Name: Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj hydrofobową metodę oczyszczania tkanki mózgowej szczura, która umożliwia wizualizację obwodów neuronalnych przy zachowaniu integralności tkanek. Technika ta pozwala na analizę dopaminergicznych szlaków w modelach F344/N i HIV-1 transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 oraz przez T32 Training Grant 5T32GM081740

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Południowej Karoliny.
1. Przygotowanie roztworu podstawowego
<ol>
	<li>Roztwór 1 (1 l): Do 900 ml dejonizowanegoH2Ododać 100 ml 10x buforowanej soli fizjologicznej (PBS) i 2 ml Triton X-100.</li>
	<li>Roztwór 2 (1 l): Do 900 ml dejonizowanego H2O dodać 100 ml 10 x PBS, 2 ml Tween-20 i 1 ml 10 mg / ml roztworu podstawowego heparyny.</li>
	<li>Roztwór 3 (500 ml): Do 400 ml roztworu 1 dodać 11,5 g glicyny i 100 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Roztwór 4 (50 ml): Do 42 ml roztworu 1 dodać 3 ml odpowiedniej surowicy i 5 ml DMSO.</li>
	<li>Pierwszorzędowy roztwór przeciwciał (50 ml): Do 46 ml roztworu 2 dodać 2,5 ml DMSO i 1,5 ml odpowiedniej surowicy.</li>
	<li>Roztwór przeciwciał drugorzędowych (50 ml): Do 48,5 ml roztworu 2 dodać 1,5 ml odpowiedniej surowicy. 
	UWAGA: W przypadku roztworu 4, roztworu pierwszorzędowego i roztworu drugorzędowego należy użyć surowicy odpowiadającej przeciwciału drugorzędowemu (np. kozie, koniowi, bydłu).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
UWAGA: Wykonaj kroki od 2.1 do 2.7 w dygestoriach, aby ograniczyć narażenie na PFA.
<ol>
	<li>Głęboko znieczulić młodego (3-6 tygodniowego) szczura za pomocą sewofluranu; przejść do 2,2, gdy szczur nie reaguje i nie reaguje na szczypanie palców u nóg i ogona.</li>
	<li>Połóż szczura w pozycji leżącej na plecach i wykonaj nacięcie przez ścianę brzucha za pomocą nożyczek do tęczówki.</li>
	<li>Przetnij dolną część klatki piersiowej do obojczyka po obu stronach klatki piersiowej za pomocą nożyczek Mayo.</li>
	<li>Przymocuj mostek i żebra z dala od serca i płuc za pomocą hemostatu.</li>
	<li>Przekłuć lewą komorę igłą 23 G dołączoną do pompy perfuzyjnej i przeciąć prawy przedsionek nożyczkami do tęczówki.</li>
	<li>Wykonać perfuzję przezsercową z około 75 ml 100 mM (1x) PBS.</li>
	<li>Kontynuować perfuzję przezsercową z około 100 ml 4% paraformaldehydu (PFA) buforowanego w 1x PBS.</li>
	<li>Usuń mózg z czaszki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Umieść mózg w pozycji strzałkowej i pokrój na 4 równe części (około 3 mm szerokości) za pomocą żyletki i matrycy mózgu szczura.</li>
	<li>Utrwal każdą sekcję w 4% PFA w 1x PBS w szczelnie zamkniętej, 5 ml plastikowej tubie przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.</li>
	<li>Kontynuuj utrwalanie w 4% PFA w 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj każdą sekcję 1x PBS w temperaturze RT przez 30 minut, 3 razy.</li>
</ol>
3. Odwodnienie i depigmentacja
<ol>
	<li>Próbkę inkubować w roztworze wody o stężeniu 20% metanolu/80% dejonizowanego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w 40% metanolu/60% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w 60% metanolu/40% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w roztworze wodnym zawierającym 80% metanol/20% roztwór wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 100% metanolu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórzyć z większą ilością 100% metanolu, inkubując przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Schładzać próbkę w 100% metanolu w temperaturze 4 °C przez około 10 minut.</li>
	<li>Przygotować 66% roztwór dichlorometanu (DCM)/33% metanolu.</li>
	<li>Próbkę inkubować przez noc w roztworze DCM/metanolu w temperaturze pokojowej, wstrząsając.</li>
	<li>Myć metanolem w temperaturze pokojowej przez 30 minut, 2 razy.</li>
	<li>Schładzać próbkę w 100% metanolu w temperaturze 4 °C przez około 10 minut.</li>
	<li>Wybielać w schłodzonym, świeżo przygotowanym 5% nadtlenku wodoru w metanolu przez noc w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Próbkę inkubować w roztworze wodnym zawierającym 80% metanol/20% roztwór wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w 60% metanolu/40% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w 40% metanolu/60% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w roztworze wody o stężeniu 20% metanolu/80% dejonizowanego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 1 PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć w roztworze 1 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, 2 razy.</li>
</ol>
4. Etykietowanie podjednostki B toksyny
<ol>
	<li>Wprowadzić końcówkę igły strzykawki o pojemności 1 ml w miejsce jądra półleżącego.</li>
	<li>Powoli wstrzykiwać 2,5 μl 1% biotyny-CTB przez 20 sekund.</li>
	<li>Pozostaw końcówkę igły na miejscu na 1 minutę i powoli usuwaj przez 10 sekund, aby zapobiec wyciekowi.</li>
</ol>
5. Aplikacja przeciwciał
<ol>
	<li>Inkubować próbkę w roztworze 3 przez 2 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Inkubować próbkę w roztworze 4 przez 2 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 7 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Myć w roztworze 2 przez 5 razy, inkubując 1 godzinę na pranie. Przechowywać w roztworze 2 w RT przez noc.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 7 dni w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Myć w roztworze 2 5 razy, inkubując 1 godzinę na pranie; przechowywać w roztworze 2 w temperaturze RT przez noc. 
