Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Metoda ta ułatwia identyfikację i preparację specyficznych dla danego stadium segmentów jajowodów nasiennych, umożliwiając badanie bardzo specyficznych etapów spermatogenezy. Etapy cyklu nabłonka nasiennego można rozpoznać w świeżych, nieutrwalonych kanalikach, a zatem możemy wybrać tylko interesujące nas etapy do dalszych analiz. Wymaga to pewnej praktyki, aby nauczyć się rozpoznawać etapy na podstawie ich wzorców transiluminacji, ale ten protokół powinien zapewnić Ci sukces.

Procedurę zademonstruje Opeyemi Olotu, która jest doktorantką w moim laboratorium. Zacznij od umieszczenia co najmniej 8-tygodniowego dorosłego samca myszy w pozycji leżącej na plecach i zdezynfekowania brzusznej części brzucha 70% etanolem. Użyj sterylnych nożyczek, aby wykonać nacięcie w kształcie litery V w okolicy miednicy brzusznej i użyj sterylnych kleszczy, aby pociągnąć za poduszeczkę tłuszczową najądrza, aby zlokalizować jądra.

Użyj nożyczek, aby wypreparować jądra, umieszczając tkanki na sterylnej 100-milimetrowej szalce Petriego z PBS podczas ich zbierania. Użyj nożyczek z cienką końcówką, aby wyciąć szczelinę w osłonce białawej, grubym włóknistym arkuszu otaczającym jądra, i użyj kleszczy, aby rozerwać osłonkę i wypchnąć kanaliki. Umieść zdekapsulowane kanaliki nasienne na nowej szalce Petriego i dodaj tyle sterylnego PBS, aby pokryć dno naczynia.

Następnie użyj kleszczy, aby delikatnie rozsunąć kanaliki, nie uszkadzając tkanek. W celu wypreparowania kanalików przyklej naczynie do stolika mikroskopu preparacyjnego i włącz transillumination. Użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie przesunąć wiązki kanalików, aby zapoznać się z wzorcami absorpcji i rozpraszania światła na różnych etapach.

Następnie za pomocą kleszczy z haczykowatą końcówką podnieś interesującą nas rurkę i użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby przeciąć segment o odpowiedniej długości. Po przecięciu segmentów kanalików specyficznych dla danego etapu, za pomocą pipety zebrać interesujący nas segment w objętości 10 mikrolitrów PBS i umieścić segment na szkiełku mikroskopowym. Ostrożnie dociśnij szkło nakrywkowe o wymiarach 20 na 20 milimetrów do kanalika, nie zgniatając zbytnio komórek, i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu z kontrastem fazowym.

Umieść bibułę filtracyjną na krawędzi szkła nakrywkowego, aby ułatwić rozłożenie komórek na monowarstwę i użyj celu 40 razy, aby sprawdzić etapy komórkowe. Gdy komórki utworzą okrągłą monowarstwę z obu końców kanalika, zanurz szkiełko w pojemniku z ciekłym azotem na 10 sekund. Za pomocą skalpela odwróć szkło nakrywkowe z komórek i natychmiast umieść szkiełko w 90% etanolu na 2 do 5 minut.

Następnie wysuszyć na powietrzu i przechowywać szkiełko w temperaturze pokojowej do kilku dni. W celu barwienia immunologicznego kanalików nasiennych w całości, użyj pipety, aby przenieść interesujące segmenty do 15-mililitrowej stożkowej probówki z lodowatym PBS na lodzie. Po pozostawieniu segmentów do osadzania się, ostrożnie wyjmij PBS.

Dodaj 10 mililitrów świeżego, lodowatego PBS i wymieszaj przez odwrócenie. Pozostawić kanaliki na kilka minut do ustabilizowania się przed ponownym usunięciem supernatantu, jak pokazano. Po usunięciu całego supernatantu umieść kanaliki w 5 mililitrach paraformaldehydu na pięć godzin przy 20 do 30 obrotach na minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji pozostawić kanaliki na kilka minut, aby opadły, a następnie trzykrotnie przemyć próbkę w świeżym PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut na przemycie z rotacją. Po ostatnim praniu użyj 1-mililitrowej pipety, aby przenieść od 10 do 20 stałych segmentów kanalików do 2-mililitrowej okrągłej probówki. Gdy segmenty się osiądą, zastąp supernatant 1 mililitrem 2% BSA i 10% FBS w PBSX na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej i 20 do 30 obrotów na minutę.

Pod koniec inkubacji blokującej przemyć próbki 1 mililitrem PBSX. Przed znakowaniem kanalików 250 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczyć je w 1% BSA w PBSX przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy 20 do 30 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji przemyć kanaliki trzykrotnie w PBSX, jak wykazano, przed znakowaniem próbek 250 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez jedną godzinę, chroniąc przed światłem w temperaturze pokojowej i 20 do 30 obrotów na minutę.

Pod koniec inkubacji przemyć kanaliki trzy razy przed dekantacją kanalików na szkiełko mikroskopowe w małej objętości supernatantu. Następnie za pomocą końcówek do ładowania żelem ułóż kanaliki w liniowe paski i odcedź nadmiar bufora. Następnie dodaj 1 do 2 kropli podłoża montażowego przed zamontowaniem szkiełka nakrywkowego.

Pod wpływem transoświetlenia etapy od 7 do 8 wydają się jednorodnie ciemne, ponieważ zawierają dużą liczbę w pełni skondensowanych, wydłużających się spermatydów, które są ustawione na wierzchołkowej powierzchni nabłonka. Po tym, jak dojrzałe plemniki zostaną uwolnione do światła podczas spermacji, kanalik wydaje się bardzo blady w stadiach od 9 do 10 z powodu braku skondensowanych, wydłużających się plemników w nabłonku. Po tej bladej strefie następuje strefa słabego punktu, której nierówny wygląd wynika z organizacji wydłużających się spermatyd ze skondensowaną chromatyną w wiązkach.

Wiązki te stają się bardzo widoczne w kolejnej strefie silnej plamy. Wiązki spermatydów migrują w kierunku jąder komórek Sertoliego, które znajdują się blisko blaszki podstawnej, co po transoświetlenia objawia się pasiastym wyglądem kanalików stadium od 2 do 5. Pęczki ostatecznie rozpraszają się na etapie 6, a zagęszczające się, wydłużające się plemniki przemieszczają się w pobliżu światła, aby zostać uwolnione z nabłonka na etapie 8.

Dokładny etap odcinka kanalika można dokładnie zweryfikować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym preparatów do squasha. Barwienie immunologiczne etapowych preparatów dyni można wykorzystać do badania ekspresji i lokalizacji interesujących białek w nabłonku nasiennym. Barwienie całych kanalików nasiennych jest zwykle stosowane do badania typów komórek, które stykają się z błoną podstawną nabłonka nasiennego, zarówno po stronie rurkowej, jak i śródmiąższowej.

Metoda może być również stosowana do badania komórek lub struktur, które znajdują się głębiej w nabłonku, takich jak bariera krew-jądro lub postmejotyczne komórki rozrodcze. Oprócz barwienia immunologicznego możemy wykorzystać segmenty jajowodów do wielu innych dalszych analiz, w tym biochemicznych testów RNA i białek, cytometrii przepływowej i hodowli jajowodów ex vivo. Ponieważ metoda ta pozwala na bardzo szczegółową analizę spermatogenezy, stanowi naprawdę użyteczne narzędzie do badania wszystkich ważnych procesów wymaganych do produkcji nasienia i męskiej płodności.