Name: Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę dyssekcji kanalików nasiennych myszy wspomaganą transiluminacją do analizy etapów spermatogenezy. Technika umożliwia selekcję określonych stadiów cyklu nabłonka nasiennego dla badań immunobarwiączych i innych analiz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Akademii Fińskiej [315948, 314387 dla N.K.]; Fundacja Sigrid Jusélius [do N.K., J.T.]; Fundacja Emila Aaltonena [do J.-A.M., T.L.]; Program Doktorski Medycyny Molekularnej w Turku [S.C.-M., O.O.].

Utrzymanie myszy laboratoryjnych i wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie w Turku.
1. Przygotowanie kanalików nasiennych do mikrodysekcji
<ol>
	<li>Uśmierc dorosłego samca myszy (≥8 tygodni, jądro 80–120 mg w zależności od szczepu i wieku) poprzez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. 
	UWAGA: Mysz powinna być dojrzała płciowo, a najlepiej mieć co najmniej 8 tygodni. Wzorzec transiluminacji u młodocianych myszy różni się od dorosłego, ponieważ fala nabłonka nasiennego nie została jeszcze w pełni ustalona, a czas pierwszej fali spermatogenezy jest inny21,22. Brak wydłużających się plemników u <4-tygodniowych samców myszy wyklucza ich zastosowanie do mikrodysekcji wspomaganej transilluminacją. Można stosować wszystkie szczepy myszy, które mają prawidłową spermatogenezę.</li>
	<li>Spryskaj brzuszną część brzucha 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V.</li>
	<li>Ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza sterylnymi kleszkami, zlokalizuj jądra, wypreparuj je nożyczkami i umieść na sterylnej 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS. 
	UWAGA: Aby zachować sterylność, upewnij się, że wszystkie przybory laboratoryjne i narzędzia chirurgiczne są sterylne.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek z cienką końcówką odkapsuluj jądra, wycinając szczelinę w osłonce białawej, grubym włóknistym arkuszu otaczającym jądro. Następnie rozerwij osłonkę za pomocą kleszczy. Wypchnij kanaliki, naciskając kleszczami i wyrzuć tunica. 
	UWAGA: Podczas wyrzucania tuniki, korzystne może być usunięcie tętnicy jądra wraz z osłonką. Unikaj uszkodzenia kanalików nasiennych.</li>
	<li>Przenieś kanaliki nasienne na nową szalkę Petriego i wlej tyle sterylnego PBS, aby pokryć dno szalki Petriego. Następnie delikatnie rozsuń kanaliki, ale unikaj ich uszkodzenia. 
	UWAGA: Zbyt duże naprężenia mechaniczne wpłyną na wzór transiluminacji i wpłyną na żywotność tkanki i jej architekturę komórkową. Od tego momentu kanaliki mogą być również przetwarzane w celu barwienia immunologicznego całego wierzchowca bez oceny stopnia zaawansowania (3B). Czasami wystarczy retrospektywnie określić stopień zaawansowania poprzez włączenie przeciwciał przeciwko białkom ulegającym ekspresji w różnicujących spermatogoniach, takich jak SALL4, c-KIT i DNMT3A18,23. Gęstość spermatogonii jest stosunkowo wiarygodnym wskaźnikiem stadium (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Mikrodysekcja wspomagana transiluminacją
<ol>
	<li>Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym, przyklejając ją taśmą do stolika. 
	UWAGA: Ważne jest, aby dobrze przykleić szalkę Petriego, aby zapobiec jej ruchowi, który mógłby spowodować mieszanie się zebranych etapów segmentów kanalików nasiennych.</li>
	<li>Aby ujawnić wzorzec absorpcji światła kanalików nasiennych znajdujących się pod ostrością, upewnij się, że próbka jest oświetlona od dołu, a światło przechodzi przez próbkę, tj. jest prześwietlona. 
	UWAGA: Ilość światła pochłoniętego/rozproszonego jest zależna od poziomu kondensacji chromatyny w wydłużających się spermatydach i ich wiązaniu wewnątrz kanalika nasiennego: im bardziej zagęszczone, tym więcej światła jest pochłaniane, tj. wydaje się ciemniejsze.</li>
	<li>Zapoznaj się ze wzorcem absorpcji światła na różnych etapach, zgodnie z opisem w <silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 5A i Rysunek S1, ostrożnie przesuwając wiązki kanalików za pomocą drobnych kleszczy. 
