Name: Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj metodę usuwania genu micC w Salmonella enteritidis za pomocą systemu rekombinacji λ-Red. Technika ta umożliwia szybkie i efektywne inaktywowanie genów chromosomalnych w badaniach mikrobiologicznych oraz poszukiwanie kandydatów na szczepionki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Chińskiej Narodowej Fundacji Nauki (nr 31972651 i 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), Projektu Finansowanego przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (PAPD).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Narodowej Rady ds. Badań Naukowych. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Yangzhou zatwierdził wszystkie eksperymenty i procedury stosowane na zwierzętach (SYXK2016-0020).
1. Szczepy bakterii, plazmidy i warunki hodowli
<ol>
	<li>Użyj bakterii i plazmidów wymienionych w Tabeli 1.</li>
	<li>Hodowla bakterii w bulionie LB lub na płytkach agarowych LB w temperaturze 37 °C, w obecności 50 μg/ml ampicyliny (Amp), jeśli jest to właściwe.</li>
	<li>Szczepy hodowlane zawierające plazmidy wrażliwe na temperaturę stosuje się do budowy mutantów delecyjnych w temperaturze 30 °C.</li>
</ol>
2. Klon genu micC S. Szczep Enteritidis 50336
<ol>
	<li>Na podstawie sekwencji przed i za genem micC S. Szczep Typhimurium SL1344, projektuje startery vmicC-F i vmicC-R do amplifikacji fragmentu zawierającego gen micC metodą PCR przy użyciu SE50336 genomowego DNA jako matrycy.</li>
	<li>Zmieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl starterów vmicC-F i vmicC-R, odpowiednio, 5 μl matrycy, 1 μl polimerazy Taq DNA i 35 μl ddH2O razem do PCR.</li>
	<li>Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 53 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
	<li>Sekwencjonować produkt PCR, aby uzyskać sekwencję genu micC.</li>
</ol>
3. Budowa mutanta delecji micC
UWAGA: Mutant micC-ujemny szczepu Salmonella Enteritidis 50336 został skonstruowany przy użyciu rekombinacji za pośrednictwem λ-Red, jak opisano wcześniej13,14. Stosowane startery są wymienione w tabeli 2.
<ol>
	<li>Amplifikacja kasety chloramfenikolu zawierającej fragmenty homologii genu micC.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery micC-F i micC-R do amplifikacji kasety chloramfenikolu (Cm) z plazmidu pKD3, w tym rozszerzeń homologii 50 pz z 5' i 3' genu micC.</li>
		<li>Wyodrębnij plazmid pKD3 jako matrycę PCR.</li>
		<li>Zmieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl odpowiednio starterów micC-F i micC-R, 5 μl matrycy, 1 μl polimerazy Taq DNA i 35 μl ddH2O razem jako mieszaninę reakcyjną PCR</li>
		<li>Amplifikować kasetę Cm w następujących warunkach reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 1 min, 52 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 minutę przez 10 cykli; 94 °C przez 1 min, 63 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli, i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
		<li>Wykryj wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Oczyść i odzyskaj produkt PCR za pomocą zestawu do odzyskiwania żelu DNA i określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. 
		UWAGA: PCR należy przeprowadzić dwukrotnie. Pierwszy produkt PCR rozcieńczono w stosunku 1:200 i użyto jako matrycy do wtórnego PCR, w celu wyeliminowania interferencji dalszej rekombinacji przez plazmid pKD3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj 1st rekombinowany szczep 50336ΔmicC::cat
	<ol>
		<li>Wymieszać równomiernie 100 μl SE50336 kompetentnych komórek z 5 μl plazmidu pKD46 i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny powyższej mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 90 s i szybko przenieść mieszaninę do lodu na 2 minuty, aby przekształcić plazmid pKD46 w SE50336. Przesiewać dodatnie kolonie, hodując je przez noc w temperaturze 30 °C na płytce odpornej na Amp (50 μg/ml).</li>
		<li>Dodać 30 mM L-arabinozy do płynnej kultury SE50336/pKD46 i indukować ekspresję rekombinazy przez kulturę wstrząsającą w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę. Następnie przygotuj kompetentne komórki.</li>
		<li>Wymieszać 100 ng oczyszczonego produktu PCR (krok 3.1) i 40 μl kompetentnych komórek SE50336/pKD46 w kubku na wstrząs elektryczny (np. Bio-Rad). Przeprowadzić transformację porażeniową o parametrach napięcia 1,8 kV, impulsu 25 μF i rezystancji 200 Ω.</li>
		<li>Po elektrotransformacji przenieść mieszaninę do 1 ml pożywki SOC i kultury wstrząsającej przy 150 obr./min i temperaturze 30 °C przez 1 godzinę. Następnie rozsmarować mieszaninę na płytce LB odpornej na Cm (34 μg/ml) i wyhodować ją w temperaturze 37 °C przez noc w celu przesiewu kolonii dodatniej.</li>
		<li>Hodować wyżej wymienioną dodatnią kolonię w temperaturze 42 °C przez 2 godziny. Przesiać kolonię, która jest wrażliwa na Amp (50 μg/ml), ale odporna na Cm (34 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez noc, aby uzyskać pierwszy rekombinowany szczep bez pKD46.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj pierwszy rekombinowany szczep 50336ΔmicC::Cat.
	<ol>
		<li>Ekstrakt 50336ΔmicC::Cat genomowe DNA jako matryca PCR. Użyj tych samych składników reakcji PCR, co w kroku 2.1. Przeprowadzić reakcję PCR w takich samych warunkach, jak w kroku 2.1.</li>
		<li>Wykryj wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i zsekwencjonuj produkt PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj mutanta delecyjnego 50336ΔmicC.
	<ol>