	UWAGA: Wszystkie kroki od 5.6 wzwyż, w tym końcowe przechowywanie, powinny odbywać się przy słabym oświetleniu. Probówki na próbki mogą być osłonięte folią aluminiową. Stężenia użyte dla przeciwciał w tym protokole wynosiły: TH na 1:100, Iba1 na 1:200 i przeciwciało drugorzędowe na 1:100. Dodaj dodatkowe rozwiązanie 2 do kroków 5.1-5.6, aby upewnić się, że probówki są całkowicie wypełnione.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie tkanek
<ol>
	<li>Próbkę inkubować w roztworze wody o stężeniu 20% metanolu/80% dejonizowanego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w 40% metanolu/60% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w 60% metanolu/40% roztworze wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbkę inkubować w roztworze wodnym zawierającym 80% metanol/20% roztwór wody dejonizowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 100% metanolu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować w świeżym 100% metanolu przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować w 66% DCM/33% metanolu przez 3 godziny, wytrząsając, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować w eterze dibenzylowym (DBE) bez wstrząsania. Pozostawić próbkę w DBE do momentu jej oczyszczenia i przechowywać w DBE do czasu obrazowania.</li>
</ol>
7. Montaż
<ol>
	<li>Zdobądź wydrukowaną w 3D komorę wykonaną z żywicy Visijet M3 Crystal (szablony dostępne na stronie idisco.info).</li>
	<li>Przymocuj komorę do szkiełka mikroskopowego za pomocą żywicy epoksydowej.</li>
	<li>Umieścić próbkę w kwadratowym miejscu na środku komory.</li>
	<li>Całkowicie napełnij komorę DBE.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 0,17 mm na komorze i dociśnij, aż szkiełko nakrywkowe będzie w pełni stykało się ze ściankami komory.</li>
	<li>Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego do komory za pomocą żywicy epoksydowej.</li>
	<li>Obróć komorę, aby pęcherzyki powietrza mogły wydostać się z wlotu napełniania.</li>
	<li>Napełnij komorę dodatkowym DBE.</li>
	<li>Uszczelnij wlot wypełnienia żywicą epoksydową i pozostaw do utwardzenia. 
	UWAGA: Nadmiar DBE wyleje się podczas montażu.</li>
</ol>
8. Obrazowanie
<ol>
	<li>Użyj systemu mikroskopu konfokalnego, aby wykonać skan z przy 4-krotnym powiększeniu (patrz załączony film 3D).</li>
	<li>Osiągnąć wzbudzenie fluorescencyjne próbki za pomocą zestawu laserowego do emisji o długości fali podobnej do długości fali określonej przez przeciwciało wtórne. Wzbudzenie TH osiągnięto przy użyciu zestawu laserowego HeNe, który emitował światło o długości fali 632 nm.</li>
	<li>Ustaw detektor na długość fali zbliżoną do emisji lasera. Dla niniejszego protokołu detektor dla TH został ustawiony na 650 nm.</li>
	<li>Zwiększ wzmocnienie detektora, aż pojawi się widoczny sygnał. Wzmocnienie 650 LP dla obrazów zostało ustawione na 7,50 B.</li>
	<li>Korzystając z opcji Skanuj w oprogramowaniu do obrazowania konfokalnego, przesuwaj stolik mikroskopu, aż próbka zostanie ustawiona na ostrości.</li>
	<li>Poruszaj się po tkance na wszystkich płaszczyznach i uzyskuj pojedyncze obrazy lub obrazy z stosu za pomocą oprogramowania do obrazowania konfokalnego.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania wyjmij próbkę z komory. Umieść go z powrotem w tubie całkowicie wypełnionej DBE i przechowuj w RT w ciemnym miejscu, najlepiej przykrytym folią aluminiową. 
	UWAGA: Próbki można ponownie montować i obrazować, o ile sygnał fluorescencji jest nadal silny.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298(2020).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li>
<li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins%2C+Tat+and+gp120%2C+target+the+developing+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li>
<li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404(2017).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152(2018).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurovirology%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li>
<li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li>
<li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braking+dopamine+systems%3A+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li>
<li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).</li>
<li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li>
<li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy%3A+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13(2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Oczyszczanie tkanek stanowi rozwiązanie dla ograniczeń tradycyjnego protokołu IHC. Próbka, która jest przezroczysta, minimalizuje rozpraszanie i absorpcję światła, co zapewnia optyczny dostęp na poziomie komórkowym do nienaruszonych tkanek18,19. Techniki oczyszczania tkanek sprawiają, że tkanka staje się przezroczysta poprzez delipidację, odbarwianie i odwapnianie za pomocą rozpuszczalników. Gdy współczynnik załamania światła próbki tkanki dopasuje się do współcz...