	UWAGA: Etapy zawsze następują po sobie w logicznej kolejności, tworząc falę nabłonka nasiennego. Jednak ważne jest, aby wiedzieć, że kierunek fali spermatogennej czasami odwraca się, a następnie wraca z powrotem (znane również jako modulacje4,9), czasami komplikując procedurę. Również długość każdego etapu, pod względem liczby mm kanalików, różni się znacznie.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś interesujący nas kanalik za pomocą kleszczy z haczykowatą końcówką, a następnie odetnij segment o odpowiedniej długości za pomocą nożyczek do mikrodysekcji (patrz film uzupełniający 1). Haczyk na końcu kleszczy ułatwia podnoszenie i trzymanie rurki oraz pomaga uniknąć jej ściskania. 
	UWAGA: Długość segmentów do cięcia zależy od dalszych zastosowań. W przypadku zbioru połączonych fragmentów kanalików na określonym etapie do analizy białka lub RNA12,13 (II–V, VII–VIII i IX–XI, Rysunek 5B) długość wynosi zwykle 2–5 mm. Gdy stosuje się standardową ekstrakcję fenolowo-chloroformową, z 1 mm kanalika można uzyskać około 200 ng RNA. W przypadku barwienia segmentów kanalików etapowych w całości długość segmentów powinna wynosić >5 mm. W przypadku preparatów do squasha długość segmentów nie powinna przekraczać 1–2 mm, ponieważ komórki w środku segmentu mogą nie wyjść, jeśli są zbyt długie. Użyj skali mm pod szalką Petriego, aby uzyskać dokładny pomiar długości kanalika.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne różnych preparatów
<ol>
	<li>Przygotowanie dyni: weryfikacja etapu i barwienie immunologiczne 
	UWAGA: Specyficzne dla etapu fragmenty kanalików można zgnieść na szkiełku mikroskopowym ze szkłem nakrywkowym w celu przeprowadzenia analizy morfologicznej żywych komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, a następnie barwienia immunologicznego. Zaleca się, aby początkujący korzystał z tego podejścia w celu sprawdzenia etapów podczas zapoznawania się z metodą mikrodysekcji wspomaganej transillumination.
	<ol>
		<li>Zebrać wycinek w objętości 10 μl za pomocą pipety i przenieść go na szkiełko mikroskopowe.</li>
		<li>Zgnieć kanalik, ostrożnie umieszczając szklankę nakrywkową (20 mm x 20 mm) na kanaliku. W rezultacie komórki wypłyną z kanalika i utworzą monowarstwę żywych komórek. Umieść bibułę filtracyjną na krawędzi szkła nakrywkowego, aby ułatwić rozprowadzanie komórek. Unikaj zbytniego zgniatania komórek, aby utrzymać je przy życiu.</li>
		<li>Monitoruj rozprzestrzenianie się komórek pod mikroskopem. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym przy 40-krotnym obiektywie, aby zweryfikować rozpoznawanie etapu, badając obecne typy komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Rysunek S2).</li>
		<li>Gdy komórki rozprzestrzenią się, tworząc okrągłą monowarstwę z obu końców kanalika, zanurz szkiełko w pojemniku zawierającym ciekły azot, trzymając go kleszczami. Trzymaj go zanurzonego przez 10 s. Alternatywnie umieść szkiełko na płycie z suchego lodu w celu zamrożenia.</li>
		<li>Zdejmij szkło nakrywkowe, odkręcając je za pomocą skalpela.</li>
		<li>Niezwłocznie przystąp do mocowania i szybko umieść szkiełko w pojemniku z 90% etanolem na 2–5 minut. 
		UWAGA: Upewnij się, że preparat do squasha nie rozmraża się przed umieszczeniem go w 90% etanolu. Można również stosować inne utrwalacze, takie jak aceton, przez 10 minut.</li>
		<li>Suszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) (do kilku dni) lub w temperaturze -80 °C (długotrwale).</li>
		<li>W celu barwienia immunologicznego próbki należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Płukać w PBS i przepuszczać 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 min.</li>
		<li>Opłucz w PBS i narysuj pierścień smarowy wokół każdej próbki dyni</li>.
		<li>Dodać 50–100 μl 10% BSA (albuminy surowicy bydlęcej) w 0,1% Tween in PBS (PBST) wewnątrz pierścienia smarowego i blokować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć roztwór BSA i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 10% BSA w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myć 3x przez 5 min z PBST.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 10% BSA w PBST. 
		UWAGA: Aby wybarwić akrosomy, próbki można inkubować z przeciwciałem aglutyninowym Peanut znakowanym rodaminą (PNA, 1:1000) w 10% BSA w PBST przez 1 godzinę w RT (Rysunek S3) zamiast specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.</li>
		<li>Przemyć 3x po 5 min PBST, spłukać PBS i zamontować za pomocą preparatu zawierającego DAPI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne kanalików nasiennych w całości 
	UWAGA: Poniższy protokół opisuje barwienie całego montażu dla etapowych (od kroku 2.4) segmentów kanalików. Jeśli badacz chce przeprowadzić barwienie całego montażu bez etapowania (od kroku 1.5), powinien zwrócić uwagę na uwagi w 3.2.1 i 3.2.7.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety przenieś segmenty kanalików (z kroku 2.4) w lodowatym PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść na lodzie. 
