Dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda NKG2D w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej
21 lutego 2021
Prezentujemy dwa różne protokoły barwienia do wykrywania ligandów NKG2D (NKG2DL) w próbkach ludzkiej pierwotnej ostrej białaczki szpikowej (AML). Pierwsze podejście opiera się na białku fuzyjnym, zdolnym do rozpoznania wszystkich znanych i potencjalnie jeszcze nieznanych ligandów, podczas gdy drugi protokół opiera się na dodaniu wielu przeciwciał anty-NKG2DL.
Protokół ten pokazuje dwa różne sposoby wykrywania NKG2DL na powierzchni komórek AML. Technika ta zapewnia szybką, przyjazną dla użytkownika metodę barwienia w celu wykrycia wszystkich znanych i prawdopodobnie nieznanych NKG2DL. Metoda ta pozwala na oddzielenie białaczkowych komórek macierzystych od masowych komórek AML, co umożliwia dalszą charakterystykę tych komórek.
Rozpocznij od rozmrożenia biotyny i probówek z białkiem fuzyjnym NKG2D w temperaturze pokojowej. Szybko odwiruj proszek NKG2D FC, a następnie dodaj 500 mikrolitrów PBS w celu rozpuszczenia proszku i dokładnie wymieszaj za pomocą mikropipety P-1000. Dodać 100 mikrolitrów białka fuzyjnego NKG2DL do probówki z biotyną, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr i dokładnie wymieszać roztwór za pomocą mikropipety P-100.
Aby rozmrozić komórki AML, należy usunąć kriowial zawierający pierwotny AML z magazynu ciekłego azotu i natychmiast umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie przesuwać probówkę w przód i w tył w wodzie, pozwalając zawartości fiolki rozmrozić się do momentu, gdy pozostaną tylko małe kryształki lodu. Natychmiast przenieść rozmrożone komórki do probówki zawierającej pożywkę i przepłukać fiolkę jednym mililitrem pożywki.
Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Umyj komórki pięcioma mililitrami pożywki RPMI zawierającej 10% FCS i powtórz wirowanie. Zawiesić osad komórkowy z buforem barwiącym do końcowego stężenia 0,5 razy 10 do siódmych komórek na mililitr.
Następnie przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U do hodowli komórkowej i odwirować płytkę w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Przygotować główną mieszankę biotynylowanego białka fuzyjnego NKG2D, tak aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 mikrolitrów na studzienkę z końcowym stężeniem NKG2D wynoszącym 10 mikrogramów na mililitr na studzienkę.
Dodaj przygotowaną mieszankę wzorcową i ponownie zawieś granulki komórek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Inkubować i odwirować płytkę zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Przygotować mieszankę wzorcową przy użyciu streptawidyny PE, tak aby komórki zostały ponownie zawieszone w końcowej objętości 50 mikrolitrów.
Dodaj mieszankę wzorcową do komórek i ponownie zawieś granulki za pomocą wielokanałowej pipety o pojemności 300 mikrolitrów. Po odwirowaniu płytki i odrzuceniu supernatantu, użyj wielokanałowej mikropipety o pojemności 300 mikrolitrów, aby ponownie zawiesić granulki komórek w 200 mikrolitrach buforu barwiącego plus 7-AAD. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą urządzenia do cytometrii przepływowej.
Analizowane próbki AML są dodatnie dla CD34 i NKG2DL, ale istnieją również subpopulacje ujemne, w sumie z czterema różnymi populacjami. Typowa strategia bramkowania rozpoczyna się od wyboru głównej populacji komórek za pomocą ich FSC i SSC. Dublety i martwe komórki są wykluczane z dalszej analizy.
Bramki są regulowane za pomocą elementów sterujących FMO, aby zapewnić prawidłową identyfikację komórek dodatnich. Podkreślono tutaj intensywność fluorescencji komórek dodatnich dla CD34 w porównaniu z NKG2DL. Komórki AML, które są dodatnie dla CD34, wykazują niższą ekspresję powierzchniową NKG2DL, co wskazuje, że ekspresja NKG2DL jest związana z brakiem łodygi.
Trzy pierwotne próbki AML wykazały 19,8, 49,8 i 89,4% pozytywnych zdarzeń dla barwienia białka fuzyjnego w porównaniu z 20,4, 50,4 i 90,6% dla zbiorczego barwienia przeciwciałami anty-NKG2DL. Z drugiej strony, barwienie pojedynczym ligandem wykazało szereg pozytywnych zdarzeń do 92%, przy czym wartości procentowe różniły się w zależności od liganda. Próbując tej metody, bardzo ważne jest, aby zachować szybkość podczas rozmrażania pierwotnych komórek AML, ponieważ są one delikatne i mogą łatwo umrzeć na tym etapie.
Po wykonaniu tego protokołu można przeprowadzić sortowanie komórek na podstawie sygnału NKG2DL w celu dalszego zbadania populacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia dwie odrębne metody barwienia służące do wykrywania ligandów NKG2D (NKG2DLs) w pierwotnych próbkach ludzkiej ostrej białaczki szpiczastej (AML). Techniki te umożliwiają oddzielenie białaczkowych komórek macierzystych od populacji komórek AML w celu ich dalszej charakterystyki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Onkologia
Wstęp
- Ligandy NKG2D są istotne dla rozpoznawania immunologicznego w nowotworach.
