Name: Dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda NKG2D w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Poznaj dwie metody cytometrii przepływowej do wykrywania ligandów NKG2D na powierzchni komórek AML. Techniki te umożliwiają separację komórek macierzystych leukemii od masowych komórek AML w celu dalszej charakterystyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty od Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation dla CL (2019.042.1) oraz Novartis Foundation na badania medyczno-biologiczne dla C.L. Ponadto projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej nr 765104 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie". Dziękujemy za wsparcie Zakładowi Cytometrii Przepływowej w Bazylei.

Próbki pacjentów zostały pobrane po zatwierdzeniu przez Komisję Etyki Szpitali Uniwersyteckich w Bazylei i Tybindze.
1. Biotynylacja białka fuzyjnego NKG2D
UWAGA: Ten krok jest wykonywany za pomocą zestawu do biotynylacji (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcją producenta. Ten etap protokołu musi być wykonany co najmniej 24 godziny przed barwieniem. Biotynylowane białko fuzyjne NKG2D powinno być przechowywane w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Rozmrozić zarówno biotynę, jak i rurki z białkiem fuzyjnym NKG2D w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Jeśli komórki muszą być sterylne do dalszego użytku eksperymentalnego (wstrzyknięcie myszom, testy jednostek tworzących kolonie itp.), Odpuść białko fuzyjne pod okapem z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. W przeciwnym razie każdy krok można wykonać na ławce.</li>
	<li>Szybko odwiruj 50 μg liofilizowanego białka fuzyjnego NKG2D. Dodać 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu rozpuszczenia proszku i dokładnie wymieszać za pomocą mikropipety P1000.</li>
	<li>Dodać 100 μl białka fuzyjnego NKG2DL do probówki z biotyną, aby uzyskać końcowe stężenie podstawowe 100 μg/ml.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać roztwór, ciągle mieszając go za pomocą mikropipety P100.</li>
	<li>Inkubować roztwór białka fuzyjnego/biotyny w kontrolowanym roztworze RT przez 24 godziny. Białko fuzyjne jest teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
2. Rozmrażanie pierwotnych komórek AML
UWAGA: Około 5 000 000 zamrożonych komórek białaczkowych na pacjenta przechowywanych w ciekłym azocie zostało rozmrożonych, a następnie natychmiast użytych do testów. Komórki białaczkowe zostały pobrane i zamrożone zgodnie z wcześniejszym opisem15. Krótko mówiąc, próbki krwi obwodowej pobrane od pacjentów z AML i wysokim odsetkiem komórek blastycznych (>90% blastów wśród komórek jednojądrzastych) przetworzono z separacją gradientu gęstości w celu uzyskania komórek jednojądrzastych, a następnie zamrożono w płodowej surowicy cielęcej (FCS) zawierającej 10% roztworu dimetylosulfotlenku (DMSO). Liczba komórek bardzo różniła się między pacjentami w zależności od stężenia leukocytów u pacjenta (zakres: 1 000 000 do 30 000 000 komórek białaczkowych na ml krwi).
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzane podłoże RPMI zawierające 10% FCS w temperaturze 37 °C przy użyciu łaźni wodnej. Na każdą fiolkę komórek AML (do 30 000 000 komórek w 1 ml FCS + 10% DMSO) dodaj 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do probówki reakcyjnej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Usunąć kriowial zawierający pierwotną AML z magazynu ciekłego azotu i natychmiast rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Delikatnie przesuwać probówkę w przód i w tył w wodzie, pozwalając zawartości fiolki rozmrozić się do momentu, gdy pozostaną tylko małe kryształki lodu.</li>
	<li>Natychmiast przenieść rozmrożone komórki do probówki zawierającej pożywkę i przepłukać fiolkę przy użyciu 1 ml pożywki.</li>
	<li>Odwirować komórki o sile 300 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Przemyć komórki 5 ml pożywki RPMI zawierającej 10% FCS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut.</li>
</ol>
3. Liczenie komórek
