Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

Protokół ten może być stosowany do inaktywacji genów chromosomowych w celu wyizolowania mutantów do badania funkcji genów i bakterii. Sprawia, że proces rekombinacji homologicznej jest prosty, szybki i wysoce wydajny. Korzystając z tej techniki, geny patogenu związane z wirulencją mogą zostać usunięte w celu uzyskania atenuowanego mutanta, który może być wykorzystany jako kandydat na atenuowaną szczepionkę.

Zacznij od amplifikacji kasety chloramfenikolu zawierającej hemologiczne fragmenty genu micC. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu do amplifikacji kasety chloramfenikolu z plazmidu PKD3, w tym 50 rozszerzeń homologii par zasad z pięciu pierwszych i trzech pierwszych końców genu micC. Wykonaj PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, używając plazmidu PKD3 jako matrycy do amplifikacji kasety z chloramfenikolem.

Określ wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Następnie należy oczyścić produkt za pomocą zestawu do odzyskiwania żelu DNA i określić stężenie DNA za pomocą spektrofotometrii. Przeprowadź drugą reakcję PCR w celu wyeliminowania interferencji dalszej rekombinacji przez plazmid PKD3.

Rozcieńczyć pierwszy produkt PCR w stosunku od 1 do 200 i użyć go jako matrycy dla wtórnego PCR. Aby skonstruować pierwszy rekombinowany szczep 50336 delta micC dot cat, wymieszaj 100 mikrolitrów kompetentnych komórek SE 50336 z pięcioma mikrolitrami plazmidu PKD 46 i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wstrząs termiczny mieszaniny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 90 sekund i szybko przenieś ją z powrotem na lód na dwie minuty, aby przekształcić plazmid w komórki.

Przesiewaj dodatnie kolonie, hodując komórki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza na płytce opornej na ampicylinę. Następnego dnia dodać 30 mili więcej L arabinozy do płynnej kultury SE 50336 PKD 46 i wywołać ekspresję rekombinazy przez godzinną inkubację w temperaturze 30 stopni Celsjusza podczas wstrząsania. Wymieszaj 100 nanogramów oczyszczonego produktu PCR i 40 mikrolitrów kompetentnych komórek SE 50336 PKD 46 w kubku na wstrząs elektryczny.

Następnie przeprowadź transformację porażenia prądem. Po elektrotransformacji przenieś mieszaninę do jednego mililitra pożywki SOC i inkubatora kultur z wytrząsaniem przy 150 obr./min i 30 stopniach Celsjusza przez godzinę. Rozprowadź mieszaninę na płytce LB odpornej na chloramfenikol i poprowadź kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby przesiać pod kątem dodatnich kolonii.

Hoduj dodatnie kolonie w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie przebadaj kolonię pod kątem wrażliwości na ampicylinę i odporności na chloramfenikol w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby uzyskać pierwszy rekombinowany szczep bez PKD 46. Po ekstrakcji genomowego DNA kota 50336 Delta micC dot cat za pomocą PCR i elektroforezy żelowej, galwanizuj 100 nanogramów plazmidu PCP 20 do 40 mikrolitrów 50336 Delta micC dot cat kompetentnych komórek.

Przesiewaj transformanty dodatnie zarówno na płytkach odpornych na ampicylinę, jak i chloramfenikol w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Przenieś dodatnie transformanty do nieodpornego płynnego podłoża LB i hoduj je przez noc w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie wyizoluj pojedyncze kolonie na płytce LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wybierz kolonię, która jest wrażliwa zarówno na ampicylinę, jak i chloramfenikol. Ten mutant to mutant delecji micC SE 50336 Delta micC. Sprawdź 50336 Delta micC, wykonując PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

Protokół ten został użyty do skonstruowania mutanta delecji 50336 Delta micC w komplementowanym mutancie 50336 Delta micC, pmicC. Pierwszy rekombinowany kot kropkowy 50336 Delta micC został zwalidowany metodą PCR z oczekiwaną wielkością pasma około 1200 par zasad produktów PCR z insercją chloramfenikolu w porównaniu z 279 parami zasad w szczepie typu dzikiego. W drugiej rekombinacji kaseta chloramfenikolu została wyeliminowana przez PCP 20.

Wyniki PCR w połączeniu z sekwencjonowaniem potwierdziły, że izogeniczny mutant micC został pomyślnie skonstruowany. Ekspresję genów ompA, ompC i ompD w szczepach 50336, 50336 Delta micC i 50336 delta micC pmicC analizowano metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Transkrypcja ompA i ompC oraz 50336 delta micC wzrosła około 2,2-krotnie i trzykrotnie w porównaniu ze szczepem typu dzikiego.

Podczas gdy transkrypcja ompD wzrosła tylko nieznacznie. Testy LD 50 wykazały, że po zakażeniu sześcio- do ośmiotygodniowych myszy BALB / c każdym z trzech szczepów, większość myszy zakażonych 50336 Delta micC wykazywała znużenie, brak apetytu lub biegunkę 48 godzin po zakażeniu i zmarła po 96 godzinach. Myszy zakażone szczepem typu dzikiego i 50336 delta micC pmicC wykazywały te same objawy 72 godziny po zakażeniu i zmarły po 120 godzinach.

LD 50 trzech szczepów wskazały, że zjadliwość zmutowanego 50336 Delta micC wzrosła 2,5-krotnie w porównaniu z typem dzikim. Technika ta pomaga naukowcom badać funkcję genów bakteryjnych i uzyskiwać pożądany zmodyfikowany szczep poprzez usuwanie genów docelowych.