		UWAGA: W przypadku stosowania kanalików niestopniowanych od 1,5 należy rozdzielić kanaliki na szalce Petriego, kilkakrotnie pipetując w górę i z powrotem na przechyloną szalkę. Użyj pipety o pojemności 1 ml z odciętą końcówką. Ten krok ma na celu otwarcie struktury tkanki. Należy jednak unikać zbyt intensywnego pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie kanalików. Sedymentacja kanalików potrwa kilkadziesiąt sekund. Małe fragmenty kanalików, komórki śródmiąższowe i szczątki komórkowe pozostają w supernatancie.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant (SN) za pomocą pipetowania lub aspiratora. Dodaj 10 ml lodowatego PBS i wymieszaj przez odwrócenie.</li>
		<li>Pozostawić do osadu, a następnie usunąć SN jak poprzednio.</li>
		<li>Dodać 5 ml 4% PFA i utrwalać przez 5 godzin na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze +4 °C. 
		UWAGA: Czas wiązania zależy od interesujących białek i ich lokalizacji subkomórkowej. W przypadku białek jądrowych i cytoplazmatycznych zwykle wystarcza 2-godzinne wiązanie, jednak markery błonowe, takie jak GFRα1 (receptor rodziny GDNF alfa 1; <silna klasa="xfig">Rysunek 6A,B), korzystaj z dłuższej fiksacji, do 6 godzin.</li>
		<li>Pozostawić do osadu, usunąć SN (PFA) jak poprzednio i krótko spłukać, dodając 10 ml PBS i odwracając probówkę.</li>
		<li>Pozostawić do osadu, usunąć SN jak poprzednio i powtórzyć etap mycia PBS trzy razy przez co najmniej 10 minut każdy na stole obrotowym w temperaturze +4 °C i kontynuować barwienie lub przechowywać w temperaturze +4 °C. 
		UWAGA: Jeśli warunki pracy są sterylne i czyste, próbki mogą być przechowywane i używane przez co najmniej kilka tygodni. Alternatywnie, dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (w/v) z 2% roztworu podstawowego, aby pomóc zachować kanaliki przed przechowywaniem w temperaturze +4 °C.</li>
		<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś 10–20 stałych segmentów kanalików do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml. Pozostawić do osadu i usunąć SN. 
		UWAGA: W przypadku pracy z długimi kanalikami, które nie zostały zainscenizowane, wylej kanaliki na szalkę Petriego i za pomocą nożyczek do mikrodysekcji i kleszczy wytnij segmenty o wielkości około 5–20 mm. Zbyt długie segmenty będą się plątać podczas procedury barwienia, podczas gdy zbyt krótkie segmenty łatwo się zgubią.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 2% BSA + 10% FBS (płodowa surowica bydlęca) w 0,3% Triton X-100 w PBS (PBSX). Blokuj przez co najmniej 1 godzinę na stole obrotowym (20–30 obr./min) przy RT.</li>
		<li>Przepłukać 1 ml PBSX, usunąć SN przez pipetowanie i dodać 250 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA w PBSX (rozcieńczenie 1:100–1:2000). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze +4 °C na stole obrotowym (20–30 obr./min).</li>
		<li>Usunąć roztwór przeciwciała za pomocą pipetowania i przepłukać kanaliki 1 ml PBSX, jak powyżej. Prać trzy razy przez 1 godzinę w PBSX na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze RT. 
		UWAGA: Po tym pierwszym praniu próbkę można pozostawić na noc w temperaturze +4 °C, jeśli to konieczne.</li>
		<li>Usunąć SN i dodać 250 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA w PBSX (zwykle rozcieńczenie 1:500 przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie). Przykryć folią i inkubować na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Powtórzyć czynności 3.2.10.</li>
		<li>Na koniec usuń SN i wlej kanaliki do szkiełka mikroskopowego. Delikatnie oddziel i ułóż kanaliki w paski liniowe za pomocą końcówek ładujących żel. Odcedź nadmiar bufora i dodaj podłoże montażowe oraz szkiełko nakrywkowe. 