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w znanej objętości podłoża RPMI zawierającego 10% FCS.</li>
	<li>Przenieść niewielką objętość zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozcieńczyć w znanym stosunku błękitem trypanowym lub innym alternatywnym barwnikiem, który umożliwia rozróżnienie żywych komórek od martwych komórek.</li>
	<li>Użyj dowolnego urządzenia, aby policzyć komórki.</li>
	<li>Odwirować komórki o sile 300 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
</ol>
4. Barwienie pierwotnych komórek AML za pomocą biotynylowanego białka fuzyjnego NKG2D
<ol>
	<li>Przygotować bufor barwiący, uzupełniając 500 ml PBS albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) do końcowego stężenia odpowiednio 0,07 mM i 2 mM. W razie potrzeby dostosować pH (7.2–7.4).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy z buforem barwiącym do końcowego stężenia 0,5 x 107 komórek/ml. 
	UWAGA: Opcjonalnie, przed barwieniem, komórki można inkubować ze środkiem blokującym (np. hIgG (1 μg/ml) przez 30 minut w RT lub czynniku blokującym FcR).</li>
	<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U do hodowli komórkowej i odwirować płytkę przy 300 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Przygotować główną mieszankę biotynylowanego białka fuzyjnego NKG2D tak, aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 μl na studzienkę o końcowym stężeniu 10 μg/ml na studzienkę.</li>
	<li>Dodać mieszankę wzorcową przygotowaną w kroku 4.4 za pomocą pipety o pojemności 100 μl i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 300 μl. 
	UWAGA: Zmniejsz końcową objętość zgodnie z liczbą komórek, aby zmniejszyć ilość białka fuzyjnego niezbędnego do barwienia.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórkową przez 25 minut w temperaturze pokojowej lub 50 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 200 μl buforu barwiącego na studzienkę za pomocą wielokanałowej pipety o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7 i 4.8. 
	UWAGA: Opisane tutaj barwienie wykonuje się na 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U z hodowlą komórkową. Dlatego etapy mycia są wykonywane dwukrotnie ze względu na małą objętość takich płyt. Barwienie można również wykonać w innych probówkach, a etapy mycia mogą być wtedy wykonane tylko raz przy użyciu większej objętości.</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową przy użyciu Streptawidyny-PE (patrz tabela 1 dla rozcieńczeń), tak aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 μl. 
	UWAGA: Dodaj przeciwciała selekcyjne dla interesującego Cię typu komórki, jak np. CD33, CD34.... w zakresie przeciwdziałania praniu pieniędzy.</li>
	<li>Dodać mieszankę wzorcową przygotowaną w kroku 4.10 za pomocą pipety o pojemności 100 μl i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Inkubować zawiesiny komórek przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 200 μl buforu barwiącego na studzienkę za pomocą wielokanałowej pipety o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.13 i 4.14.</li>
	<li>Przygotować roztwór buforu barwiącego zawierający 7-AAD (7-aminoaktynomycyna D, 1:1000) lub dowolny odczynnik w celu rozróżnienia żywych i martwych komórek.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórek w 200 μl buforu barwiącego + 7-AAD przygotowanym w kroku 4.16 za pomocą mikropipety wielokanałowej o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki za pomocą urządzenia do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Barwienie pojedynczych lub połączonych pojedynczych przeciwciał anty-NKG2DL
<ol>
	<li>Użyj tej samej zawiesiny komórek, co w kroku 4.2.</li>
	<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U do hodowli komórkowej za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 300 μl i odwirować płytkę przy 300 x g przez 10 minut. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Przygotować główną mieszaninę przeciwciał dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego lub przeciwciał zbiorczych (zob. tabela 2 dla rozcieńczeń), tak aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 μl.</li>
