celu przewidywania identyfikacji muropeptydów12. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania ekstrakcji cech opartej na LC-MS w połączeniu z biblioteką muropeptydów do automatycznej identyfikacji i bioinformatycznej analizy różnicowej składu PG (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 kolumna z odwróconymi fazami - Kolumna peptydowa AdvanceBio (100 mm x 2,1 mm 2,7 &micro; m)</td> <td>Akwizycja danych</td> <td>Agilent</td><td></td> LC-MS</tr><tr><td>Regulator płaszcza grzewczego, Optichem</td><td>Fisher</td><td>50-401-788</td><td>do 4% SDS wrzącego</td></tr><tr><td>płaszcza grzewczego, 1000 ml półkulisty</td><td>CG1000008</td><td>Fishera do 4% inkubatora wrzenia SDS</td><td></td></tr><tr><td>, 37&deg; C</td><td></td><td></td><td>do oczyszczania sakculi i przygotowywania próbek MS</td></tr><tr><td>Kondensator Leibig, 300MM 24/40,</td> <td>Fisher</td><td>CG121805</td><td>do 4% wrzenia SDS</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td></td><td>do liofilizacji sacculi</td></tr><tr><td>Mieszadło magentyczne</td><td>Fisher</td><td>90-691-18</td> do spektrometru mas <td>wrzenia 4% SDS</td></tr><tr><td>Q-Tof model UHD 6530</td><td>Akwizycja danych</td> <td>Aglient</td><td></td> LC-MS</tr><tr><td>filtry do mikrowirówek, Nanosep MF 0,2 i mikro; </td><td>m Fisher</td><td>50-197-9573</td><td>oczyszczanie próbki przed wstrzyknięciem MS Stojak</td></tr><tr><td>na retortę</td><td>Fisher</td><td>12-000-102</td><td>do wrzenia 4% SDS</td></tr><tr><td>Zacisk retortowy</td><td>Fisher</td><td>S02629</td><td>do 4% SDS wrząca</td></tr><tr><td>kolba okrągłodenna - 1 litr pyrex</td><td>Fisher</td><td>07-250-084</td><td>do 4% wrzenia SDS</td></tr><tr><td>Sonicator model 120</td><td>Fisher</td><td>FB120</td><td>do oczyszczania kości krzyżowej</td></tr><tr><td>Sonicator - mikro końcówka</td><td>Fisher</td><td>FB4422</td><td>do oczyszczania sacculi</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Stopnie mycia sacculi</td><td>Beckman</td><td></td></tr><tr><td>Butelki ultrawirówki, Ti45</td><td>Fisher</td><td>NC9691797</td><td>kroki do mycia sacculi</td>Zaopatrzenie</tr> w <tr><td>wodę</td><td>Miasto</td><td></td><td>dla skraplacza</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> chłodzonego wodą<tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemdraw</td> Edytor molekularny <td>Cambridgesoft</td><td></td><td>do przewidywania fragmentacji muropeptydów</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>przegląda listy adnotowanych muropeptydów, liczebności, wzorców izotopowych itp.</td></tr><tr><td>Akwizycja MassHunter</td><td>Aglient</td><td></td><td>z uruchomionym instrumentem QTOF</td></tr><tr><td>MassHunter Mass Profiler Professional</td><td>Bioinformatyczna analiza różnicowa</td><td>Aglient</td><td></td></tr><tr><td>MassHunter Personal Compound Database and Library Manager</td><td>Aglient</td><td></td><td>muropeptide m/z MS database</td></tr><tr><td>MassHunter Profinder</td><td>Aglient</td><td></td><td>rekurencyjna ekstrakcja cech</td></tr><tr><td>MassHunter Analiza jakościowa</td><td>Aglient</td><td></td><td>viewing MS i MS/MS chromatogramy</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>Max Plank Instytut Biochemii</td><td></td><td>Adnotacja</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 1D <tr><td>< mocny>Materiał< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fisher</td><td>A637</td><td></td></tr><tr><td>Amylaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher</td><td>BP168-1</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS mieszanka tuningowa - HP0321</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolizyna ze Streptomyces