Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

Ogólnym celem tej techniki oczyszczania jest ustalenie metody oczyszczania tkanek mózgu szczura. Protokół ten może być również stosowany w przypadku transgenicznego szczura HIV-1. Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka mózgowa szczura może pozostać nienaruszona do oczyszczenia, co pozwala na pełną analizę na poziomie obwodu.

Procedurę zademonstruje Kristin Kirchner, doktorantka z mojego laboratorium, a także Hailong Li, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Po wykonaniu perfuzji przezsercowej u szczura w wieku od trzech do sześciu tygodni należy usunąć mózg z czaszki za pomocą kleszczy. Następnie umieść go w pozycji strzałkowej i pokrój na cztery równe odcinki o szerokości trzech milimetrów za pomocą żyletki i matrycy mózgu szczura.

Zamocuj każdą sekcję w czterech procentach PFA w szczelnej pięciomililitrowej plastikowej tubie na noc na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia kontynuuj utrwalanie w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyj każdą sekcję trzy razy za pomocą PBS przez około 30 minut na pranie.

Umyte sekcje należy inkubować seryjnie w 20, 40, 60, 80 i 100% roztworze metanolu przez jedną godzinę każda. Powtórz odwodnienie za pomocą 100% metanolu. Następnie schłodź próbki w 100% metanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Przygotować roztwór zawierający 66% DCM i 33% metanolu i inkubować schłodzone sekcje w tym roztworze przez noc w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Następnego dnia przemyć próbkę dwukrotnie metanolem przez 30 minut i schłodzić ją w 100% metanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. W celu wybielania umieść próbkę w świeżym pięcioprocentowym nadtlenku wodoru w metanolu i inkubuj ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po całonocnej inkubacji należy seryjnie inkubować próbkę w 80, 60, 40 i 20% roztworach metanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować próbkę w PBS przez jedną godzinę i przemywać ją dwukrotnie w roztworze, po jednej godzinie na każde mycie. Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra 2,5 mikrolitra jednego procentu biotyny-CTB i powoli wstrzykuj ją w miejsce jądra półleżącego przez 20 sekund.

Pozostawić końcówkę igły na miejscu na jedną minutę i powoli wyjmować ją przez ponad 10 sekund, aby zapobiec wyciekowi. Inkubować próbkę w roztworze trzecim, a następnie w roztworze czwartym przez dwa dni w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj przeciwciało pierwszorzędowe i kontynuuj inkubację przez siedem dni.

Umyj próbkę pięć razy w roztworze drugim przez jedną godzinę na każde mycie i przechowuj ją w roztworze drugim w temperaturze pokojowej przez noc. Inkubować próbkę z przeciwciałem drugorzędowym przez siedem dni w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umyj go pięć razy w roztworze drugim przez godzinę na pranie i przechowuj w roztworze drugim w temperaturze pokojowej przez noc w słabym świetle.

Próbkę inkubować seryjnie w 20, 40, 60, 80 i 100% metanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj go w świeżym 100% metanolu przez noc. Następnego dnia inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 66% DCM w 33% metanolu przez trzy godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.

Po trzech godzinach inkubować próbkę w eterze dibenzylowym, nie wstrząsając, aż stanie się klarowna. Następnie przechowuj go w eterze dibenzylowym do czasu obrazowania. Zdobądź komorę drukarki 3D i przymocuj ją do szkiełka mikroskopowego za pomocą żywicy epoksydowej.

Umieść próbkę w kwadratowej przestrzeni na środku komory i całkowicie wypełnij komorę eterem dibenzylowym. Umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 0.17 milimetra na komorze i dociśnij, aby upewnić się, że jest w pełnym kontakcie ze ściankami komory. Następnie uszczelnij krawędzie za pomocą żywicy epoksydowej.

Upewnij się, że obracasz komorę, aby pęcherzyki powietrza mogły wydostać się z wlotu napełniania. Napełnij komorę dodatkowym eterem dibenzylowym. Następnie uszczelnij wlot wypełnienia żywicą epoksydową i pozwól mu się utwardzić.

Obserwuj preparat za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego, aby wykonać skan z w czterokrotnym powiększeniu. Konfokalny obraz hydrofobicznie oczyszczonej próbki tkanki w czterokrotnym powiększeniu pokazuje gęste zabarwienie TH w obszarze istoty czarnej, rzadkie neurony TH przylegające do istoty czarnej i ciemny obszar tkanki pozbawiony neuronów TH. Typowa morfologia neuronu TH-dodatniego w 20-krotnym powiększeniu ma dużą somę i kilka rozgałęzionych wyrostków.

Natomiast mikroglej barwiony IBA1 ma małe ciała komórkowe i krótsze procesy wydłużania. Idealny obraz konfokalny pokazuje dodatnie i gęste barwienie TH w obszarze istoty czarnej z odpowiednim wzmocnieniem fluorescencji. Przykłady słabych obrazów konfokalnych obejmują nieprawidłowo ostry obraz ze zbyt dużym wzmocnieniem fluorescencyjnym, fałszywie dodatnie barwienie z jasnymi punktami, które nie są ostre z resztą tkanki, oraz wysokie barwienie tła w wyniku użycia surowicy blokującej, która nie pasuje do przeciwciała drugorzędowego.

Dodatnie barwienie CTB w mózgu szczura pokazano tutaj. Długie, cienkie włókna są aferentnymi wypustkami wzdłuż szlaku dopaminergicznego. Kolokalizacja TH i CTB umożliwia wizualizację miejsca iniekcji w obszarze jądra półleżącego, które ma postać gęsto fluorescencyjnego zielonego okręgu.

Kolokalizacja TH i CTB w istocie czarnej jest pokazana tutaj. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest pozostawienie próbce dużo czasu na inkubację we wszystkich roztworach przeciwciał i dużo czasu na pełne oczyszczenie przed obrazowaniem. Próbka powinna mieć ograniczony kontakt z powietrzem, ponieważ spowoduje to jej uszkodzenie.

Technika ta jest bardzo wszechstronna i może być wykorzystana do badania wielu różnych białek będących przedmiotem zainteresowania w różnych regionach mózgu. Obecna technika pomaga utorować drogę neurobiologom do badania mózgu szczura na poziomie obwodu, który jest niezbędny do badania mózgu jako całego systemu.