Kilka technik oczyszczania tkanek zostało zatwierdzonych do użytku w mózgu: hydrożelowe, hydrofilowe i hydrofobowe. Techniki te mają na celu przekształcenie tkanki w przezroczystą poprzez delipidację, odbarwianie i odwapnianie poprzez podawanie rozpuszczalników. Gdy współczynnik załamania światła próbki tkanki dopasuje się do współczynnika załamania światła wybranego ośrodka obrazowania, można uzyskać wyraźny obraz próbki. Techniki oparte na hydrożelu, takie jak CLARITY, zabezpieczają biomolekuły w tkance poprzez powiązanie ich z hydrożelami na bazie akrylu, co zapobiega uszkodzeniom strukturalnym i utracie białek1. Jednak techniki hydrożelowe wykorzystują ostre chemikalia, które mogą uszkodzić bardziej delikatne tkanki, a gęstsze próbki tkanek mogą nie być kompatybilne z protokołem hydrożelowym. Niektóre techniki hydrożelowe mogą wymagać drogiego sprzętu lub prowadzić do rozszerzania się tkanek. Techniki hydrofilowe, takie jak CUBIC, zachowują strukturę 3D poprzez tworzenie wiązań wodorowych w obrębie tkanki2. Rozszerzanie tkanek może również wystąpić w niektórych protokołach hydrofilowych. Zdolność oczyszczania technik hydrofilowych często nie odpowiada zdolności, jaką mają techniki hydrofobowe, co jest ważne dla gęstszych i grubszych tkanek3.
Techniki hydrofobowe są zazwyczaj szybkie, nie wymagają specjalnego sprzętu i wytwarzają próbkę, która jest łatwa do obsługi i przechowywania. iDISCO to technika hydrofobowa, która eliminuje skurcz, który może wystąpić w innych protokołach hydrofobowych. Pierwotnie, technika oczyszczania tkanek iDISCO została opisana przez Renier et al.4 dla zarodków i gęstych, dorosłych narządów myszy. Technika ta usuwa wodę z tkanki na początkowym etapie odwodnienia, zmniejszając w ten sposób rozproszenie światła. Tkanka jest przepuszczalna podczas wstępnego leczenia, aby umożliwić głęboką penetrację przeciwciał. Barwniki fluorowe Alexa w widmie dalekiej czerwieni są używane do znakowania immunologicznego, aby uniknąć autofluorescencji tkanki na niższych długościach fal5. Tkanki, które przeszły hydrofobowe protokoły oczyszczania, mogą być łatwo obsługiwane i mogą być obrazowane kilka razy ze względu na długowieczność barwników Alexa Fluor. Prawidłowo przechowywane tkanki mogą dostarczać obrazy przez miesiące do roku po wstępnym przetworzeniu.
W obecnym protokole, przeciwciało przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH), przeciwciało Iba1 i podjednostka B toksyny (CTB) były stosowane zarówno na męskich, jak i żeńskich mózgach szczurów transgenicznych (Tg) i transgenicznych HIV-1. Szczur HIV-1 Tg posiada siedem z dziewięciu genów, które składają się na genom wirusa HIV-1, co prowadzi do niezakaźnego modelu długotrwałej ekspozycji na białko HIV-16,7,8. Zmiany dopaminergiczne zostały wcześniej wykazane u szczura HIV-1 Tg, a sam HIV-1 jest chorobą zapalną, więc wybór przeciwciał był istotny dla projektu eksperymentalnego9,10,11,12. CTB jest znacznikiem, który przyłącza się do neuronów poprzez wiązanie gangliozydowe i może być używany do śledzenia projekcji aferentnych w mózgu. CTB był wcześniej używany do badania projekcji od jądra półleżącego do obszaru istoty czarnej, dwóch obszarów mózgu silnie zaangażowanych w szlaki dopaminergiczne13,14,15.
W tym protokole, TH będzie służył jako marker do produkcji dopaminy, a Iba1 będzie oznaczał aktywowany mikroglej. Stosowane selektywnie przeciwciało TH znakuje pojedyncze prążki o stężeniu około 62 kDa, które odpowiada hydroksylazie tyrozyny. Przeciwciało Iba1 odpowiada sekwencji karboksylowo-końcowej Iba1. Oba przeciwciała wyhodowano u królików i były poliklonalne. CTB będzie używany do wstecznego śledzenia neuronów od obszaru jądra półleżącego do obszaru istoty czarnej. Obecny protokół zawiera również wytyczne dotyczące dostosowania oryginalnego protokołu iDISCO na dwa różne sposoby: 1) ogólna redukcja barwienia tła poprzez zmianę odczynników surowicy w etapach blokowania oraz 2) skalowanie czasu inkubacji, aby był odpowiedni dla większych próbek tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół dostarcza ciągłych dowodów na to, że hydrofobowe techniki oczyszczania są wykonalne w tkankach mózgowych szczura, nie mają dostrzegalnych szkodliwych interakcji z białkami wirusa HIV-1 i są kompatybilne z przeciwciałami TH, przeciwciałami Iba1 i CTB.