		<li>Elektroporować 100 ng plazmidu pCP20 do 40 μl 50336ΔmicC::Kompetentne ogniwa Cat o parametrach napięcia 1,8 kV, impulsu 25 μF i rezystancji 200 Ω, ekranować transformanty dodatnie na płytce o odporności na Amp (50 μg/mL) i Cm (34 μg/ml) w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Przenieść powyżej dodatnich transformantów do nieopornych LB i hodować je przez noc w temperaturze 42 °C, a następnie wyizolować pojedyncze kolonie na płytce LB w temperaturze 37 °C. Wybierz kolonię, która jest wrażliwa zarówno na Amp, jak i Cm. Ten mutant to mutant delecji micC SE50336ΔmicC.</li>
		<li>Sprawdź 50336ΔmicC metodą PCR.
		<ol>
			<li>Wyodrębnij genomowe DNA 50336ΔmicC jako matrycę PCR. Zmieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl startera vmicC-F, 1 μl startera vmicC-R, 5 μl matrycy, 1 μl polimerazy DNA Taq i 35 μl ddH2O razem do PCR.</li>
			<li>Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 53 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Budowa szczepu uzupełnionego micC
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery pBR-micC-F i pBR-micC-R z miejscami restrykcyjnymi NheI i SalI.
	<ol>
		<li>Amplifikować pełnowymiarowy gen micC sekwencjami bocznymi za pomocą mieszaniny reakcyjnej PCR, która zawiera 5 μl SE50336 genomowego DNA jako matrycę, startery 1 μl pBR-micC-F i 1 μL pBR-micC-R jako startery, 5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 2 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM) i 35 μL ddH2O.</li>
		<li>Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 52 °C przez 50 s, 72 °C przez 1 minutę przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min. Oczyść i odzyskaj produkt PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić produkt PCR i plazmid pBR322 odpowiednio przy użyciu enzymu restrykcyjnego NheI i SalI, a następnie lichlorować je za pomocą ligazy T4 w temperaturze 16 °C przez noc w celu uzyskania plazmidu pBR322-micC.</li>
	<li>Przekształć pBR322-micC w kompetentne komórki SE50336ΔmicC i przesiewaj dodatni transformant, aby uzyskać uzupełniony szczep SE50336ΔmicC/pmicC. Ekstrahuj plazmid pBR322-micC z uzupełnionego szczepu i zweryfikuj go przez trawienie i sekwencjonowanie enzymów restrykcyjnych.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Kultura SE50336, 50336ΔmicC i 50336ΔmicC/pmicC w pożywce LB przez noc w temperaturze 24 °C z 180 obr./min, wstrząsając do OD600 2,0. Zebrać kulturę bakteryjną przez odwirowanie z prędkością 13000 obr./min przez 2 min.</li>
	<li>Ekstrahować całkowite RNA za pomocą odczynnika TRIzol. Inkubować 50 μl wyizolowanego RNA z 2 μl DNazyI i 6 μl 10-krotnego buforu w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu usunięcia DNA. Oznaczyć ilość RNA, pipetując 1 μl próbki RNA do mikrospektrofotometru.</li>
	<li>Synteza cDNA
	<ol>
		<li>Użyj 1 μg całkowitego RNA do syntezy cDNA w 20 μl systemu reakcji odwrotnej transkrypcji (4 μl buforu 5x, 1 μl mieszanki enzymów RT, 1 μl mieszaniny starterów RT, 10 μl całkowitego RNA i 4 μl ddH2O). Inkubować powyżej układu reakcyjnego w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 5 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie starterów w oparciu o sekwencję docelowych genów ompA, ompC i ompD. Wykonaj odwrotną transkrypcję-PCR przy użyciu zestawu odczynników RT. Składniki reakcji PCR zawierają 2,5 μl 10x buforu reakcyjnego PCR, 1 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM), 1 μl starterów genu docelowego (ompA, ompC lub ompD), 2,5 μl matrycy, 0,5 μl polimerazy DNA Taq i 17,5 μl ddH2O.
	<ol>
		<li>Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 min; 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min przez 25 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zielonego zestawu SYBR RT-PCR w instrumencie RT-PCT w trzech egzemplarzach.
	<ol>
		<li>Użyj następujących składników reakcji PCR: 10 μl 2x buforu SYBR, odpowiednio 0,4 μl startera do przodu i startera wstecznego, 0,4 μl RoxDye II, 2 μL cDNA i 6,8 μl H2O.</li>
		<li>Stosować następujące warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 1 minutę przez jeden cykl; 95 °C przez 5 s, 60 °C przez 34 s przez 40 cykli.</li>
		<li>Znormalizuj wszystkie dane do endogennego genu referencyjnego gyrA. Do kwantyfikacji danych należy użyć metody 2-ΔΔCT 15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Testy wirulencji
<ol>
	<li>Kultura SE50336, 50336ΔmicC i 50336ΔmicC/pmicC w LB średniej do wczesnej fazy stacjonarnej (OD600 z 2-3) w temperaturze 24 °C, zebrać przez odwirowanie i rozcieńczyć do odpowiedniej CFU mL-1 w sterylnym PBS.</li>
	<li>W przypadku zakażeń myszy należy rozcieńczyć wyhodowane szczepy do 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL i 103 CFU/200 μL zawiesin gradientowych. Zakażone grupy pięciu 6-8 tygodniowych myszy Balb/c na szczep przez wstrzyknięcie podskórne. Grupie kontrolnej wstrzyknąć 200 μl soli fizjologicznej.</li>
	<li>W przypadku zakażeń kurcząt rozcieńczyć powyżej trzech szczepów do 107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL i 109 CFU/200 μL zawiesin gradientowych. Zakażone grupy po dwadzieścia 1-dniowych kurcząt na szczep przez wstrzyknięcie podskórne.</li>
	<li>Codziennie monitoruj oznaki choroby i śmierci zwierząt doświadczalnych. Oblicz LD50 (mediana dawki śmiertelnej) 14 dni po zakażeniu, jak opisano wcześniej16. Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych.</li>
	<li>W grupach infekcji należy pobrać serce, wątrobę, śledzionę, płuca i nerki świeżo zmarłych piskląt. Odważyć oddzielnie 0,5 g powyższych tkanek i zmielić je w sterylnej operacji. Rozcieńczać próbki do mielenia stopniowo, rozprowadzać je na płytce LB i hodować przez 8-10 godzin w temperaturze 37 °C. Zanotować ilość szczepów Salmonelli skolonizowanych w tkankach piskląt.</li>
</ol>