		UWAGA: Unikaj wysuszania kanalików podczas ich układania. Barwienie przeciwstawne jąder za pomocą DAPI nie jest konieczne w większości przypadków. Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i zniszczeniu próbki. Preparaty można przechowywać przez 1–2 tygodnie w temperaturze +4 °C przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mäkelä, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis+Physiology%3A+Seminiferous+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).</li>
<li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li>
<li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals%3A+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li>
<li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li>
<li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis+Physiology-Overview+and+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , ELseiver. (2018).</li>
<li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li>
<li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+seminiferous+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), Cambridge, England. 569-579 (2017).</li>
<li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+LD+%22Histological+and+histopathological+evaluation+of+the+testis%22">Histological and histopathological evaluation of the testis</a>. , Cache River Press. Clearwater, FL. (1990).</li>
<li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+%22in+situ%22+analyses+of+DNA+polymerase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li>
<li>Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), Dayton, Ohio. 1008-1020 (2012).</li>
<li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li>
<li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li>
<li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li>
<li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li>
<li>Mäkelä, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), Cambridge, England. 711-721 (2011).</li>
<li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827(2018).</li>
<li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li>
<li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li>
<li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), Cambridge, England. 1495-1505 (2006).</li>
<li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li>
<li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375(2020).</li>
<li>Mäkelä, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis+physiology%3A+Spermatogenic+cell+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+The+commitment+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li>
<li>Mäkelä, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+of+the+Testis+and+Male+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li>
<li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat%3A+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li>
<li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li>
<li>Parvinen, M., Söderström, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana powyżej metoda mikrodysekcji wspomagana transillumination umożliwia podejście zorientowane na etap do badania spermatogenezy. Spermatogeneza jest procesem wysoce zsynchronizowanym, a wszystkie kluczowe etapy różnicowania plemników są regulowane i wykonywane w sposób zależny od etapu, takie jak zaangażowanie w różnicowanie (na etapach VII-VIII), początek mejozy (VII-VIII), podziały mejotyczne (XII), początek wydłużania spermatyd (VIII) i spermiacja (VIII)1,26,27. Analiza zorientowana na etap stanowi potężne narzędzie do badania tych szczególnych zdarzeń, które są ograniczone do określonych etapów spermatogenezy, a zatem występują tylko na określonych etapach cyklu nabłonka nasiennego. Opanowanie metody wymaga pewnej wprawy, a kluczem do sukcesu jest użycie dobrej jakości mikroskopu preparacyjnego i odpowiednie warunki oświetleniowe. Wdrożenie tej metody jako części codziennego zestawu narzędzi może znacznie poprawić wpływ i biologiczne znaczenie badań nad męskimi funkcjami rozrodczymi, umożliwiając dokładniejszą analizę zdarzeń molekularnych podczas spermatogenezy.
Wszystkie badane przez nas szczepy myszy WT wykazują podobny wzór transiluminacji i wykazują konserwatywne asocjacje komórkowe na etapach cyklu nabłonka nasiennego. Pod warunkiem, że spermiogenne różnicowanie komórek rozrodczych nie różni się rażąco od myszy WT, to samo dotyczy wszystkich badanych przez nas modeli myszy z nokautem. Ponadto można go zastosować do innych gatunków, które wykazują podłużny segmentowy układ etapów cyklu nabłonka nasiennego7. Nie można jednak wykorzystywać gatunków o stadiach niesegmentowych (takich jak człowiek). Biorąc pod uwagę zasadniczą rolę kondensacji chromatyny w wydłużaniu spermatyd w definiowaniu wzorca transiluminacji, jasne jest, że jakakolwiek nieregulacja tego procesu nieuchronnie wpłynie na wdrożenie tej metody. U młodych myszy i młodych dorosłych (5-6 tygodni) wzorzec transiluminacji nie został jeszcze w pełni ustalony, dlatego należy stosować tylko myszy starsze niż 8 tygodni. Ważne jest również, aby pamiętać, że ściskanie i ciągnięcie kanalików nieuchronnie wpłynie na wzór transiluminacji, ponieważ zniekształca architekturę komórkową w nabłonku nasiennym.
Izolowane segmenty kanalików nasiennych mogą być również hodowane, co umożliwia obserwację ex vivo i manipulację procesami sprzężonymi ze spermatogenezą, w tym mejozą. Aby zapewnić żywotność tkanki i zapobiec degradacji RNA i białek, próbki powinny być pobierane i przetwarzane nie później niż 2 godziny po poświęceniu myszy. W przypadku hodowli kanalików nasiennych ex vivo czas od złożenia ofiary do rozpoczęcia hodowli nie powinien przekraczać 1 godziny. Integralność fragmentów kanalików może być zazwyczaj utrzymana do 72 godzin in vitro , jeśli zostaną prawidłowo pobrane.