<table><tbody><tr><td>Podjednostka B toksyny (rekombinowana), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królik Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe Iba1</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epoksyd</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do perfuzji</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pompa o zmiennym przepływie</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH przeciwciało pierwotne</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bioresole</td> <td>FisherZobacz materiał BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrofobowe metody oczyszczania tkanek to łatwe do dostosowania, szybkie i tanie procedury, które pozwalają na badanie interesującej cząsteczki w niezmienionych próbkach tkanek. Tradycyjne procedury znakowania immunologicznego wymagają pocięcia próbki na cienkie sekcje, co ogranicza możliwość znakowania i badania nienaruszonych struktur. Jeśli jednak tkanka mózgowa może pozostać nienaruszona podczas przetwarzania, struktury i obwody mogą pozostać nienaruszone do analizy. Wcześniej ustalone metody oczyszczania zajmują dużo czasu, aby całkowicie oczyścić tkankę, a ostre chemikalia często mogą uszkodzić wrażliwe przeciwciała. Metoda iDISCO szybko i całkowicie oczyszcza tkankę, jest kompatybilna z wieloma przeciwciałami i nie wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego. Technika ta została początkowo zwalidowana do stosowania w tkankach myszy, ale obecny protokół dostosowuje tę metodę do obrazowania półkul kontrolnych i transgenicznych mózgów szczurów. Oprócz tego obecny protokół wprowadza również kilka poprawek do istniejącego wcześniej protokołu, aby zapewnić wyraźniejsze obrazy z mniejszą ilością plam tła. Przeciwciała przeciwko Iba-1 i hydroksylazie tyrozynowej zwalidowano u transgenicznego szczura HIV-1 i u szczurów kontrolnych F344/N przy użyciu obecnej metody hydrofobowego oczyszczania tkanek. Mózg jest splecioną siecią, w której struktury częściej współpracują ze sobą niż oddzielnie od siebie. Analiza mózgu jako całego systemu, w przeciwieństwie do kombinacji pojedynczych części, jest największą korzyścią płynącą z tej całej metody oczyszczania mózgu.