- Ostra białaczka szpikowa (AML) stwarza trudności w charakterystyce komórek.
- Obecne metody mogą nie odróżniać skutecznie białaczkowych komórek macierzystych.
- Nowe protokoły barwienia mogą zwiększyć możliwości detekcji.
Cel badania
- Opracowanie wydajnych protokołów barwienia w celu wykrywania NKG2DL.
- Ułatwienie separacji leukemicznych komórek macierzystych z populacji komórek AML.
- Poprawa charakteryzacji próbek AML.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie białka fuzyjnego do rozpoznawania NKG2DLs.
- Zastosowanie wielu przeciwciał anty-NKG2DL.
- Rozmrażanie i rekonstytucja biotyny oraz białka fuzyjnego NKG2D.
- Mieszanie roztworów w celu uzyskania pożądanych stężeń do barwienia.
Główne wyniki
- Oba protokoły skutecznie wykrywają znane i nieznane ligandy NKG2DL.
- Osiągnięto separację leukemicznych komórek macierzystych z ogólnej populacji komórek AML.
- Metody są szybkie i przyjazne dla użytkownika.
- Możliwa jest rozszerzona charakterystyka komórek AML.
Wnioski
- Nowe protokoły barwienia poprawiają detekcję NKG2DLs.
- Metody te mogą pomóc w zrozumieniu biologii AML.
- Dalsze badania mogą opierać się na tych technikach w celu uzyskania wglądu w aspekty terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Odróżnienie białaczkowych komórek macierzystych od ogólnych populacji AML pozostaje krytycznym wyzwaniem w walidacji celów terapeutycznych oraz opracowywaniu modeli przedklinicznych. Zdolność do izolowania subpopulacji negatywnych pod kątem NKG2DL, wykazujących właściwości komórek macierzystych, umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w hipotezach terapeutycznych i zwiększa pewność prognostyczną w wczesnych etapach procesów odkrywania leków. Podejście to bezpośrednio wpływa na selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację systemów istotnych dla przebiegu choroby o wyższym potencjale tumorigennym.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację leukemicznych komórek macierzystych na podstawie ekspresji powierzchniowej NKG2DL.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybką i łatwą w użyciu metodę odróżniania subpopulacji o charakterze macierzystym od zróżnicowanych komórek AML.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację właściwości komórek macierzystych w frakcjach negatywnych pod kątem NKG2DL.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty z cytometrii przepływowej w celu porównania ekspresji NKG2DL przy zastosowaniu metod barwienia specyficznego dla poszczególnych ligandów oraz barwienia pan-ligandowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, standaryzowane protokoły barwienia kompatybilne z przygotowaniem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszego screeningu związków oraz badań nad zaangażowaniem celu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia dopasowanie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie supresji NKG2DL z mechanizmami ucieczki immunologicznej w LSC.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie izolacji komórek inicjujących chorobę.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych dzięki wykorzystaniu statusu NKG2DL do stratyfikacji subpopulacji AML o różnym potencjale tumorigennym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – umożliwiając izolację subpopulacji zdefiniowanych mechanistycznie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez oddzielenie LSC ujemnych pod kątem NKG2DL od komórek AML dodatnich pod kątem NKG2DL.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanej, ilościowej detekcji powierzchniowej, kompatybilnej z platformami przesiewowymi opartymi na cytometrii przepływowej.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar zmiennych zależnych (procent zdarzeń dodatnich, intensywność fluorescencji), co pozwala na porównanie metod barwienia i częstości występowania subpopulacji.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie izolacji LSC do walidacji funkcjonalnej w modelach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody wzbogacania komórek macierzystych, którą można zastosować w próbkach AML i dostosować do innych typów nowotworów o podobnych mechanizmach ucieczki immunologicznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie wzbogacania komórek macierzystych, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w identyfikacji LSC.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność detekcji NKG2DL w wielu próbkach AML.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go w walidacji celów, efektywność kapitałowa dzięki wczesnej redukcji ryzyka, zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów skorygowana o ryzyko, oparta na potencjale wzbogacania LSC i fenotypie ucieczki immunologicznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu cytometrii przepływowej, barwienia komórek oraz obchodzenia się z pierwotnymi próbkami AML.
- Metoda zależy od dostępu do cytometrów przepływowych, sprzętu do wirowania oraz odczynników, w tym biotyny, białka fuzyjnego NKG2D, streptawidyny PE oraz 7-AAD.
- Konieczna jest standaryzacja strategii bramkowania, kontroli FMO oraz ustawień kompensacji w ramach zespołów w celu uzyskania spójnych wyników.
- Przy zastosowaniu w różnych systemach modelowych należy uwzględnić konieczność adaptacji ze względu na zmienność wzorców ekspresji NKG2DL.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość pierwotnych komórek AML podczas rozmrażania, co wymaga szybkiego opracowania w celu utrzymania żywotności.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