Etap cyklu nabłonka nasiennego można zweryfikować i jeszcze dokładniej określić za pomocą mikrokopii preparatów do squasha z kontrastem fazowym16. Mikroskopia jest wykonywana na żywych komórkach, co nadaje dodatkowy wymiar analizie i umożliwia obserwację ruchów organelli lub komórek w określonych stadiach spermatogenezy 28,29,30. Mikroskopia z kontrastem fazowym zapewnia dokładną ocenę stopnia zaawansowania dla późniejszego barwienia immunologicznego, co umożliwia bardzo szczegółową analizę dynamiki ekspresji i lokalizacji białek podczas spermatogenezy, w tym zmian specyficznych dla danego etapu.
Podczas gdy komórki są uwalniane z kontekstu nabłonkowego w preparatach do squasha, barwienie immunologiczne całych odcinków kanalików umożliwia badanie komórek plemnikotwórczych w ich środowisku fizjologicznym. W związku z tym preparaty typu whole-mount mogą zapewnić lepszą wizualizację architektury kanalików nasiennych i ich kontaktów międzykomórkowych niż barwienie immunologiczne na przekrojach poprzecznych. Co ważne, wspomagana transilluminacją ocena stopnia zaawansowania segmentów kanalików przed barwieniem immunologicznym sprawia, że podejście to jest jeszcze bardziej skuteczne, ponieważ zawiera informacje na temat konkretnego etapu danego segmentu. Barwienie w całości jest szczególnie przydatnym narzędziem do badania komórek na obrzeżach kanalików nasiennych, takich jak okołokanalikowe komórki mięśniowe, makrofagi okołokanalikowe i spermatogonia, ale może również otworzyć nowe spojrzenie na badania nad mejotykami i postmejotycznymi komórkami rozrodczymi.

Różnicowanie męskich komórek rozrodczych od plemników diploidalnych do dojrzałych plemników haploidalnych, tj. spermatogeneza, to złożony proces, który zachodzi w nabłonku kanalików nasiennych w jądrach dojrzałego płciowo osobnika1. Mitotyczni potomkowie spermatogonii A1 najpierw dzielą się pięciokrotnie, aby rozszerzyć populację zaangażowaną w różnicowanie, a następnie wchodzą w mejozę jako spermatocyty, które ostatecznie dają początek haploidalnym plemnidom. Różnicowanie okrągłych plemników w plemniki, czyli spermiogeneza, obejmuje złożone zmiany w morfologii komórki, w tym zagęszczenie jąder i budowę struktur specyficznych dla plemników, takich jak akrosom i wici. U myszy cały proces spermatogenezy trwa 35 dni2,3.
W dowolnym miejscu, nabłonek nasienny zawiera do pięciu kohort różnicujących się komórek rozrodczych plus komórki macierzyste/progenitorowe linii zarodkowej oraz somatyczne komórki Sertoliego1. Różnicujące się komórki rozrodcze tworzą koncentryczne warstwy, których skład jest przewidywalny, a komórki haploidalne na danym etapie rozwoju zawsze kojarzą się z określonymi typami spermatocytów i spermatogonii4,5. Dlatego każdy przekrój kanalika zawiera kohorty komórek rozrodczych o stałym składzie. Te specyficzne asocjacje komórkowe definiuje się jako etapy nabłonka nasiennego. Etapy same w sobie nie prezentują stanów przypominających stagnację punktów kontrolnych, ale stale rozwijają się wraz z postępem różnicowania kohort komórek rozrodczych w synchronizacji1,2,6. U myszy istnieje 12 etapów (I-XII)2, które są ułożone w sposób segmentowy wzdłuż osi podłużnej kanalika nasiennego i następują po sobie w logicznej kolejności, tworząc w ten sposób falę nabłonka nasiennego lub falę spermatologiczną7,8,9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zakończenie spermatogenezy trwa cztery cykle, a hierarchiczne warstwy lub kohorty różnicujących się komórek rozrodczych w obrębie dowolnego przekroju kanalików nasiennych są czasowo oddalone od siebie o jeden cykl nasienny. Długość cyklu jest zależna od gatunku i u myszy każdy cykl trwa 8,6 dnia10.