<ol><li>Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-mediated+control+in+bacteria%3A+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).</li>
<li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea%3A+who+they+are%2C+what+they+do%2C+and+how+they+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+In+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li>
<li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria%3A+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li>
<li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicC%2C+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li>
<li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li>
<li>Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).</li>
<li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li>
<li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li>
<li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin%2C+OmpD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li>
<li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li>
<li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals%3A+Epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Veterinary+Journal+La+Revue+Veterinaire+Canadienne%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).</li>
<li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Vaccin+Immunother%22%5BJournal%5D)">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li>
<li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li>
<li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li>
<li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).</li>
<li>Hébrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li>
<li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li>
<li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li>
<li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li>
<li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboregulation+in+Escherichia+coli%3A+DsrA+RNA+acts+by+RNA%3ARNA+interactions+at+multiple+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li>
<li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C%2FA-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li>
<li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li>
<li>Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

S. Enteritidis jest ważnym fakultatywnym patogenem wewnątrzkomórkowym, który może zakażać młode kurczaki i wywołuje objawy od zapalenia jelit po infekcję ogólnoustrojową i śmierć17,18. Ponadto S. enteritidis powoduje utajone infekcje u dorosłych kurcząt, a przewlekli nosiciele zanieczyszczają produkty drobiowe, powodując infekcje przenoszone przez żywność u ludzi19. Mechanizm patogenny S. enteritidis pozostaje do...