	<li>Dodać mieszankę wzorcową przygotowaną w kroku 5.3 za pomocą pipety o pojemności 100 μl i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 25 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 200 μl buforu barwiącego na studzienkę za pomocą wielokanałowej pipety o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Odwirować 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U w kształcie litery U w rozmiarze 300 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.6 i 5.7.</li>
	<li>Przygotować główną mieszaninę przeciwciał, dodając przeciwciało drugorzędowe (zob. rozcieńczenia w tabeli 2) tak, aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 μl na basenik.</li>
	<li>Dodać mieszankę wzorcową przygotowaną w kroku 5.9 za pomocą pipety o pojemności 100 μl i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć, dodając 200 μl buforu barwiącego do dołka za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 300 μl.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.12 i 5.13.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórkowe w 200 μl buforze barwiącym zawierającym 7-AAD przygotowanym w kroku 4.16.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki za pomocą urządzenia do cytometrii przepływowej, jak opisano w kroku 6.</li>
</ol>
6. Akwizycja danych
UWAGA: Upewnij się, że przeprowadzane są cotygodniowe kontrole jakości cytometru przepływowego, aby upewnić się, że lasery działają prawidłowo. W przypadku przedstawionego tutaj protokołu przeprowadzany jest cotygodniowy proces cytometru i śledzenia (CTS) z odpowiednimi kulkami w celu sprawdzenia wydajności lasera na wszystkich kanałach. Po CTS 10 000 zdarzeń jest rejestrowanych przy użyciu 8-szczytowych koralików jako kontroli wewnętrznej. Wszystkie szczyty powinny znajdować się w tym samym miejscu wewnątrz swoich bram i być dobrze oddzielone od siebie.
<ol>
	<li>Utwórz kompensację matrycy, aby odjąć nakładanie się widma między detektorami za pomocą koralików lub komórek16.</li>
	<li>Nagraj 10 000 zdarzeń dla niebarwionych komórek i pojedynczych barwionych kulek. W przypadku kontroli fluorescencji minus jeden (FMO) należy zarejestrować 50 000 zdarzeń, a w przypadku próbek w pełni wybarwionych do 100 000 zdarzeń. 
	UWAGA: Alternatywnie na komórkach można wykonać pojedyncze barwione próbki. Jeśli tak, upewnij się, że komórki mają dodatni sygnał dla pożądanego markera.</li>
	<li>Pobrać pojedynczą barwioną próbkę komórki lub kulki dla każdego fluoroforu użytego w eksperymencie, aby ujawnić stopień nakładania się widma. Użyj kreatora kompensacji urządzenia do cytometrii przepływowej, aby obliczyć wartości rozlania i zastosować macierz kompensacji do wszystkich mierzonych próbek. 
	UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe nie mogą być używane do tworzenia kompensacji za pomocą kulek, jeśli kompensacja jest obliczana za pomocą kulek. W zależności od rodzaju kulek kompensacyjnych, przeciwciała drugorzędowe nie mogą być używane do kompensacji za pomocą kulek.</li>
	<li>W przypadku kontroli FMO i pełnych próbek barwionych białkiem fuzyjnym, najpierw wybierz komórki na podstawie ich rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). Po wykluczeniu dubletów, bramkuj komórki na podstawie ich ujemności dla sygnału 7-AAD (PercP-Cy5.5), aby wykluczyć martwe komórki (patrz krok 5.15). Ostatni wykres przedstawia ekspresję CD34 (oś Y) i NKG2DL (oś X) na żywych singletach.</li>
	<li>W przypadku pojedynczych przeciwciał anty-NKG2DL należy zastosować tę samą strategię do próbek, ale należy pamiętać, że dodatniość ligandów leży w Alexa Fluor 488, a nie w kanale PE.</li>
	<li>Dostosuj bramki zgodnie z kontrolkami FMO dla strategii bramkowania z kroku 6.4 i 6.5 (patrz Tabela 3), aby uzyskać odpowiednie kontrole FMO do wykonania w tym eksperymencie: W oprogramowaniu analitycznym narysuj bramkę na frakcji ujemnej. Podczas rejestrowania w pełni wybarwionej próbki, komórki powyżej wcześniej utworzonej bramki są dodatnie dla analizowanego markera.</li>
</ol>