globisporus ATCC 21553</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazowy (czystość >99%)</td><td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E od Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNaza</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sód Fosforan (dwuzasadowy)</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (monozasadowy)</td><td>Fisher</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>Plamy-wszystko</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptydoglikan jest ważnym składnikiem ścian komórkowych bakterii i częstym celem komórkowym dla środków przeciwdrobnoustrojowych. Chociaż aspekty struktury peptydoglikanu są dość konserwatywne u wszystkich bakterii, istnieją również znaczne różnice między gram-dodatnimi/ujemnymi i między gatunkami. Ponadto istnieje wiele znanych odmian, modyfikacji lub adaptacji peptydoglikanu, które mogą wystąpić w obrębie gatunku bakterii w odpowiedzi na fazę wzrostu i/lub bodźce środowiskowe. Odmiany te wytwarzają wysoce dynamiczną strukturę, o której wiadomo, że uczestniczy w wielu funkcjach komórkowych, w tym we wzroście/podziale, oporności na antybiotyki i unikaniu obrony gospodarza. Aby zrozumieć zmienność w obrębie peptydoglikanu, należy rozłożyć całą strukturę na części składowe (znane jako muropeptydy) i ocenić pod kątem ogólnego składu komórkowego. Peptidoglycomics wykorzystuje zaawansowaną spektrometrię mas w połączeniu z zaawansowaną analizą danych bioinformatycznych o dużej mocy, aby szczegółowo zbadać skład peptydoglikanu. Poniższy protokół opisuje oczyszczanie peptydoglikanu z kultur bakteryjnych, pozyskiwanie danych o intensywności muropeptydów za pomocą chromatografu cieczowego - spektrometru masowego oraz analizę różnicową składu peptydoglikanu przy użyciu bioinformatyki.

Zwiększona czułość detekcji aparatury MS w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do rozpoznawania pików poprawiła możliwość izolowania, monitorowania i analizowania składu substancji w złożonych próbkach z bardzo wysoką szczegółowością. Wykorzystując te postępy technologiczne, w niedawnych badaniach nad składem peptydoglikanu zaczęto stosować zautomatyzowane techniki ekstrakcji cech LC-MS12,13,14,<sup class="xref...

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Peptoglycomics wykorzystuje zaawansowaną spektrometrię mas w połączeniu z analizą danych bioinformatycznych o dużej mocy w celu szczegółowego zbadania składu peptydoglikanu. Wykorzystanie algorytmów bioinformatycznych umożliwia analizę, ekstrakcję i porównywanie danych o specyfikacji masy w zbiorze plików danych jednocześnie, zmniejszając obciążenie pracą i zwiększając dokładność. Zrozumienie różnorodnych odmian i modyfikacji peptydoglikanu ma wpływ na zrozumienie procesów komórkowych, w tym wzrostu i podziału, unikania odporności gospodarza i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.Zalecamy najpierw przygotowanie i przeanalizowanie małego podzbioru próbek, aby zapoznać się z protokołem i działać jako projekt pilotażowy w celu oceny parametrów eksperymentalnych. Ponieważ oprogramowanie do analizy danych spektrometrii mas często różni się definicjami używanymi do opisywania cech i funkcji, demonstracja wizualna pomoże użytkownikom w stosowaniu tego protokołu na różnych platformach. W przypadku ekstrakcji woreczków peptydoglikanu należy ponownie zawiesić zamrożone osady komórkowe w około 10 do 10 pierwotnej objętości kultury w 20 milimolowym fosforanie sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed dodaniem zawiesiny komórkowej kroplami do wrzącego 8% SDS w 20 milimolowym fosforanie sodu do końcowej objętości jeden do jednego.Utrzymuj delikatne gotowanie przez 30 minut do trzech godzin, mieszając, aby zapewnić całkowitą dysocjację błony. Powstała mieszanina powinna być całkowicie klarowna, bez pozostałych grudek komórek lub lepkości. Gdy roztwór ostygnie do temperatury pokojowej, zbierz sakrówki przez ultra wirowanie, a następnie pięć do siedmiu płukań w około 50 mililitrach 20-milimolowego fosforanu sodu o temperaturze pokojowej na pranie, aż bufor do płukania będzie miał stężenie SDS około 0,001%, jak określono za pomocą barwnika kolorymetrycznego.Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić woreczki w 5 do 10 mililitrach 20-milimolowego fosforanu sodu o temperaturze pokojowej i uzupełnić próbkę o 50 mikrogramów na mililitr amylazy, DNazy i RNazy w 10-milimolowym siarczanie magnezu na jednogodzinną inkubację z mieszaniem lub nutacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji trawić reakcję przez noc w ilości 100 mikrogramów na mililitr pronazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka po ultra odwirowaniu gotuj próbkę przez godzinę w 25 mililitrach 2% SDS i 20 milimolowym fosforanie sodu w parowarze.Pod koniec inkubacji przemyć próbkę od pięciu do siedmiu razy 50 mililitrami podwójnie destylowanej wody o temperaturze pokojowej, jak pokazano. Gdy stężenie SDS osiągnie około 0,001%, ponownie zawiesić osad w wystarczającej ilości podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać zawiesinę sacculus i umyć pojemnik. Po całonocnym przechowywaniu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, liofilizuj zamrożoną próbkę przed rozcieńczeniem woreczków do 10 miligramów peptydoglikanu na mililitr stężenia podwójnie destylowanej wody.W przypadku analizy LC-MS rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu przyrządu i przypisz odpowiednie pliki danych LC-MS QTOF do interesujących nas warunków eksperymentalnych. Uruchom kreatora przetwarzania danych, wsadową ekstrakcję cech rekurencyjnych i ustaw filtry przetwarzania danych tak, aby odpowiadały parametrom warunków LC-MS i oprzyrządowania, aby dokładnie zidentyfikować, grupować i weryfikować piki masy do ładunku reprezentujące poszczególne muropeptydy. Przejrzyj wyniki na końcu wyodrębniania funkcji.Jeśli znaczna liczba obiektów nie została wyrównana w grupie, dostosuj parametry filtrowania cyklicznego, aby w razie potrzeby rozszerzyć lub ograniczyć okno wykrywania. Następnie wyeksportuj dane jako złożony plik wymiany. W celu różnicowej analizy cech spektralnych rozpocznij nowy projekt w oprogramowaniu systemowym i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi importu danych.Podczas analizy danych wybierz istotność i zmianę krotności dla analizy różnicowej i ustaw dane bazowe na medianę intensywności we wszystkich plikach danych. Po zakończeniu analizy należy zapoznać się z wynikającymi analizami graficznymi i statystycznymi w celu zidentyfikowania muropeptydów, które wykazują znaczącą zmianę liczebności między badanymi warunkami eksperymentalnymi. W nawigatorze projektu kliknij prawym przyciskiem myszy na różne analizy i wybierz opcję eksportu, aby zapisać szczegóły cechy jako plik tsv.Upewnij się, że zapisałeś wiele analiz, aby uzyskać wszystkie istotne dane. W oprogramowaniu do analizy różnicowej, w obszarze interpretacji wyników, wybierz przeglądarkę identyfikatorów, dodaj bibliotekę oczekiwanych struktur muropeptydowych i wybierz podobne parametry, jak pokazano dla ekstrakcji cech, aby utworzyć przewidywaną adnotację muropeptydu dla każdej zidentyfikowanej cechy. Aby ręcznie potwierdzić przewidywaną adnotację muropeptydu, należy porównać piki stosunku masy do ładunku chromatogramu tandemowej spektrometrii mas z przewidywanym