Niekodujące małe RNA (sRNA) mają długość 40-400 nukleotydów, które zazwyczaj nie kodują białek, ale mogą być transkrybowane niezależnie w chromosomach bakteryjnych1,2,3. Większość sRNA jest kodowana w regionach międzygenowych (IGR) między regionami kodującymi geny i oddziałuje z docelowymi mRNA poprzez działania parowania zasad i reguluje ekspresję docelowych genów na poziomie potranskrypcyjnym4,5. Odgrywają ważną rolę regulacyjną w metabolizmie substancji, syntezie białek błony zewnętrznej, wyczuwaniu kworum i ekspresji genów wirulencji5.
MicC to 109-nukleotydowy mały transkrypt RNA obecny w Escherichia coli i serowar Salmonella enterica Typhimurium, który może regulować ekspresję wielu białek błony zewnętrznej, takich jak OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 i Omp366,7,8,9. MicC reguluje ekspresję OmpC poprzez hamowanie wiązania rybosomów z liderem mRNA ompC in vitro i wymaga chaperonu RNA Hfq do swojej funkcji w Escherichia coli6. W Salmonella Typhimurium MicC wycisza mRNA ompD za pośrednictwem dupleksu RNA ≤12-bp w sekwencji kodującej (kodony 23-26), a następnie destabilizuje endonukleolityczne mRNA7. Ten proces regulacji jest wspomagany przez białko opiekuńcze Hfq10. OmpC jest licznie występującym białkiem błony zewnętrznej, które uważano za ważne w środowiskach, w których stężenia składników odżywczych i toksyn były wysokie, takich jak w jelicie6. Poryna OmpD jest najliczniej występującym białkiem błony zewnętrznej w Salmonella Typhimurium i stanowi około 1% całkowitego białka komórkowego11. OmpD bierze udział w przyleganiu do ludzkich makrofagów i komórek nabłonka jelitowego12. MicC hamuje również ekspresję zarówno porin OmpC, jak i OmpD. Uważa się, że MicC może regulować zjadliwość. Aby zbadać nowe geny docelowe regulowane przez MicC i zbadać funkcję regulacji wirulencji micC, sklonowaliśmy gen micC w szczepie Salmonella Enteritidis (SE) szczep 50336, a następnie skonstruowaliśmy zmutowany 50336ΔmicC i uzupełniony mutant 50336ΔmicC / pmicC. Nowe geny docelowe poddano badaniom przesiewowym za pomocą qRT-PCR. Zjadliwość 50336ΔmicC wykryto u zakażeń myszy i kurczaków.

<table><tbody><tr><td>dekstroza</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610219</td><td>do przygotowania bulionu</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA</td><td>TIANGEN</td><td>DP214</td><td>do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR01A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>10017608</td><td>do przygotowania bulionu</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>20032116</td><td>do przygotowania bulionu</td></tr><tr><td>L-Arabinoza</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610071</td><td>&lambda;-Zestaw</td></tr><tr><td>mini plazmidów</td> do rekombinacji czerwonej <td>Ekstrakcja plazmidu</td><td>TIANGEN</td><td>DP106</td></tr><tr>Odczynnik chemiczny<td>NaCl</td><td>Sinopharm</td><td>10019308</td><td>do przygotowania</td></tr> <tr><td>bulionu(NH4)2SO4</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>10002917</td><td>do przygotowania bulionu</td></tr><tr><td>Zestaw odczynników PrimeScriptRRT z gumką gDNA&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR047</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBRR Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>Ligacja</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Izolacja RNA</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>do przygotowania bulionu</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>do przygotowania bulionu</td></tr><tr><td>wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>wirówka</td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Elektroforeza</td></tr><tr><td>&nbsp; System elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td>do transformacji bakteryjnej</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>BioTek</td><td>Epoch</td><td>Detekcja absorbancji</td></tr><tr><td>System Real-Time PCR</td><td>System Applied Biosystems</td><td>7500</td><td>qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