<ol><li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+cytotoxicity%3A+how+do+they+pull+the+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li>
<li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+biology%3A+an+update+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li>
<li>Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D%3A+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441(2018).</li>
<li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+and+its+ligands%3A+%22One+for+All%2C+All+for+One%22%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476(2018).</li>
<li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuity+and+the+single+receptor%3A+NKG2D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li>
<li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li>
<li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+signaling+by+inhibitory+receptors%3A+the+NK+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li>
<li>Hüe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+role+for+NKG2D%2FMICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li>
<li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li>
<li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li>
<li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827(2018).</li>
<li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li>
<li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34%28-%29+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li>
<li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells%3A+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy dwie metody cytometrii przepływowej, które mogą wykryć ekspresję powierzchniową NKG2DL na ludzkich pierwotnych komórkach AML. Pokazujemy, że obie metody wykrywania mogą być stosowane w połączeniu z innymi barwieniami przeciwciał (np. wykrywanie ekspresji CD34). Podobne barwienia można również wykonać na innych pierwotnych typach komórek i liniach komórkowych.
Niedawno wykazaliśmy, że brak NKG2DL na powierzchni wybuchów pacjentów z AML może wzbogacić LSC<sup class="x...

Komórki NK są ważnymi efektorami wrodzonego układu odpornościowego, które mogą rozpoznawać i eliminować komórki nowotworowe lub zdrowe komórki zestresowane (np. przez infekcję wirusową) bez wcześniejszej stymulacji antygenowej1. Proces ten jest ściśle regulowany przez złożony repertuar receptorów aktywujących - takich jak naturalne receptory cytotoksyczności (NCR), NKG2D i CD16 - oraz receptory hamujące, które są w dużej mierze reprezentowane przez receptory podobne do zabójczych immunoglobulin (KIR)2. Wiązanie KIR z cząsteczkami ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) klasy I na komórkach somatycznych zapewnia samorozpoznawanie i przenosi tolerancję komórek NK. Z drugiej strony, brak samorozpoznania i zwiększone wiązanie receptorów aktywujących z ich ligandami na komórkach docelowych powoduje uwalnianie cytotoksycznych granulek prowadzących do cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK1. Wreszcie, komórki NK mogą wywierać cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) poprzez wiązanie receptora aktywującego CD16 z celami wyrażającymi część Fc Ig (FcR) 2. Oprócz bezpośredniej cytotoksyczności, komórki NK mogą również wyzwalać uwalnianie cytokin, łącząc wrodzony z adaptacyjnym układem odpornościowym3.
NKG2D jest głównym receptorem aktywującym wyrażającym ekspresję na limfocytach T NK, NKT, γδ i naiwnych limfocytach T CD8+4, który umożliwia takim cytotoksycznym komórkom odpornościowym rozpoznawanie i lizę ligandu NKG2D (NKG2DL) wyrażającego komórki docelowe. Zdrowe komórki często nie wykazują ekspresji NKG2DL. Zamiast tego ekspresja NKG2DL jest regulowana w górę na złośliwych lub zakażonych wirusem komórkach, aby były one podatne na klirens immunologiczny5.
Ludzka rodzina NKG2DL składa się z ośmiu znanych cząsteczek, wśród których dwie cząsteczki związane z łańcuchem MHC I A i B (MICA i MICB6) oraz białka wiążące UL16 wirusa cytomegalii 1–6 (ULBP1-67). Ekspresja NKG2DL jest regulowana na poziomie transkrypcyjnym, potranskrypcyjnym i potranslacyjnym8. W związku z tym, podczas gdy ekspresja NKG2DL jest zwykle niewykrywalna na powierzchni zdrowych komórek, NKG2DL mRNA9 i wewnątrzkomórkową ekspresję białka odnotowano w zdrowych tkankach. Funkcjonalne znaczenie takiego wyrażenia i mechanizmy leżące u podstaw takich rozbieżnych wzorców wyrażeń pozostają do zdefiniowania10.
Mechanistyczna regulacja ekspresji NKG2DL w komórkach nowotworowych jest fascynującym obszarem badań. Szlaki, o których wiadomo, że są zaangażowane w stres komórkowy, np. szlak stresu szoku cieplnego9, lub szlaki związane z uszkodzeniem DNA, takie jak zmutowana ataksja teleangiektazyjna (ATM) i ścieżka związana z Rad3 (ATR)11, a także infekcje wirusowe lub bakteryjne, zostały bezpośrednio powiązane z indukcją ekspresji NKG2DL12. Jednak nawet jeśli ekspresja powierzchniowa NKG2DL została skutecznie indukowana, ekspresja ta może zostać ponownie utracona przez wydalanie za pośrednictwem proteolizy, mechanizm związany z ucieczką immunologiczną i złym rokowaniem klinicznym w niektórych nowotworach13.
Brak powierzchni komórkowej NKG2DL może również odgrywać ważną rolę u pacjentów z AML. W tym przypadku leczenie intensywną chemioterapią często wywołuje remisję, ale często dochodzi do nawrotu z białaczkowych komórek macierzystych (LSC), które selektywnie przeżywają chemioterapię i unikają odpowiedzi immunologicznej. Jak ostatnio pokazaliśmy, LSC, na przykład, unikają lizy komórek NK poprzez tłumienie wyrażenia powierzchniowego NKG2DL14.
Odwrotnie, brak powierzchniowej ekspresji NKG2DL może być wykorzystany jako metoda do identyfikacji i realnego izolowania przypuszczalnych subpopulacji komórek podobnych do łodyg z masowych subpopulacji białaczkowych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do cytometrii przepływowej, które można wykorzystać do wykrywania ekspresji powierzchniowej NKG2DL, a tym samym identyfikacji komórek macierzystych NKG2DL ujemnych w białaczce, a być może także w innych nowotworach: metoda rozpoznawania powierzchni pan-liganda oraz metoda polegająca na barwieniu pojedynczymi lub zbiorczymi przeciwciałami rozpoznającymi poszczególne znane białka NKG2DL.