stosunkiem masy do ładunku wszystkich możliwych fragmentacji znanej struktury muropeptydu.Użyj edytora molekularnego, aby narysować przewidywaną strukturę muropeptydu za pomocą narzędzia do fragmentacji masy, aby pokazać stosunek masy do ładunku fragmentów spektrometrii mas, gdy każde wiązanie jest zrywane indywidualnie lub w połączeniu, a następnie porównaj wszystkie możliwe fragmentacje struktury muropeptydu z chromatogramem tandemowej spektrometrii mas. Aby potwierdzić adnotację muropeptydu, piki stosunku masy do ładunku wielu fragmentów powinny być znalezione na chromatogramie tandemowej spektrometrii mas z bardzo minimalnym oknem wyrównania stosunku masy do ładunku. Aby ocenić globalne zmiany w modyfikacjach muropeptydów, edytuj plik tsv statystycznie istotnych muropeptydów o dużej krotności, aby uwzględnić jedną kolumnę dla każdej modyfikacji muropeptydu.Wypełnij tę kolumnę oznaczeniem dla każdego muropeptydu z adnotacją i prześlij zmodyfikowany plik tsv do Perseusa. W obszarze Dodawanie adnotacji do wierszy kliknij pozycję Kategorycznie dodawaj adnotacje do wierszy i dodaj pliki danych do każdego parametru eksperymentalnego. Następnie w obszarze test kliknij dwa przykładowe testy, aby wykonać test T ucznia i kliknij 1D, aby wykonać adnotację 1D.Zwiększona czułość wykrywania maszyn do spektrometrii mas w połączeniu z oprogramowaniem do rozpoznawania pików o dużej mocy poprawiła możliwość izolowania, monitorowania i analizowania składu substancji złożonych próbek w bardzo najdrobniejszych szczegółach. Powiązanie każdego piku masy do ładunku wyodrębnionego z danych spektrometrii mas z konkretnym muropeptydem jest ułatwione dzięki powiązaniu z bazą danych znanych i przewidywanych struktur muropeptydowych. Chromatogram tandemowej spektrometrii mas z fragmentacją dla każdej wyodrębnionej cechy można porównać z profilem fragmentacji muropeptydu zaproponowanym przy użyciu bazy danych.Wykresy wulkanów mogą być wykorzystane do podkreślenia muropeptydów, które wykazują statystycznie istotną dużą zmianę liczebności między badanymi warunkami. Badane razem, wiele muropeptydów posiadających tę samą modyfikację może być badanych pod kątem tendencji do jednego warunku eksperymentalnego, a cała grupa może być oceniana pod kątem istotności. Śledzenie modyfikacji muropeptydu w ten sposób może zidentyfikować określoną aktywność enzymatyczną, na którą wpływa parametr eksperymentalny.Ponadto wartości odstające od tego trendu mogą ujawniać aktywność enzymatyczną o określonej specyficzności lub funkcji biologicznej. Procedura ta bada zmiany biochemiczne i wariacje biologiczne w polimerach, dostarczając w ten sposób wglądu w aktywność enzymatyczną działającą na PG in vivo. Badanie składu PG w celu weryfikacji szczegółów pomoże w zrozumieniu złożonych struktur komórkowych, które mają wpływ na wiele krytycznych procesów fizjologicznych.

semi-quantitative-analysis-peptidoglycan-liquid-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Opisany jest protokół ręcznej syntezy oligo-peptoidów, po którym następuje analiza sekwencji za pomocą spektrometrii mas.

Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą metody podziału fazy niejonowego środka powierzchniowo czynnego jest opisane do bezpośredniego użycia w testach TLR lub innych zastosowaniach. Dalsze kroki są szczegółowo opisane w celu przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Poznaj półilościową analizę peptydoglikanu metodą LC-MS z bioinformatyką. To podejście szczegółowo profiluje muropeptydy, zwiększając dokładność i redukując obciążenie pracą w badaniach mikrobiologicznych.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Przeglądaj więcej filmów