niekodujący mały rna micc przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w salmonella enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Niekodujące małe RNA (sRNA) to nowy czynnik regulujący ekspresję genów na poziomie posttranskrypcyjnym. Rodzaj sRNA MicC, znany z Escherichia coli i Salmonella Typhimurium, może hamować ekspresję białek błony zewnętrznej. Aby dokładniej zbadać funkcję regulacyjną micC w Salmonella Enteritidis, sklonowaliśmy gen micC w szczepie Salmonella Enteritidis 50336, a następnie skonstruowaliśmy zmutowany 50336ΔmicC za pomocą systemu rekombinacji λ opartego na czerwieni i uzupełnionego mutanta 50336ΔmicC / pmicC przenoszącego rekombinowany plazmid pBR322 eksprymujący micC. Wyniki qRT-PCR wykazały, że transkrypcja ompD w 50336ΔmicC była 1,3-krotnie wyższa niż w szczepie typu dzikiego, podczas gdy transkrypcja ompA i ompC w 50336ΔmicC była 2,2-krotnie i 3-krotnie wyższa niż w szczepie typu dzikiego. Wykazały one, że micC hamuje ekspresję ompA i ompC. W poniższym badaniu patogenność 50336ΔmicC wykryto zarówno u zakażonych 6-tygodniowych myszy Balb/c, jak i 1-dniowych kurczaków. Wynik wykazał, że LD50 szczepu typu dzikiego 50336, mutanty 50336ΔmicC i 50336ΔmicC/pmicC dla 6-tygodniowych myszy Balb/c wynosiły odpowiednio 12,59 CFU, 5,01 CFU i 19,95 CFU. LD50 szczepów dla kurcząt jednodniowych wynosiły odpowiednio 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 108 CFU i 2,54 x 108 CFU. Wykazano, że delecja micC zwiększa zjadliwość S. Enteritidis u myszy i kurczaków poprzez regulację ekspresji białek błony zewnętrznej.

Konstrukcja mutanta 50336&#916;micC or szczep komplementowany 50336&#916;micC /pmicC 
The micC wynik klonowania genu wskazał, że gen ten składał się ze 109 bp i wykazywał 100% identyczności z sekwencją S. Typhimurium. Na podstawie danych sekwencyjnych mutant z delecją 50336&#916;micC oraz mutant komplementowany 50336&#916;micC/pmicC </...

System rekombinacji za pośrednictwem λ-czerwieni został użyty do stworzenia mutanta delecji małego niekodującego RNA micC.