Pełne przejrzyszenie dużych sekcji tkanki mózgowej szczurów zarówno linii F344/N, jak i zainfekowanych HIV-1, zostało osiągnięte przy użyciu tego zmodyfikowanego protokołu hydrofobowego przejrzyszania tkanek. Rysunek 1 przedstawia typowy obraz konfokalny dla TH w obszarze substancji czarnej. Rysunek 1A przedstawia gęste, pozytywne barwienie. Takie gęste obszary można przeanalizować, wykonując skanowanie w płaszczyźnie „Z”, aby potwierdzić pozytywne barwienie i p...

Tutaj prezentujemy hydrofobową metodę oczyszczania tkanek, która pozwala na oglądanie docelowych cząsteczek jako części nienaruszonych struktur mózgu. Technika ta została teraz zwalidowana dla kontroli F344/N i transgenicznych szczurów HIV-1 obu płci.

Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Ogólnym celem tej techniki oczyszczania jest ustalenie metody oczyszczania tkanek mózgu szczura. Protokół ten może być również stosowany w przypadku transgenicznego szczura HIV-1. Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka mózgowa szczura może pozostać nienaruszona do oczyszczenia, co pozwala na pełną analizę na poziomie obwodu.Procedurę zademonstruje Kristin Kirchner, doktorantka z mojego laboratorium, a także Hailong Li, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Po wykonaniu perfuzji przezsercowej u szczura w wieku od trzech do sześciu tygodni należy usunąć mózg z czaszki za pomocą kleszczy. Następnie umieść go w pozycji strzałkowej i pokrój na cztery równe odcinki o szerokości trzech milimetrów za pomocą żyletki i matrycy mózgu szczura.Zamocuj każdą sekcję w czterech procentach PFA w szczelnej pięciomililitrowej plastikowej tubie na noc na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia kontynuuj utrwalanie w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyj każdą sekcję trzy razy za pomocą PBS przez około 30 minut na pranie.Umyte sekcje należy inkubować seryjnie w 20, 40, 60, 80 i 100% roztworze metanolu przez jedną godzinę każda. Powtórz odwodnienie za pomocą 100% metanolu. Następnie schłodź próbki w 100% metanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Przygotować roztwór zawierający 66% DCM i 33% metanolu i inkubować schłodzone sekcje w tym roztworze przez noc w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Następnego dnia przemyć próbkę dwukrotnie metanolem przez 30 minut i schłodzić ją w 100% metanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. W celu wybielania umieść próbkę w świeżym pięcioprocentowym nadtlenku wodoru w metanolu i inkubuj ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po całonocnej inkubacji należy seryjnie inkubować próbkę w 80, 60, 40 i 20% roztworach metanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować próbkę w PBS przez jedną godzinę i przemywać ją dwukrotnie w roztworze, po jednej godzinie na każde mycie. Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra 2,5 mikrolitra jednego procentu biotyny-CTB i powoli wstrzykuj ją w miejsce jądra półleżącego przez 20 sekund.Pozostawić końcówkę igły na miejscu na jedną minutę i powoli wyjmować ją przez ponad 10 sekund, aby zapobiec wyciekowi. Inkubować próbkę w roztworze trzecim, a następnie w roztworze czwartym przez dwa dni w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj przeciwciało pierwszorzędowe i kontynuuj inkubację przez siedem dni.Umyj próbkę pięć razy w roztworze drugim przez jedną godzinę na każde mycie i przechowuj ją w