<table><tbody><tr><td>7-amminoaktynomycyna D (7-AAD)</td><td>Invitrogen</td><td>A1310</td><td>Barwnik żywotności</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka U dno</td><td>Sarstedt</td><td>833925500</td><td>96 dołkowa płytka do naszego cytometru przepływowego</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human cd34</td><td>BD</td><td>555824</td><td>Przeciwciało wykrywające CD34 RRID: AB_398614</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1391,0050</td><td>Składnik barwienia Bufor</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td>Składnik buforu barwiącego</td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>BioConcept</td><td>2-01F10-I</td><td>Składnik suplementowanej pożywki</td></tr><tr><td>RPMI FlowJo 10.2</td><td>BD/</td><td></td><td>Oprogramowanie umożliwiające analizę danych do eksperymentu cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Kozio- anty-królicze IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21222</td><td>Przeciwciało drugorzędowe wykrywające przeciwciała pierwszorzędowe dla MICA i MICB RRID: AB_1037853</td></tr><tr><td>Ludzkie białko chimery NKG2D Fc, CF</td><td>R& D</td><td>1299-NK-050</td><td>Białko fuzyjne wykrywające wszystkie NKG2DLs RRID:</td></tr> <tr><td>Ludzkie przeciwciało ULBP-1</td><td>R& D</td><td>AF1380</td><td>Przeciwciało wykrywające ULBP1 RRID: AB_354765</td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało ULBP-2/5/6</td><td>R& D</td><td>AF1298</td><td>Przeciwciało wykrywające ULBP2/5/6 RRID: AB_354725</td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało ULBP-3</td><td>R& D</td><td>AF1517</td><td>Przeciwciało wykrywające ULBP3 RRID: AB_354835</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne MICA</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-35346</td><td>Przeciwciało wykrywające MICA RRID: AB_2552656</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne MICB</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-66698</td><td>Przeciwciało wykrywające MICB RRID: AB_2663413</td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw do biotynylacji przeciwciał 1 pasek, do 8 reakcji</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-093-385</td><td>Zestaw do biotynylacji białka fuzyjnego NKG2DL</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Składnik buforu barwiącego</td></tr><tr><td>Królik anty-kozi IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11034</td><td>Przeciwciało drugorzędowe wykrywające przeciwciała pierwszorzędowe dla ULBPs RRID: AB_2576217</td></tr><tr><td>Tęczowe cząstki kalibracyjne (8-pikowe) 3,0 um</td><td>Spherotech Inc.</td><td>RCP-30-20A</td><td>Koraliki używane do konserwacji urządzenia do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Pożywka RPMI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>RayBright Uniwersalne koraliki kompensacyjne</td><td>Raybiotech</td><td>137-00013-100</td><td>Koraliki używane do tworzenia matrycy kompensacyjnej</td></tr><tr><td>Streptawidyna, koniugat R-fikoerytryny (SAPE) - 1 mg / ml</td><td>Invitrogen</td><td>S866</td><td>Etap Seondary do wykrywania biotynylowanego białka fuzyjnego NKG2DL</td></tr></tbody></table>

dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda nkg2d w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