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Protokół ten może być stosowany do inaktywacji genów chromosomowych w celu wyizolowania mutantów do badania funkcji genów i bakterii. Sprawia, że proces rekombinacji homologicznej jest prosty, szybki i wysoce wydajny. Korzystając z tej techniki, geny patogenu związane z wirulencją mogą zostać usunięte w celu uzyskania atenuowanego mutanta, który może być wykorzystany jako kandydat na atenuowaną szczepionkę.Zacznij od amplifikacji kasety chloramfenikolu zawierającej hemologiczne fragmenty genu micC. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu do amplifikacji kasety chloramfenikolu z plazmidu PKD3, w tym 50 rozszerzeń homologii par zasad z pięciu pierwszych i trzech pierwszych końców genu micC. Wykonaj PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, używając plazmidu PKD3 jako matrycy do amplifikacji kasety z chloramfenikolem.Określ wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Następnie należy oczyścić produkt za pomocą zestawu do odzyskiwania żelu DNA i określić stężenie DNA za pomocą spektrofotometrii. Przeprowadź drugą reakcję PCR w celu wyeliminowania interferencji dalszej rekombinacji przez plazmid PKD3.Rozcieńczyć pierwszy produkt PCR w stosunku od 1 do 200 i użyć go jako matrycy dla wtórnego PCR. Aby skonstruować pierwszy rekombinowany szczep 50336 delta micC dot cat, wymieszaj 100 mikrolitrów kompetentnych komórek SE 50336 z pięcioma mikrolitrami plazmidu PKD 46 i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wstrząs termiczny mieszaniny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 90 sekund i szybko przenieś ją z powrotem na lód na dwie minuty, aby przekształcić plazmid w komórki.Przesiewaj dodatnie kolonie, hodując komórki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza na płytce opornej na ampicylinę. Następnego dnia dodać 30 mili więcej L arabinozy do płynnej kultury SE 50336 PKD 46 i wywołać ekspresję rekombinazy przez godzinną inkubację w temperaturze 30 stopni Celsjusza podczas wstrząsania. Wymieszaj 100 nanogramów oczyszczonego produktu PCR i 40 mikrolitrów kompetentnych komórek SE 50336 PKD 46 w kubku na wstrząs elektryczny.Następnie przeprowadź transformację porażenia prądem. Po elektrotransformacji przenieś mieszaninę do jednego mililitra pożywki SOC i inkubatora kultur z wytrząsaniem przy 150 obr./min i 30 stopniach Celsjusza przez godzinę. Rozprowadź mieszaninę na płytce LB odpornej na chloramfenikol i poprowadź kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby przesiać pod kątem dodatnich kolonii.Hoduj dodatnie kolonie w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie przebadaj kolonię pod kątem wrażliwości na ampicylinę i odporności na chloramfenikol w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby uzyskać pierwszy rekombinowany szczep bez PKD 46. Po ekstrakcji genomowego DNA kota 50336 Delta micC dot cat za pomocą PCR i elektroforezy żelowej, galwanizuj 100 nanogramów plazmidu PCP 20 do 40 mikrolitrów 50336 Delta micC dot cat kompetentnych komórek.Przesiewaj transformanty dodatnie zarówno na płytkach odpornych na ampicylinę, jak i chloramfenikol w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Przenieś dodatnie transformanty do nieodpornego płynnego podłoża LB i hoduj je przez noc w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie wyizoluj pojedyncze kolonie na płytce LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wybierz kolonię, która jest wrażliwa zarówno na ampicylinę, jak i chloramfenikol. Ten mutant to mutant delecji micC SE 50336 Delta micC. Sprawdź 50336 Delta micC, wykonując PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.Protokół ten został użyty do skonstruowania mutanta delecji 50336 Delta micC w komplementowanym mutancie 50336 Delta micC, pmicC. Pierwszy rekombinowany kot kropkowy 50336 Delta micC został zwalidowany metodą PCR z oczekiwaną wielkością pasma około 1200 par zasad produktów PCR z insercją chloramfenikolu w porównaniu z 279 parami zasad w szczepie typu dzikiego. W drugiej rekombinacji kaseta chloramfenikolu została wyeliminowana przez PCP 20.Wyniki PCR w połączeniu z sekwencjonowaniem potwierdziły, że izogeniczny mutant micC został pomyślnie skonstruowany. Ekspresję genów ompA, ompC i ompD w szczepach 50336, 50336 Delta micC i 50336 delta micC pmicC analizowano metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Transkrypcja ompA i ompC oraz 50336 delta micC wzrosła około 2,2-krotnie i trzykrotnie w porównaniu ze szczepem typu dzikiego.Podczas gdy transkrypcja ompD wzrosła tylko nieznacznie. Testy LD 50 wykazały, że po zakażeniu sześcio- do ośmiotygodniowych myszy BALB / c każdym z trzech szczepów, większość myszy zakażonych 50336 Delta micC wykazywała znużenie, brak apetytu lub biegunkę 48 godzin po zakażeniu i zmarła po 96 godzinach. Myszy zakażone szczepem typu dzikiego i 50336 delta micC pmicC wykazywały te same objawy 72 godziny po zakażeniu i zmarły po 120 godzinach.LD 50 trzech szczepów wskazały, że zjadliwość zmutowanego 50336 Delta micC wzrosła 2,5-krotnie w porównaniu z typem dzikim. Technika ta pomaga naukowcom badać funkcję genów bakteryjnych i uzyskiwać pożądany zmodyfikowany szczep poprzez usuwanie genów docelowych.

a-non-coding-small-rna-micc-contributes-to-virulence-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

C. elegans pojawił się jako nowy model genetyczny do badania interakcji gospodarz-patogen. Tutaj opisujemy protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium w połączeniu z techniką interferencji dwuniciowego RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą.

Protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających...

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Poznaj metodę usuwania genu micC w Salmonella enteritidis za pomocą systemu rekombinacji λ-Red. Technika ta umożliwia szybkie i efektywne inaktywowanie genów chromosomalnych w badaniach mikrobiologicznych oraz poszukiwanie kandydatów na szczepionki.

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

Przeglądaj więcej filmów