Etapy można zidentyfikować na podstawie składu komórkowego i organizacji nabłonka nasiennego na histologicznych odcinkach jąder5 (Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Jednak analiza histologiczna jest pracochłonna, czasochłonna i wymaga utrwalenia i barwienia, dlatego nie można jej zastosować do żywej tkanki. Co ważne, ocenę stopnia zaawansowania można również przeprowadzić na żywej tkance pod mikroskopem preparacyjnym, wykorzystując wyraźne wzorce absorpcji/rozproszenia światła wykazywane na różnych etapach cyklu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Zdolność każdego etapu do pochłaniania i rozpraszania światła jest zależna od poziomu kondensacji chromatyny późnych post-mejotycznych spermatydów, które są gospodarzami na danym etapie, oraz od upakowania tych komórek w wiązki7,11. Różnicowanie spermatydów, tj. spermiogeneza, jest dalej podzielone na 16 etapów rozwoju, w tym 8 etapów różnicowania plemników okrągłych (kroki 1-8) i 8 etapów różnicowania plemników wydłużających (kroki 9-16) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Krok 9-11 wydłużające się spermatydy (stadium IX-XI) wykazują tylko niski poziom kondensacji chromatyny, co skutkuje małą ilością pochłaniania światła. Kondensacja chromatyny rozpoczyna się w kroku 11 spermatydy (etap XI), a w kroku 15-16 wydłużające się spermatydy (stadium IV-VIII) zawierają w pełni skondensowaną chromatynę, a zatem wykazują maksymalną absorpcję światła (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Chromatyna musi zostać skondensowana, aby była szczelnie upakowana w główce nasienia. Dodatkowymi czynnikami, które przyczyniają się do wzorca absorpcji światła, są lokalizacja wydłużających się spermatyd w nabłonku (podstawa vs. wierzchołkowa) oraz wiązanie wydłużających się spermatyd (wymawiane w stadiach II-V)11 (<silna klasa="xfig">Ryc. 3). Wiązki są widoczne jako plamki w środku kanalików i jako paski na krawędziach pod mikroskopem preparacyjnym, a im bardziej skondensowana chromatyna, tym ciemniejsza plama/pasek11.
Ten artykuł opisuje użycie metody mikrodysekcji wspomaganej transillumination do izolacji segmentów kanalików nasiennych reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasiennego. Po wyizolowaniu, etapowe segmenty kanalików mogą być poddawane różnym dalszym analizom, w tym biochemicznym analizom RNA i białkom12,13,14,15, cytometria przepływowa16, hodowla kanalików ex vivo17 i immunostaining18. W tym miejscu udostępniamy również szczegółowe protokoły dalszego przetwarzania w celu przygotowania zgniecionych monowarstw etapowych segmentów kanalików do analizy morfologicznej żywych komórek i późniejszego barwienia immunologicznego, a także barwienia immunologicznego segmentów kanalików w całości. Przepływ pracy w pigułce jest opisany w Rysunek 4.
Metoda mikrodysekcji wspomagana transillumination pozwala na dokładną identyfikację i izolację komórek rozrodczych na określonych etapach różnicowania dzięki zsynchronizowanemu składowi komórkowemu etapów. Co ważne, umożliwia również badanie zdarzeń zależnych od stadium podczas spermatogenezy na żywej tkance. Biorąc pod uwagę brak skalowalnych modeli spermatogenezy in vitro, metoda ta ma również wyjątkową zaletę, ponieważ umożliwia ukierunkowane krótkoterminowe badania rozwojowe i toksykologiczne na specyficznych dla danego stadium segmentach kanalików ex vivo12,17. Chociaż opisujemy tutaj metodę dla myszy, tę samą procedurę można zastosować do dowolnego gatunku ssaków z podłużnym i segmentowym układem etapów nabłonka nasiennego, takich jak rat4,7,15,19,20.

<table><tbody><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>szkło nakrywkowe 20x20 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>Falcon stożkowa probówka 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Smarowicz Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>(ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td> Szkiełko mikroskopowe <td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Parafinaldehyd parafolowy (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamentowy uchwyt zapobiegający blaknięciu</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>aglutynina orzechowa (PNA) znakowana rodaminąVector</td> <td>Laboratories</td><td>RL-1072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogeneza to unikalny proces różnicowania, który ostatecznie prowadzi do powstania jednego z najbardziej charakterystycznych typów komórek w organizmie, plemników. Różnicowanie komórek rozrodczych zachodzi w kieszeniach cytoplazmatycznych somatycznych komórek Sertoliego, w których jednocześnie znajduje się od 4 do 5 pokoleń komórek rozrodczych oraz koordynują i synchronizują ich rozwój. Dlatego skład typów komórek rozrodczych w przekroju poprzecznym jest stały, a te asocjacje komórkowe są również znane jako etapy (I–XII) cyklu nabłonka nasiennego. Co ważne, stadia można również zidentyfikować na podstawie nienaruszonych kanalików nasiennych na podstawie ich zróżnicowanej charakterystyki absorpcji/rozpraszania światła ujawnionej przez transoświetlenie oraz faktu, że stadia następują po sobie wzdłuż kanalika w kolejności numerycznej. W artykule opisano metodę mikrodysekcji wspomaganą transilluminacją do izolacji segmentów kanalików nasiennych reprezentujących określone etapy cyklu nabłonka nasiennego myszy. Wzór absorpcji światła w kanalikach nasiennych jest najpierw badany pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie segmenty kanalików reprezentujące określone etapy są wycinane i wykorzystywane do dalszych zastosowań. W tym miejscu opisujemy protokoły barwienia immunologicznego dla specyficznych dla etapu preparatów do squasha i dla nienaruszonych segmentów kanalików. Metoda ta pozwala badaczowi skupić się na zdarzeniach biologicznych zachodzących w określonych fazach spermatogenezy, zapewniając w ten sposób unikalne narzędzie do rozwojowych, toksykologicznych i cytologicznych badań spermatogenezy i leżących u jej podstaw mechanizmów molekularnych.