roztworze drugim w temperaturze pokojowej przez noc. Inkubować próbkę z przeciwciałem drugorzędowym przez siedem dni w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umyj go pięć razy w roztworze drugim przez godzinę na pranie i przechowuj w roztworze drugim w temperaturze pokojowej przez noc w słabym świetle.Próbkę inkubować seryjnie w 20, 40, 60, 80 i 100% metanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj go w świeżym 100% metanolu przez noc. Następnego dnia inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 66% DCM w 33% metanolu przez trzy godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.Po trzech godzinach inkubować próbkę w eterze dibenzylowym, nie wstrząsając, aż stanie się klarowna. Następnie przechowuj go w eterze dibenzylowym do czasu obrazowania. Zdobądź komorę drukarki 3D i przymocuj ją do szkiełka mikroskopowego za pomocą żywicy epoksydowej.Umieść próbkę w kwadratowej przestrzeni na środku komory i całkowicie wypełnij komorę eterem dibenzylowym. Umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 0.17 milimetra na komorze i dociśnij, aby upewnić się, że jest w pełnym kontakcie ze ściankami komory. Następnie uszczelnij krawędzie za pomocą żywicy epoksydowej.Upewnij się, że obracasz komorę, aby pęcherzyki powietrza mogły wydostać się z wlotu napełniania. Napełnij komorę dodatkowym eterem dibenzylowym. Następnie uszczelnij wlot wypełnienia żywicą epoksydową i pozwól mu się utwardzić.Obserwuj preparat za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego, aby wykonać skan z w czterokrotnym powiększeniu. Konfokalny obraz hydrofobicznie oczyszczonej próbki tkanki w czterokrotnym powiększeniu pokazuje gęste zabarwienie TH w obszarze istoty czarnej, rzadkie neurony TH przylegające do istoty czarnej i ciemny obszar tkanki pozbawiony neuronów TH. Typowa morfologia neuronu TH-dodatniego w 20-krotnym powiększeniu ma dużą somę i kilka rozgałęzionych wyrostków.Natomiast mikroglej barwiony IBA1 ma małe ciała komórkowe i krótsze procesy wydłużania. Idealny obraz konfokalny pokazuje dodatnie i gęste barwienie TH w obszarze istoty czarnej z odpowiednim wzmocnieniem fluorescencji. Przykłady słabych obrazów konfokalnych obejmują nieprawidłowo ostry obraz ze zbyt dużym wzmocnieniem fluorescencyjnym, fałszywie dodatnie barwienie z jasnymi punktami, które nie są ostre z resztą tkanki, oraz wysokie barwienie tła w wyniku użycia surowicy blokującej, która nie pasuje do przeciwciała drugorzędowego.Dodatnie barwienie CTB w mózgu szczura pokazano tutaj. Długie, cienkie włókna są aferentnymi wypustkami wzdłuż szlaku dopaminergicznego. Kolokalizacja TH i CTB umożliwia wizualizację miejsca iniekcji w obszarze jądra półleżącego, które ma postać gęsto fluorescencyjnego zielonego okręgu.Kolokalizacja TH i CTB w istocie czarnej jest pokazana tutaj. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest pozostawienie próbce dużo czasu na inkubację we wszystkich roztworach przeciwciał i dużo czasu na pełne oczyszczenie przed obrazowaniem. Próbka powinna mieć ograniczony kontakt z powietrzem, ponieważ spowoduje to jej uszkodzenie.Technika ta jest bardzo wszechstronna i może być wykorzystana do badania wielu różnych białek będących przedmiotem zainteresowania w różnych regionach mózgu. Obecna technika pomaga utorować drogę neurobiologom do badania mózgu szczura na poziomie obwodu, który jest niezbędny do badania mózgu jako całego systemu.