U tego samego pacjenta wykazano brak ekspresji powierzchniowej ligandów NKG2D (NKG2DL), aby odróżnić subpopulacje białaczkowe o właściwościach komórek macierzystych (tzw. białaczkowe komórki macierzyste, LSC) od bardziej zróżnicowanych odpowiedników komórek białaczkowych, które nie mają potencjału inicjacji choroby, chociaż mają podobne mutacje genetyczne specyficzne dla białaczki. NKG2DL to biochemicznie wysoce zróżnicowane automolekuły MHC klasy I. Zdrowe komórki w warunkach homeostazy na ogół nie wykazują ekspresji NKG2DL na powierzchni komórki. Zamiast tego ekspresja tych ligandów jest indukowana po wystawieniu na stres komórkowy (np. Transformacja onkogenna lub bodźce zakaźne) w celu wywołania eliminacji uszkodzonych komórek poprzez lizę przez komórki odpornościowe eksprymujące receptor NKG2D, takie jak komórki NK (NK). Co ciekawe, ekspresja powierzchniowa NKG2DL jest selektywnie tłumiona w subpopulacjach LSC, co pozwala tym komórkom uniknąć nadzoru immunologicznego za pośrednictwem NKG2D. W tym miejscu przedstawiamy równoległą analizę dwóch różnych metod cytometrii przepływowej, które pozwalają na badanie ekspresji powierzchniowej NKG2DL na komórkach nowotworowych, tj. metody polegającej na rozpoznawaniu pan-ligandów oraz metody polegającej na barwieniu wieloma przeciwciałami przeciwko pojedynczym ligandom. Metody te można zastosować do oddzielenia żywotnych subpopulacji komórkowych NKG2DL ujemnych o przypuszczalnych właściwościach rakowych komórek macierzystych od NKG2DL dodatnich nie-LSC.

Oba przedstawione tutaj protokoły umożliwiają wzbogacenie populacji AML LSC za pomocą analizy cytometrycznej z wykorzystaniem CD34, znanego markera LSC17, w połączeniu z ekspresją powierzchniową NKG2DL, poprzez zastosowanie rozpoznawania pan-ligandów lub barwienia pulą przeciwciał przeciwko poszczególnym ligandom. Na Rysunku 1 pokazujemy, że analizowane próbki AML są dodatnie pod kątem CD34 i NKG2DL, ale istnieją również subpopulacje ujemne, co wykazuje obecność łączn...

Prezentujemy dwa różne protokoły barwienia do wykrywania ligandów NKG2D (NKG2DL) w próbkach ludzkiej pierwotnej ostrej białaczki szpikowej (AML). Pierwsze podejście opiera się na białku fuzyjnym, zdolnym do rozpoznania wszystkich znanych i potencjalnie jeszcze nieznanych ligandów, podczas gdy drugi protokół opiera się na dodaniu wielu przeciwciał anty-NKG2DL.

Dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda NKG2D w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Protokół ten pokazuje dwa różne sposoby wykrywania NKG2DL na powierzchni komórek AML. Technika ta zapewnia szybką, przyjazną dla użytkownika metodę barwienia w celu wykrycia wszystkich znanych i prawdopodobnie nieznanych NKG2DL. Metoda ta pozwala na oddzielenie białaczkowych komórek macierzystych od masowych komórek AML, co umożliwia dalszą charakterystykę tych komórek.Rozpocznij od rozmrożenia biotyny i probówek z białkiem fuzyjnym NKG2D w temperaturze pokojowej. Szybko odwiruj proszek NKG2D FC, a następnie dodaj 500 mikrolitrów PBS w celu rozpuszczenia proszku i dokładnie wymieszaj za pomocą mikropipety P-1000. Dodać 100 mikrolitrów białka fuzyjnego NKG2DL do probówki z biotyną, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr i dokładnie wymieszać roztwór za pomocą mikropipety P-100.Aby rozmrozić komórki AML, należy usunąć kriowial zawierający pierwotny AML z magazynu ciekłego azotu i natychmiast umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie przesuwać probówkę w przód i w tył w wodzie, pozwalając zawartości fiolki rozmrozić się do momentu, gdy pozostaną tylko małe kryształki lodu. Natychmiast przenieść rozmrożone komórki do probówki zawierającej pożywkę i przepłukać fiolkę jednym mililitrem pożywki.Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Umyj komórki pięcioma mililitrami pożywki RPMI zawierającej 10% FCS i powtórz wirowanie. Zawiesić osad komórkowy z buforem barwiącym do końcowego stężenia 0,5 razy 10 do siódmych komórek na mililitr.Następnie przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U do hodowli komórkowej i odwirować płytkę w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Przygotować główną mieszankę biotynylowanego białka fuzyjnego NKG2D, tak aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 mikrolitrów na studzienkę z końcowym stężeniem NKG2D wynoszącym 10 mikrogramów na mililitr na studzienkę.Dodaj przygotowaną mieszankę wzorcową i ponownie zawieś granulki komórek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Inkubować i odwirować płytkę zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Przygotować mieszankę wzorcową przy użyciu streptawidyny PE, tak aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 mikrolitrów.Dodaj mieszankę wzorcową do komórek i ponownie zawieś granulki za pomocą wielokanałowej pipety o pojemności 300 mikrolitrów. Po odwirowaniu płytki i odrzuceniu supernatantu, użyj wielokanałowej mikropipety o pojemności 300 mikrolitrów, aby ponownie zawiesić granulki komórek w 200 mikrolitrach buforu barwiącego plus 7-AAD. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą urządzenia do cytometrii przepływowej.Analizowane próbki AML są dodatnie dla CD34 i NKG2DL, ale istnieją również subpopulacje ujemne, w sumie z czterema różnymi populacjami. Typowa strategia bramkowania rozpoczyna się od wyboru głównej populacji komórek za pomocą ich FSC i SSC. Dublety i martwe komórki są wykluczane z dalszej analizy.Bramki są regulowane za pomocą elementów sterujących FMO, aby zapewnić prawidłową identyfikację komórek dodatnich. Podkreślono tutaj intensywność fluorescencji komórek dodatnich dla CD34 w porównaniu z NKG2DL. Komórki AML, które są dodatnie dla CD34, wykazują niższą ekspresję powierzchniową NKG2DL, co wskazuje, że ekspresja NKG2DL jest związana z brakiem łodygi.Trzy pierwotne próbki AML wykazały 19,8, 49,8 i 89,4% pozytywnych zdarzeń dla barwienia białka fuzyjnego w porównaniu z 20,4, 50,4 i 90,6% dla zbiorczego barwienia przeciwciałami anty-NKG2DL. Z drugiej strony, barwienie pojedynczym ligandem wykazało szereg pozytywnych zdarzeń do 92%, przy czym wartości procentowe różniły się w zależności od liganda. Próbując tej metody, bardzo ważne jest, aby zachować szybkość podczas rozmrażania pierwotnych komórek AML, ponieważ są one delikatne i mogą łatwo umrzeć na tym etapie.Po wykonaniu tego protokołu można przeprowadzić sortowanie komórek na podstawie sygnału NKG2DL w celu dalszego zbadania populacji.

two-flow-cytometric-approaches-nkg2d-ligand-surface-detection-to

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Poznaj dwie metody cytometrii przepływowej do wykrywania ligandów NKG2D na powierzchni komórek AML. Techniki te umożliwiają separację komórek macierzystych leukemii od masowych komórek AML w celu dalszej charakterystyki.

Dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda NKG2D w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej (Wideo) | JoVE Journal

Dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda NKG2D w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej

Przeglądaj więcej filmów