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Metoda ta ułatwia identyfikację i preparację specyficznych dla danego stadium segmentów jajowodów nasiennych, umożliwiając badanie bardzo specyficznych etapów spermatogenezy. Etapy cyklu nabłonka nasiennego można rozpoznać w świeżych, nieutrwalonych kanalikach, a zatem możemy wybrać tylko interesujące nas etapy do dalszych analiz. Wymaga to pewnej praktyki, aby nauczyć się rozpoznawać etapy na podstawie ich wzorców transiluminacji, ale ten protokół powinien zapewnić Ci sukces.Procedurę zademonstruje Opeyemi Olotu, która jest doktorantką w moim laboratorium. Zacznij od umieszczenia co najmniej 8-tygodniowego dorosłego samca myszy w pozycji leżącej na plecach i zdezynfekowania brzusznej części brzucha 70% etanolem. Użyj sterylnych nożyczek, aby wykonać nacięcie w kształcie litery V w okolicy miednicy brzusznej i użyj sterylnych kleszczy, aby pociągnąć za poduszeczkę tłuszczową najądrza, aby zlokalizować jądra.Użyj nożyczek, aby wypreparować jądra, umieszczając tkanki na sterylnej 100-milimetrowej szalce Petriego z PBS podczas ich zbierania. Użyj nożyczek z cienką końcówką, aby wyciąć szczelinę w osłonce białawej, grubym włóknistym arkuszu otaczającym jądra, i użyj kleszczy, aby rozerwać osłonkę i wypchnąć kanaliki. Umieść zdekapsulowane kanaliki nasienne na nowej szalce Petriego i dodaj tyle sterylnego PBS, aby pokryć dno naczynia.Następnie użyj kleszczy, aby delikatnie rozsunąć kanaliki, nie uszkadzając tkanek. W celu wypreparowania kanalików przyklej naczynie do stolika mikroskopu preparacyjnego i włącz transillumination. Użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie przesunąć wiązki kanalików, aby zapoznać się z wzorcami absorpcji i rozpraszania światła na różnych etapach.Następnie za pomocą kleszczy z haczykowatą końcówką podnieś interesującą nas rurkę i użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby przeciąć segment o odpowiedniej długości. Po przecięciu segmentów kanalików specyficznych dla danego etapu, za pomocą pipety zebrać interesujący nas segment w objętości 10 mikrolitrów PBS i umieścić segment na szkiełku mikroskopowym. Ostrożnie dociśnij szkło nakrywkowe o wymiarach 20 na 20 milimetrów do kanalika, nie zgniatając zbytnio komórek, i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu z kontrastem fazowym.Umieść bibułę filtracyjną na krawędzi szkła nakrywkowego, aby ułatwić rozłożenie komórek na monowarstwę i użyj celu 40 razy, aby sprawdzić etapy komórkowe. Gdy komórki utworzą okrągłą monowarstwę z obu końców kanalika, zanurz szkiełko w pojemniku z ciekłym azotem na 10 sekund. Za pomocą skalpela odwróć szkło nakrywkowe z komórek i natychmiast umieść szkiełko w 90% etanolu na 2 do 5 minut.Następnie wysuszyć na powietrzu i przechowywać szkiełko w temperaturze pokojowej do kilku dni. W celu barwienia immunologicznego kanalików nasiennych w całości, użyj pipety, aby przenieść interesujące segmenty do 15-mililitrowej stożkowej probówki z lodowatym PBS na lodzie. Po pozostawieniu segmentów do osadzania się, ostrożnie wyjmij PBS.Dodaj 10 mililitrów świeżego, lodowatego PBS i wymieszaj przez odwrócenie. Pozostawić kanaliki na kilka minut do ustabilizowania się przed ponownym usunięciem supernatantu, jak pokazano. Po usunięciu całego supernatantu umieść kanaliki w 5 mililitrach paraformaldehydu na pięć godzin przy 20 do 30 obrotach na minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji pozostawić kanaliki na kilka minut, aby opadły, a następnie trzykrotnie przemyć próbkę w świeżym PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut na przemycie z rotacją. Po ostatnim praniu użyj 1-mililitrowej pipety, aby przenieść od 10 do 20 stałych segmentów kanalików do 2-mililitrowej okrągłej probówki. Gdy segmenty się osiądą, zastąp supernatant 1 mililitrem 2% BSA i 10% FBS w PBSX na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej i 20 do 30 obrotów na minutę.Pod koniec inkubacji blokującej przemyć próbki 1 mililitrem PBSX. Przed znakowaniem kanalików 250 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczyć je w 1% BSA w PBSX przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy 20 do 30 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji przemyć kanaliki trzykrotnie w PBSX, jak wykazano, przed znakowaniem próbek 250 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez jedną godzinę, chroniąc przed światłem w temperaturze pokojowej i 20 do 30 obrotów na minutę.Pod koniec inkubacji przemyć kanaliki trzy razy przed dekantacją kanalików na szkiełko mikroskopowe w małej objętości supernatantu. Następnie za pomocą końcówek do ładowania żelem ułóż kanaliki w liniowe paski i odcedź nadmiar bufora. Następnie dodaj 1 do 2 kropli podłoża montażowego przed zamontowaniem szkiełka nakrywkowego.Pod wpływem transoświetlenia etapy od 7 do 8 wydają się jednorodnie ciemne, ponieważ zawierają dużą liczbę w pełni skondensowanych, wydłużających się spermatydów, które są ustawione na wierzchołkowej powierzchni nabłonka. Po tym, jak dojrzałe plemniki zostaną uwolnione do światła podczas spermacji, kanalik wydaje się bardzo blady w stadiach od 9 do 10 z powodu braku skondensowanych, wydłużających się plemników w nabłonku. Po tej bladej strefie następuje strefa słabego punktu, której nierówny wygląd wynika z organizacji wydłużających się spermatyd ze skondensowaną chromatyną w wiązkach.Wiązki te stają się bardzo widoczne w kolejnej strefie silnej plamy. Wiązki spermatydów migrują w kierunku jąder komórek Sertoliego, które znajdują się blisko blaszki podstawnej, co po transoświetlenia objawia się pasiastym wyglądem kanalików stadium od 2 do 5. Pęczki ostatecznie rozpraszają się na etapie 6, a zagęszczające się, wydłużające się plemniki przemieszczają się w pobliżu światła, aby zostać uwolnione z nabłonka na etapie 8.Dokładny etap odcinka kanalika można dokładnie zweryfikować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym preparatów do squasha. Barwienie immunologiczne etapowych preparatów dyni można wykorzystać do badania ekspresji i lokalizacji interesujących białek w nabłonku nasiennym. Barwienie całych kanalików nasiennych jest zwykle stosowane do badania typów komórek, które stykają się z błoną podstawną nabłonka nasiennego, zarówno po stronie rurkowej, jak i śródmiąższowej.Metoda może być również stosowana do badania komórek lub struktur, które znajdują się głębiej w nabłonku, takich jak bariera krew-jądro lub postmejotyczne komórki rozrodcze. Oprócz barwienia immunologicznego możemy wykorzystać segmenty jajowodów do wielu innych dalszych analiz, w tym biochemicznych testów RNA i białek, cytometrii przepływowej i hodowli jajowodów ex vivo. Ponieważ metoda ta pozwala na bardzo szczegółową analizę spermatogenezy, stanowi naprawdę użyteczne narzędzie do badania wszystkich ważnych procesów wymaganych do produkcji nasienia i męskiej płodności.

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje procedurę izolacji komórek Sertoliego z kanalików nasiennych myszy, składnika jąder. Trawienie enzymatyczne i wielokrotne płukanie sprzyjają uwalnianiu komórek Sertoliego do roztworu, który może być dalej hodowany w celu proliferacji i wzrostu.

Izolacja immunologicznych regulatorowych komórek Sertoliego z mysich kanalików nasiennych

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Ten artykuł opisuje mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo jako technikę transfekcji komórek jąder myszy w celu zbadania unikalnych procesów spermatogenezy. Prezentowany protokół obejmuje etapy przygotowania kapilar szklanych, mikroiniekcji przez przewód odprowadzający oraz transfekcji za pomocą elektroporacji.

In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.

Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Tutaj prezentujemy protokół oceny integralności bariery krew-jądro poprzez wstrzykiwanie inuliny-FITC do jąder. Jest to skuteczna metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro, która może być zagrożona przez elementy genetyczne i środowiskowe.

Metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro myszy

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Poznaj metodę dyssekcji kanalików nasiennych myszy wspomaganą transiluminacją do analizy etapów spermatogenezy. Technika umożliwia selekcję określonych stadiów cyklu nabłonka nasiennego dla badań immunobarwiączych i innych analiz.

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Przeglądaj więcej filmów