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje procedurę barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylo-2H-tetrazolu w celu wizualizacji wycinków tkanki mózgowej szczura i rozróżnienia żywotnych i uszkodzonych tkanek po zamknięciu i reperfuzji tętnicy środkowej mózgu.

Barwienie TTC wycinków tkanki mózgowej szczura: procedura barwienia mająca na celu rozróżnienie żywotnej i martwiczej tkanki w wycinkach tkanek po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym

Ten film pokazuje proces izolowania mikronaczyń mózgowych od szczurów poddanych eutanazji. Obejmuje preparację mózgu, oczyszczanie tkanki i trawienie mechaniczne, a następnie wielokrotne wirowanie w celu wyizolowania czystej frakcji mikronaczyń.

Metoda izolacji jednostek nerwowo-naczyniowych z mózgu szczura

Źródło: Kirchner, K.N.,  i wsp., Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki dla tkanki mózgowej szczura. J. Vis. Exp. (2020). Ten film pokazuje metodę hydrofobowego oczyszczania tkanki z próbki tkanki mózgowej szczura. Próbka jest sekwencyjnie odwadniana w metanolu, traktowana mieszaniną dichlorometanu i metanolu w celu rozpuszczenia lipidów i pigmentów, a następnie przenoszona do eteru dibenzylowego w celu całkowitego oczyszczenia tkanek, co umożliwia szczegółowe obrazowanie bez cienkiego cięcia.

Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki dla próbki tkanki mózgowej szczura

Obustronna niedrożność tętnicy szyjnej w połączeniu z niedociśnieniem ogólnoustrojowym powoduje globalne niedokrwienie mózgu u szczura, powodując uszkodzenie hipokampa z powtarzalnym nasileniem. Zwierzęta są upośledzone z przewidywalnymi wzorcami uszkodzeń mózgu, szybko wracają do zdrowia, a wskaźniki śmiertelności są stosunkowo niskie.

Okluzja / niedociśnienie 2-naczyniowe: szczurzy model globalnego niedokrwienia mózgu

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Przedstawiono protokół sublimacji matrycy DAN na tkankę mózgową szczura w celu wykrycia gangliozydów za pomocą spektrometrii mas obrazowania MALDI.

Sublimacja matrycy DAN do wykrywania i wizualizacji gangliozydów w tkance mózgowej szczura do obrazowania MALDI Spektrometria mas

Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

Przedstawiamy protokół do stworzenia modelu masywnego krwotoku pontine u szczura poprzez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej.

Masywny krwotok mostowy przez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

To badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania oczyszczonych próbek całego mózgu i rdzenia kręgowego z zachowanymi sygnałami fluorescencyjnymi, zwiększając wydajność eksperymentu i integralność danych w celu przyspieszenia badań neurobiologicznych.

Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego

Poznaj hydrofobową metodę oczyszczania tkanki mózgowej szczura, która umożliwia wizualizację obwodów neuronalnych przy zachowaniu integralności tkanek. Technika ta pozwala na analizę dopaminergicznych szlaków w modelach F344/N i HIV-1 transgenicznych.

Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

Przeglądaj więcej filmów